Name: Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: חקור מנגנונים תאיים של התחדשות שתלים בדרכי הנשימה המהונדסים מרקמה בעכברים. שיטה זו משתמשת בתאי מח עצם מונונוקלאריים להערכת השתלבות השתל וטיפול בפגמי דרכי נשימה ארוכים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית.
1. לגרדום הייצור
<ol><li>להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ברגע מקורר, לשלב את הפתרונות כדי ליצור תערובת פולימר הסופי של חיית המחמד, פו (20:80).</li>
	<li>Electrospin הפתרון PET+ פו על גבי מוט פלדה אל חלד (1 מ"מ קוטר), ניצול מחט קצה קהה 20 גרם על מזרק 60 מ ל מלא הפתרון PET:PU באמצעות ערכה אספקת החשמל של DC מתח גבוה כדי +14 kV המחט, עוד כוח DC מתח גבוה לספק מוגדר כ-3 kV , קצב זרימה מ ל/h, ובמרחק עצה-אל-המצע 20 ס מ. לסובב את המוט ב 350 סל"ד במהלך התצהיר סיבים.</li>
	<li>המשך electrospinning עד עובי קיר לגרדום הרצוי מיקרומטר 300 מושגת. שקופית לגרדום את המוט, ולאחר מכן להחזיק אותו מתחת ואקום למשך הלילה כדי להסיר כל הממס שיורית.</li>
	<li>לחטא לגרדום באמצעות של מינון אור אולטרה סגול של mJ/ס מ 3502 לפני ההשתלה.</li>
</ol>2. מח עצם-Derived תא תאי (מוניטור-MNC) קציר
<ol><li>המתת חסד של 6-8 שבועות העכבר הישן, נקבה, C57BL/6 עם קוקטייל של קטאמין (200 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (10 מ"ג/ק"ג). בדוק המתת חסד מוחלט בשיטה הזנב-קורט. הקפד לעקוב אחר הנחיות מקומיות המתת חסד.</li>
	<li>תחת תנאים סטריליים, מסירים את העור של עצמות הירך ושל tibias לחשוף את העצם באמצעות מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. השתמש דומונט #5 מלקחיים מלקחיים דומונט #5/45 כדי להסיר את הגידים fascia. להפריד בין העצמות וחותכים כל אחד מהם על שני הקצוות. באמצעות מזרק 5 מ ל ו מחט 25 גרם, לרוקן את מח העצם בצלוחית המכילה 30 מ של מדיה המכון ממוריאל פארק Rosewell (RPMI). לסנן את RPMI עם מח עצם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ניילון לתוך צינור 50 מ.</li>
	<li>במקום ארון אבטחה, 5 מ של diatrizoate polysurcrose ו נתרן בצינור 15 מ"ל. להוסיף בעדינות את RPMI המכיל תאים תאי מח העצם בצד של הצינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות. צנטריפוגה ב x 461 g למשך 30 דקות עם "בלם 1" ב- 24 מעלות צלזיוס. הערה: על שלנו צנטריפוגה, בלם 1 עומד על פרק הזמן הארוך ביותר להפעיל את משך זמן ההאטה.</li>
	<li>ללא שלושת השכבות נוצרו, למחוק את השכבה העליונה (ורוד) של פלסמה ולאסוף את השכבה האמצעית (ברור) המורכב של תאי תאי מח העצם. למחוק את התמיסה של כדוריות דם אדומות.</li>
	<li>לדלל התאים תאי מח העצם (מוניטור-MNC) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) יחס 1:1, צנטריפוגה ב 461 x g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם 5 מ של PBS. צנטריפוגה ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם ~ 10 מ"ל של RPMI.</li>
	<li>לדלל 10 µL של הפתרון BM-MNC עם אמצעי אחסון שווה של 0.4% trypan blue צינור 1 מ"ל. מקום 10 µL של הפתרון בתא ספירה קאמרית שקופית. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. חזור על השלב ולחשב את המספר הממוצע של תאים. הערה: ספירת התאים הממוצע של עונה 1 פרק 108 תאים הושג משימוש של שני עכברים התורם. . זה יהיה שווה ערך ל שתי עצמות הירך, שני tibias אשר עצם מח מנותקת.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון BM-MNC ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, לדלל את ריכוז תא 107 תאים/שתל. הערה: יש למד זריעה יעילות בין 1, 10, 100 מיליון תאים ואנו נמצאו 10 מיליון תאים לכל שתל התשואות זריעה היעילות הגבוהה ביותר.</li>
</ol>3. תא זריעה על השתלים
<ol><li>למדוד את האורך של פיגומים, במידת הצורך, לחתוך אותם לאורך של 5 מ מ.</li>
	<li>טרום רטוב לגרדום עם 5 µL של RPMI עבור 5 דק. להסיר RPMI.</li>
	<li>להוסיף 5 µL של הפתרון BM-MNC לומן של לגרדום במשך 10 דקות.</li>
	<li>לעבור מחט 21G דרך לומן של השתל, דגירה השתל ב 1000 µL של RPMI בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.</li>
</ol>4. להשתיל השרשה
הערה: להקפיד לשמור על הטכניקה aseptic במהלך ההליך השרשה שתל.
<ol><li>שימוש עכברים C57BL/6 נקבות 6-8-בת שבוע הנמענים עבור השתלים תא נזרע. להזריק enrofloxacin (10 מ"ג/ק"ג) subcutaneously 24 שעות לפני הניתוח, קצת לפני החיתוך.</li>
	<li>שוקל את העכבר ולפקח מנה 0.1 מ"ל/10 גרם של הקוקטייל הרדמה קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) כמו שיכוך כאבים intraperitoneally.</li>
