Name: אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: חקור מודל אימונולוגי חי בעכברי BALB/c לחקר הפטיטיס האוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות. המודל מאפשר ניתוח שחזורי של הבדלי מין בהתפתחות המחלה ובתגובות החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד"ר נג'וקו מבקש להודות לד"ר נואל ר. רוז, MD PhD, על ההדרכה והדיונים מלאי התובנות שלו שהביאו לניסוח מודל זה.

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם.
1. טריפלואורואצטילציה של חלבונים ציטוזוליים כבדיים מסוג S-100 או אפיטופ CYP2E1
הערה: ראשית, הכן את ה- S100 המשולש (TFA-S100) ואת האפיטופ המשולש של CYP2E1 (TFA-JHDN5). מכיוון שחלבוני S100 סינגניים נחוצים לחיסונים, ועכברי BALB/c נדרשים לייצר את האימונוגן. ההכנה מניבה כמות גדולה של אימונוגן; לכן, צפו לבצע את החלק הזה בערך ארבע פעמים בשנה. שיטה זהה תשמש ליצירת TFA-JHDN5. האפיטופ CYP2E1 (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, ניתן לרצף או לרכוש.
<ol><li>בידוד של שבר S100 של הכבד.
	<ol>
<li>לאחר הרגעה של 5 - 10 עכברי BALB / c עם 40-60 מ"ג / ק"ג קטמין מעורבב עם 4 - 6 מ"ג / ק"ג קסילאזין, לאשר עומק תקין של הרדמה על ידי התבוננות בירידה בטונוס השרירים וללא תגובה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן (רפלקס גמילה), בנוסף לאובדן רפלקסים ימניים ואובדן רפלקסים פלפלבריים.</li>
		<li>באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים, חושפים את התוכן התוך-בטני באמצעות חתך בקו האמצע ועושים חתך קטן בווריד הנבוב התחתון קאווה כדי להסיר את הדם.</li>
		<li>מניחים אנגיוקתטר בעל 24 מדים לתוך וריד הפורטל ומכניסים את הכבד 10 מ"ל לדקה עם 40 מ"ל של 40 מ"ל של תמיסת מלח מחוצץ פוספט (PBS) pH 7.4 באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוציאים ושוקלים את הכבדים המאוגדים וחותכים אותו לחתיכות קטנות (10 – 15 מ"מ). הערה: המתת חסד מושרית על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילאזין נוספים (80 מ"ג/ק"ג: 8 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם ופתיחת חלל החזה כדי למוטט את הריאות. שיטה זו מספקת את הכאב ואי הנוחות הפחותים ביותר לבעלי החיים. שיטה זו עולה בקנה אחד עם המלצות הפאנל להמתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.</li>
		<li>הוסף פי 4 ממשקלו של סוכרוז (250 מ"מ) -TRIS (10 מ"מ) - EDTA (1 mM) מאגר הומוגניזציה (pH 7.4) בתוספת טבליות קוקטייל מעכבי פרוטאז מלאות (ראה טבלת חומרים) לפי המלצות היצרנים. הומוגניזציה בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל, באמצעות הומוגנייזר רקמות מעבדה כללי על מהירות בינונית על קרח עד לקבלת חלק. הומוגניזציה על קרח כדי למנוע מהרקמה להתחמם במהלך הומוגניזציה.</li>
		<li>צנטריפוגה הכבד הומוגנטית ב 1500 x g במשך 10 דקות ולאחר מכן לשפוך את supernatant. צנטריפוגה את הסופרנטנט במשך שעה אחת ב 100,000 x g. הצמד להקפיא את supernatant ולאחסן ב -80 °C (80 °F). הסופרנטנט הוא S-100 ציטוזולי.</li>
	</ol></li>
	<li>טריפלואורואצטילציה של S100 ו-JHDN5 הערה: Trifluoroacetylation של קבוצות אמינו ε של שאריות ליזין של S-100 יבוצע על פי ההליך של סאטו18. כל חלקי הניסוי הזה, למעט הימים האחרונים של הדיאליזה, מבוצעים במכסה האדים.<ol>
<li>קבע את ריכוז החלבון הכולל של ה-S-100 הציטוזולי באמצעות בדיקת החומצה הביצינכונינית (BCA assay)7. דילול 20 מ"ג של עכבר BALB/c S100 או JHDN5 עד 10 מ"ל עם dH2O בבקבוקון ארלנמאייר 50 מ"ל. התאם את ה- pH ל- 10 עם 1N KOH.</li>