	<li>בדוק אם המטוס של הרדמה הושג בזכות שיטת הזנב-קורט. על המאשרת את הרמה של הרגעה, להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים ולגזור את השיער באתר כירורגית של הסנטר הכסל. במקום החיה על כרית במצב שכיבה הגבי. לחטא באתר כירורגית באמצעות קודם פנקס ההכנה povidone יוד, ואחריו כרית ההכנה אלכוהול (70% אלכוהול), ולא פעם נוספת משטח ההכנה povidone יוד.</li>
	<li>מקם את החיה תחת המיקרוסקופ ויבתר עם הראש שלה מן המנתח. עושים חתך קו האמצע החל את עצם הבריח עצם הלשון בעזרת מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. נקה fascia דומונט #5, מלקחיים בסדר דומונט #7, יחד עם ספוגית כותנה סטרילי אם צריך, הוספת מפסק קוליברי שהגנו עצמית.</li>
	<li>פתח את השרירים רצועה (איור 3א') עם מלקחיים בסדר דומונט #5 ו- 7 # דומונט לחשוף סחוס התריס, הסחוס הטבעתי, קנה הנשימה. בלשון בוטה להפריד את קנה הנשימה העצבים בגרון חוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדדיו, ואחריה ההפרדה במבניו של חוליות הצוואר הוושט (איור 3ב).</li>
	<li>באמצעות המחט 20 גרם סמן כירורגי, מכתים את החלק הקדמי של קנה הנשימה.</li>
	<li>לזהות את קנה הנשימה בחתך מתחת הצלצול השלישי. הסחוס בקנה הנשימה, transect קנה הנשימה באמצעות מספריים האביב Vannas-Tubingen וזוג מלקחיים בסדר דומונט #7. מחזיק את זה עם המלקחיים מעוקל בסדר, לאבטח קנה הנשימה דיסטלי לעצם החזה באמצעות סטרילי 9-0 תפר ניילון כדי ליצור מיכשור וציוד זמניים (איור 3C). הערה: חומר תפרים אלטרנטיביים שיכולים לשמש היא PDS 9-0 עבור reapproximation השרשה ושרירים בקנה הנשימה.</li>
	<li>עם מחט 20 גרם, סמן כירורגי, כתם השתל לייצג את החלק הקדמי.</li>
	<li>להשתיל את השתל הוספת צינתור-האחורי, צינתור-צדדי, התפרים proximal הקדמי, הסדר הזה באמצעות תפר ניילון סטרילי 9-0 (איור 3ד'), דומונט #7 עדינים מלקחיים בעל מחט.</li>
	<li>פונים בעלי חיים ליד ב 180 מעלות כדי למקם את הזנב שלו מן המנתח. שחרר את זמני מיכשור וציוד. קנה הנשימה דיסטלי שהיישום transected כדי להתיר את השימוש של המקטע resected כמו גזע עבור הכחשה. כאשר אין בה צורך, קטע קנה הנשימה של 5 מ מ מוסר לחלוטין.</li>
	<li>להשלים את ההשקה דיסטלי על-ידי הצבת התפרים בצורה דומה כמו ההשקה הפרוקסימלית.</li>
	<li>להעריך מחדש את מיקום השתל והשרירים רצועה. סגור את החתך בעזרת תפרים ניילון סטרילי 9-0 בתבנית פועל.</li>
	<li>מזריקים 0.1 מ"ל של הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously ומניחים את החיה בתוך כלוב ההתאוששות מונחת כרית החימום ללא בעלי חיים אחרים בתוך הכלוב.</li>
	<li>להתבונן על העכבר עד שזה המודעים והבלתי מודעים, היכולת ambulate, ולאחר מכן העבר את העכבר לכלוב חדש עם מצעים רכים, צ'או לחות ומים תרופות (איבופרופן, 30 מ"ג/ק"ג) במשך 48 שעות. לאחר פרק זמן זה, להחזיר את העכבר כלוב רגיל עם עכברים אחרים. הערה: עכברים לשמור על מצוקה נשימתית או ירד פעילות לאחר ההשתלה הם נצפו על ידי צוות המעבדה ו/או בעלי חיים בחממה 32 מעלות צלזיוס. אם זה נמשך יותר מ 48 שעות, ואז העכברים צריך להיות מורדמים.</li>
</ol>5. היסטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה
הערה: כתמים Hematoxylin ואאוזין בוצעו באמצעות טכניקה סטנדרטית על-ידי הליבה מורפולוגיה של בית החולים לילדים ארצית. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על פי להלן השלבים.
<ol><li>Deparaffinize השקופיות באמצעות 1) קסילן במשך 5 דקות, קסילן 2) במשך 5 דקות, 3) 100% אתנול 5 דקות, 4) 90% אתנול במשך 5 דקות, 5) 70% אתנול ' מזערי ' 5, 6) מזוקקים H2O (dH2O) במשך 5 דקות.</li>
	<li>להטביע את השקופיות במאגר ציטראט ומניחים בסיר לחץ מלא מים. חום במשך 10 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף עם אלבומין שור 0.1% ב- PBS (BSA-PBS) עבור 5 דק שטיפה עם dH2O. הערה: חימום יכול להעשות גם עם אמבט מים חמים או במיקרוגל למשך 15 דקות.</li>
	<li>דגירה של השקופיות עם סרום עז רגיל 3% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר. תשטוף עם 0.1% BSA-PBS עבור 5 דק דגירה של נוגדן ראשוני עם ריכוזים של קרטין 5 קרטין 14 (1:250)6 (1:1000)6, ו- F4/80 (1: 100)7 עבור 18 h בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף. דגירה עם נוגדן המשני המתאים-ריכוז שבערך K5/K14, 1:300 F4/80 לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף.</li>
	<li>הר באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenolindole (דאפי) המכיל הרכבה מדיה וזכוכית שער גולשת. אפשר לשבת במשך 30 דקות לפני הדמיה.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
<li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li>
<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על מנת להבין את המנגנונים תאית ומולקולרית משפיע עליהם.
שהראתי כאן הנוכחות של תאי אפיתל (איור 4), כמו גם את היכולת של המודל מסכם את הדברים שתל היצרות (<stro...

פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס"מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.
שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,-2,-3. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis4. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.
כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות5. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.
חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה1,2,3 ,5. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.
בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).

<table><tbody><tr><td>0.9% הזרקת נתרן כלורי</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>10 סמ"ק פיפט סרולוגי</td><td>פלקון</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם 1.5 אינץ'. מחט</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25 סמ"ק פיפט סרולוגי</td><td>פלקון</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 אינץ'. מחט</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 סמ"ק</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Baytril (enrofloxacin)</td><td>Bayer Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/ 6, מעבדות</td><td>ג'קסון</td> נקבה <td>664</td><td>6-8 שבועות</td></tr><tr><td>ציטראט מאגר pH 6.0 20x תרכיז</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retractors</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>פישר מדעי</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>ציטוקרטין 14 נוגדן חד שבטי</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 מלקחיים</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - מלקחיים עדינים</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 נוגדן נגד עכבר עכברוש</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים - חד-קהה</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי פרימיום של Fisherbrand</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield הרכבה מדיה עם DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי עכבר IgG נוגדן משני Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי ארנב IgG נוגדן משני Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי חולדה IgG משני נוגדן Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>איבופרופן</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>רפידות הכנה ליוד</td> חד <td>פעמי מקצועי בינלאומי, בע"מ</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי קרטין 5, מטוהר</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת קטמין הידרוכלוריד</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-אדסון</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>ספוגים לא ארוגים</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>משחה</td><td>אופטלמית Dechra מוצרים וטרינריים</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (פוליאתילן טרפתלט & פוליאוריטן) פיגומים</td><td>פתרונות ננו-סיבים</td><td></td><td>בהזמנה אישית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט TISH / מלקחיים</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>גוזם</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T &uuml; מספריים אביב bingen</td><td>FST</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>מחזור מים חמים</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה סטרילית קסילזין</td><td>Akorn בריאות בעלי חיים</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.

איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6.
איור 2 הוא סקירה של לגרדום PET:PU TETG תהליך הייצור. פתרון PET:PU היה electrospun על גבי מחט בוטה 20 גרם כדי להשיג את עובי הקיר TETG הסופי של 300 ...

היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

יישומים קליניים של קנה הנשימה מהונדס רקמות הוגבלו עקב התעצמות השתל אפיתליזציה מאוחרת. מודל עכבר של החלפת קנה דרך אורתוטופית מאפשר את חקר המנגנונים התאיים המניעים התחדשות. פגמים ארוכים של דרכי הנשימה יכולים לעלות על מה הטיפולים הנוכחיים מסוגלים לרפא.קנה הנשימה מהונדס רקמות מציע את הפוטנציאל ליצור איבר חלופי עבור תנאים אלה. מודל זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים עם תכונות מעקב מהומן שושלת. לאחר מכן אנו יכולים לווסת את הגורמים המארחים התורמים להתחדשות השתלים.אחד האתגרים המרכזיים בהפקת הפיגומים יהיה מדידה וקביעה כי הפרמטרים electrospinning זהים בכל פעם. אז בכל פעם שאתה מייצר פיגום, אתה צריך למדוד את המרחק קצה לאספן, הלחות, ואת הטמפרטורה כדי להבטיח את הפיגומים זהים בכל פעם. קריטי להצלחת מודל זה הוא עידון של טכניקות מיקרוכירורגיות ותחזוקה של המישור הנכון של הרדמה כדי לאפשר אוורור ספונטני לאורך כל ההליך.מאז קנה הנשימה המארח יש קוטר פנימי של סביב מילימטר אחד, השתל טיפול ברקמות ילידים מיקום תפר חשובים והוכח בצורה הטובה ביותר חזותית. התחל על ידי המסת שמונה אחוזי משקל פוליאתילן טרפתאלאט, או PET, ב hexafluoroisopropanol וחימום הפתרון וכתוצאה מכך 60 מעלות צלזיוס. בעוד הפתרון הוא להיות מחומם, להמיס שלושה משקל אחוז פוליאוריטן, או PU, ב hexafluoroisopropanol, שילוב הפתרונות לאחר פתרון PET התקרר.לטעון מזרק 60 מיליליטר מצויד מחט 20-קצה קהה עם תערובת פולימר. השתמש במזרק ובספק כוח DC במתח גבוה מוגדרים ל-14 קילו-וולטים חיוביים על המחט, עוד ספק כוח DC במתח גבוה שנקבע למינוס שלושה קילו-וולט, קצב זרימה של חמישה מיליליטר לשעה ומרחק של 20 ס"מ מטיפ למצע כדי להפוך את הפולימר לאלקטרוספין למוט נירוסטה בקוטר של מילימטר אחד. המשך electrospinning עד עובי קיר פיגום 300 מיקרומטר מושגת.לאחר מכן, להחליק את הפיגום מהמוט, למקם את הפיגום תחת ואקום לילה כדי להסיר כל ממס שיורית, ולעקר את הפיגום עם מינון אור אולטרה סגול של 350 millijoules לסנטימטר בריבוע במשך כ 15 דקות. בתנאים סטריליים, הסר את העור מהגפיים האחוריות של עכבר בן שישה עד שמונה שבועות, נקבה, C57-Black/6 עם מספריים עדין ומלקחיים מיקרו-אדסון, ולהשתמש מלקחיים מספר דומונט מספר חמש ודומונט מספר 5/45 מלקחיים כדי להסיר את fascia ואת הגידים. להפריד את העצמות כדי לאפשר לכל אחד מהם להיחתך בשני הקצוות, ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 25-מד כדי לשטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי המכיל 30 מיליליטר של מדיום RPMI.כאשר כל העצמות כבר סמוקות, לסנן את מח העצם דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר את הצינור לארון biosafety. מוסיפים בעדינות את תסנובת התא המונונוקלארי המסוננת לאורך הצד של צינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פוליזוקרוז ונתרן diatrizoate מבלי לערבב את השכבות, ולהפריד את הפלזמה מתאי הדם הלבנים והאדום על ידי הפרדת שיפוע צפיפות. בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את השכבה האמצעית ברור המורכבת תאים mononuclear מח העצם, ולשטוף את תאי מונונוקלאר מח העצם ביחס של אחד לאחד PBS על ידי צנטריפוגה.תן את גלולה בחמישה מיליליטר של PBS לשטוף השני, ואחריו התפלה ב 10 מיליליטר של מדיום RPMI טרי לספירה. לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, ולדלל את התאים לאחת פעמים 10 לשבעה תאים לכל חמישה microliters של ריכוז RPMI טרי. לפני זריעת הפיגום, חותכים את הפולימר לאורך של חמישה מילימטר לפי הצורך, ומרטיבים את הפיגום עם חמישה מיקרוליטרים של מדיום RPMI למשך חמש דקות.