		<li>הוסף 4.7 mmole של S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA), לתמיסה. שמור על ה- pH בין 9.9 – 10.0 עם 1N KOH על ידי מתן KOH בסגנון טיפות במשך כשעה אחת. רשום את הנפח הכולל של KOH עבור כל תגובה.</li>
		<li>העבירו את הפתרונות לקלטות דיאליזה נפרדות (אין למלא יתר על המידה). דיאליזה את הקלטות במשך 72 שעות מול 4 ליטר של dH2O עם שלושה שינויים ביום. לאחר דיאליזה, הקלט את הכרך הסופי של TFA-S100 או TFA-JHDN5 ולאחר מכן הוצמד לצינורות מסומנים. הצמד להקפיא ולאחסן ב -80 °C (80 °F).</li>
		<li>ריכוז משוער נקבע על ידי חלוקת הכמות הראשונית של S100 או JHDN5 (במ"ג) בנפח הסופי שלאחר דיאליזה (mL). כדי לקבוע את אחוז השינוי של החלבון הטבעי19, יש לדלל 1.0 מ"ג מכל חלבון מקומי וחלבון שעבר שינוי TFA (אם הריכוז הסופי גדול מ-1.0 מ"ג) ל-1.0 מ"ל עם dH2O בצינורות קליע נפרדים ולהכין ריק באמצעות 1.0 מ"ל dH2O. אם ריכוז החלבון ששונה מ-TFA הוא פחות מ-1.0 מ"ג, אין לדלל<ol>
<li>כדי להפריד בארות של צלחת באר של 96, הוסיפו 50 μL של החלבונים הריקים, המקוריים והמשתנים. הוסף 50 μL של 4% NaHCO3 ואחריו 50 μL של 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene חומצה סולפונית לכל באר.</li>
			<li>הדגירה של הצלחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה, יש להוסיף 50 μL של 10% SDS לכל באר ולאחר מכן 25 μL של 1N HCl.</li>
			<li>קרא ב- OD של 334 ננומטר ולאחר מכן רשום ספיגה של כל תרכובת מ- 200 - 600 ננומטר על מנת לאשר את הירידה האופיינית בספיגה ב- 334 ננומטר. חישוב השינוי באחוזים של שאריות ליזין על ידי TFA, באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. חיסון עכברים כדי לגרום להפטיטיס
הערה: DIH מעוצב בעכברי BALB/c על ידי חיסונים עם חלבונים ציטוזוליים בכבד ששונו באופן קוולנטי על ידי טריפלואוראצטיל כלוריד (TFA), מטבוליט תרופה לדוגמה, TFA-S1006 או אפיטופ של CYP2E1 ששונה באופן קוולנטי על ידי TFA9, TFA-JHDN5 הגורם להפטיטיס, תאי T אוטו-רייאקטיביים ו-CYP2E1 נוגדנים עצמיים. עכברים מפגינים שלב הפעלה של הטחול שבועיים לאחר החיסון הראשוני ושלב כבד ב-3 שבועות המאופיין בדלקת גרנולוציטית. נקבות עכברי BALB/c רגישות יותר מאשר זכרים להפטיטיס במודל זה.
<ol><li>ביום 0, חיסנו עכברי BALB/c בני 6-8 שבועות באופן תת עורי בבסיס הצוואר עם 200 מיקרוגרם של TFA-S100 או 100 מיקרוגרם של TFA-JHDN5 בתחליב בכמויות שוות של אדג'ובנט שלם של פרוינד (CFA). ביום 0, לחסן את העכברים עם 50 ng של רעלן שעלת, תוך שרירי באחת הרגליים האחוריות. ביום 7, לחסן את העכברים באופן תת עורי בבסיס הזנב עם 200 מיקרוגרם של TFA-S100 או 100 מיקרוגרם של TFA-JHDN5 בתחליב בכמויות שוות של CFA כדי להבטיח שכל עכבר יקבל שתי זריקות של אותו אימונוגן. הערה: העכברים מנוטרים מדי שעה במשך 6 השעות הראשונות לאחר החיסון ולאחר מכן לפחות פעמיים ביום במשך שבוע. אם העכברים מפגינים סימני כאב או מצוקה, כגון תנוחה מחוספסת או פרווה פרועה, יש לתת משככי כאבים בהתאם ל-ACUC המקומי. אם צוין כאב או מצוקה משמעותיים, העכברים צריכים להיות מוערכים על ידי וטרינר כדי לקבוע אם המתת חסד נחוצה.</li>
	<li>קביעת תגובות חיסוניות של תאי T מסוג CD4+ לחלבונים עצמיים שלמים, אפיטופים של חלבונים עצמיים או הפטן TFA באמצעות ציטומטריה של זרימה
	<ol>