בסוף הדגירה, להסיר את המדיום עודף, ולדעון את לומן פיגום עם חמישה microliters של פתרון התא מונונוקלארי מח העצם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להכניס מחט 21-מד דרך לומן של הפיגום, ולהכניס את השתל במיליליטר אחד של מדיום RPMI לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר אינדוקציה של הרדמה כללית, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל החיים המטופל, ולהחיל משחה על העיניים של החיה.גזור את השיער באתר הניתוח מסנטר לעצם הבריח, והצב את החיה על כרית כירורגית בתווית שקע הגבית. באמצעות טכניקה אספטית, לחטא את האתר הכירורגי עם povidone-יוד רציף, 70%אתנול, povidone-יוד לנגב סדרה, ולהזיז את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח עם הראש בשעה 12. השתמש במספריים עדינים ומלקחיים מיקרו-אדסון כדי לבצע חתך קו האמצע מן עצם הבריח לעצם הלשון, ולהשתמש Dumont מספר חמש ומספר שבע מלקחיים עדינים ספוגית כותנה סטרילית כדי לנקות את fascia לפני החדרת נסיגה קוליברי שמירה עצמית לתוך החתך.השתמש במקלות כדי לפתוח את שרירי הרצועה כדי לחשוף את הסחוס בבלוטת התריס, סחוס cricoid, קנה הנשימה, ולהפריד בבוטות את קנה הנשימה מן עצבי הגרון החוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדי הרקמה, ואחריו הפרדה היקפית של קנה הנשימה מן הוושט. באמצעות מחט 20-מד וסמן כירורגי, להכתים את החלק הראשון של קנה הנשימה. בצע חתך מתחת לטבעת הסחוס הטרצ'לית השלישית באמצעות זוג מספריים של קפיץ ואנה-טובינגן וזוג מטחנים עדין של דומונט מספר שבע כדי לכרות קטע של שלוש טבעות של קנה הנשימה.מחזיקים את קנה הנשימה עם ממטרים מעוגלים עדין, להשתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0 כדי לאבטח את הקצה הדיסטלי של קנה הנשימה אל עצם החזה כדי ליצור tracheostomy זמני, ולהשתמש מחט 20 מד סמן כירורגי כדי להכתים את החלק הראשון של השתל. כדי להשתיל את השתל, השתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0, דומונט מספר שבע מלקחיים עדין, ומחזיק מחט כדי להכניס את התפרים הפרוקסימליים-אחוריים, הפרוקסימליים-צדדיים והפרוקסימליים-לפנים, ולהפוך את החיה ל-180 מעלות. כאשר העכבר נמצא בעמדה, לשחרר את קנה הנשימה הזמני, ולעשות חתך בצד השני חמישה מילימטרים מן החלק הראשון של השתל כדי להקל על anastomosis דיסטלי.כדי להשלים את anastomosis דיסטלי, מניחים את התפרים באופן דומה לאנסטומוזיס הפרוקסימלי, ולמקר מחדש את תנוחת השתל ואת שרירי הרצועה. לאחר מכן, לסגור את החתך עם 9-0 תפרים ניילון סטרילי בתבנית ריצה, ולניח את החיה לבד בכלוב התאוששות להציב על כרית חימום עם ניטור עד החלמה מלאה. שבועיים לאחר ההשתלה, כמה תאי אפיתל בסיס ניתן לראות על ידי קרטין התא הבסיסי חמש ו 14 כתמים בסעיפים רקמה מהונדסים רקמה השתלת קנה דרך.תאים בזליים מזוהים גם על פני השטח הזוהרים של השתל בשבעה ימים לאחר ההשתלה. עם ההשתלה והניתוח ההיסטולוגי, זוהתה ההטמנה של השתל כגורם התורם העיקרי בעכברים מושתלים המודגמים סימנים של מצוקה נשימתית וחנק. שים לב כי טלסקופ של השתל קנה הנשימה המקומי הוא ממצא נפוץ כתוצאה של הטכניקה הכירורגית.כתמים עבור F4/80 חושף מקרופאגים מארחים בתוך האזור הסטנוטי של השתל בשילוב עם נוכחותם של תאי האפיתל הבסיסיים. הימנע מניפולציה של עצבי הגרון החוזרים ונשנים, ולהבטיח כי התפרים הפרוקסימליים והדיסטליים נמצאים במקום כדי לאפשר חותם אטום על anastomosis. כמו פרוטוקול זה עוסק בתאים mononuclear מח עצם נגזר עכברים סוכן ברמה biosafety אחד, חשוב ללבוש ציוד מגן אישי המתאים, כדי למנוע זיהום.

seeding-implantation-biosynthetic-tissue-engineered-tracheal-graft

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פריצות דרך משמעותיות זיהוי בתאי גזע הם נעשים ללא הרף. כדי לתרגם תגליות אלה, לעומת זאת, שיטות הרומן למסירה הסלולר חייב להיות המציא. כאן אני מדווחים כי דרכי הנשימה לספק מסלול בטוח עבור השתלת תא גזע אל הריאות.

הקנה: שיטה להשתלת בתאי גזע כדי ריאות

וידאו זה מציג ומשווה שני דגמים ניסיוניים ללמוד על התפתחות המחלה בדרכי הנשימה סותם (OAD) בעכברים, במודל heterotopic ו orthotopic השתלת קנה הנשימה.

השתלת קנה הנשימה Heterotopic ו orthotopic ב עכברים משמשים מודלים לחקר התפתחות המחלה Airway סותם

כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

היצרות לרינגוקנה התוצאות מתוך התצהיר צלקת פתולוגית כי באופן ביקורתי מצמצמת את דרכי הנשימה הקנה וחסר טיפולים רפואיים יעילים. באמצעות PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% pvc) סטנט כמערכת שילוח סמים מקומי, טיפולים פוטנציאליים המיועדים להפחתת התפשטות הצלקת בקנה הנשימה ניתן ללמוד.

עיצוב של משחררי ביוטינג לסמים ביולוגיים בעכברים עם היצרות לרינגוקנה

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר את הצעדים המיקרו-כירורגיים הנדרשים לביצוע השתלת גרון הטרוטופית בעכברים. היתרונות של מודל עכבר זה בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים של השתלת גרון הם עלות-תועלת שלו ואת הזמינות של בדיקות אימונולוגיות ונתונים.

מודל עכבר הטרוטופי לחקר השתלת גרון

מודל השתלת קנה הנשימה התוך-ריאתי (IPTT) הוא בעל ערך לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות. הוא מציע תובנות לגבי התנהגות אימונולוגית ואנגיוגנית ספציפית לריאות במחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלה עם יכולת שחזור גבוהה. כאן, אנו מתארים את הליך IPTT ואת התוצאות הצפויות שלו.

השתלת קנה נשימה תוך ריאתי: מודל לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

כאן, מוצג פרוטוקול להשתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, המספק מודל בעל חיים מתאים לחקירת מנגנוני התחדשות רקמות כלי הדם.

השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

חקור מנגנונים תאיים של התחדשות שתלים בדרכי הנשימה המהונדסים מרקמה בעכברים. שיטה זו משתמשת בתאי מח עצם מונונוקלאריים להערכת השתלבות השתל וטיפול בפגמי דרכי נשימה ארוכים.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

גלה סרטונים נוספים