<li>לאחר הרגעה של עכברים עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין באמצעות הזרקה תוך-צפקית, אשרו את עומק ההרדמה הנכון כמתואר בשלב 1.1.1 ולאחר מכן זהו את הטחול לאחר חשיפת החלל התוך-בטני באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים. חותכים את הטחול בפדיקל ומניחים בצלחת פטרי עם סרום PBS/2% עגל עוברי (FCS). הערה: המתת חסד תושרה בעכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילאזין נוסף (80 מ"ג/ק"ג: 8 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם ופתיחת חלל החזה כדי למוטט את הריאות. שיטה זו מספקת את הכאב ואי הנוחות הפחותים ביותר לבעלי החיים. שיטה זו עולה בקנה אחד עם המלצות הפאנל להמתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.</li>
		<li>שחררו את התאים באמצעות מגלשות זכוכית חלביות והעבירו לצינור פוליפרופילן חרוטי בגודל 50 מ"ל. שטפו עם PBS/2% FCS על ידי הבאת נפח של עד 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-335 x גרם באמצעות צנטריפוגה מקוררת עם ספסל. שפכו את הסופרנטנט וחזור על שלב זה.</li>
		<li>הסר תאים אדומים באמצעות 1 מ"ל של מאגר ACK Lysing למשך דקה אחת והביא נפח של עד 50 מ"ל עם PBS/2% FCS. צנטריפוגה ב 335 x g ולשפוך את supernatant.</li>
		<li>ספרו את התאים. סמן את התאים ב- CFSE למשך 30 דקות על קרח בחושך, בהתאם להוראות היצרן. השהו את מתלי התא הבודד לתוך 6 לוחות באר של 3x106 תאים/מ"ל לבאר ב-PBS/2% FCS.</li>
		<li>לגרות תאים מסומנים עם CYP2E1, JHDN5 או TFA-OVA (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2, 95% אוויר (לחות). לאחר הדגירה, הכתימו את התאים ב-CD4-APC (1:100) למשך 30 דקות על קרח ונתחו לפי ציטומטריית זרימה תוך 3 ימים.</li>
		<li>השתמש באסטרטגיית ה-gating הבאה כדי לזהות תאי CD4+CFSE+: תאי CD4+CFSE+ יזוהו מהתאים החיים המגודרים ויוצגו כהיסטוגרמות של תאים מתרבים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד של חדירה של תאי מערכת החיסון מעכברים מחוסנים. 
	<ol>
<li>כדי לבודד תאי חיסון חודרים בכבד ביום ה-14 או היום ה-21, יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין ולאשר את עומק ההרדמה הנכון כמתואר בשלב 1.1.1. לאחר לפרוטומיה באמצעות חתך בקו האמצע שנעשה עם מספריים מיקרו-כירורגיים כמתואר ב-1.1.2, ניתן להשתמש בווריד הפורטל עם מחט של 25 מדים ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב התחתון מתחת לוורידי הכליה.</li>
		<li>מנקבים כל כבד בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה עם 40 מ"ל של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר זלוף, באמצעות מספריים מיקרו כירורגיים, לחתוך את הכבד על pedicle הכבד, להסיר את כיס המרה ולאחר מכן לחתוך את הכבד על hilum.</li>
		<li>לשבש את הכבד על מסננת נירוסטה רשת באמצעות מזיק מזרק סטרילי 20 מ"ל ו PBS קר. סנן את תרחיף התא שנוצר לצינורות צנטריפוגה מעוקרים מראש של 50 מ"ל באמצעות מסך רשת של 300 מ"ל. הביאו כל מתלה ל-50 מ"ל באמצעות PBS קר ולאחר מכן שטפו את המתלים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם.</li>
		<li>יש להשליך את הסופרנטנט ולאחר מכן לאגד כל כדור על ידי טיפול בצינורות חדשים של 50 מ"ל (מומלץ צינור אחד לכל עכבר; עם זאת, אם דגימות מרוכזות, מומלץ 2-4 כדורים/צינור). תלו את הכדורים המאוגדים ב-45 מ"ל פרקול ב-35% (ב-PBS), וב-100 יחב"ל/מ"ל הפרין.</li>
		<li>סובב כל צינור ב 500 x g במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו את הכדור ב-5 מ"ל של PBS ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של חיץ ACK לכל כדור למשך 10 דקות על קרח.</li>
		<li>הביאו כל צינור ל-50 מ"ל עם PBS ושטפו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם. השליכו את ה-supernatant ולאחר מכן שטפו את התאים עם PBS/2% FCS על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם. ספרו את התאים.</li>
		<li>
ניתוח סוג התא באמצעות ציטומטריית זרימה הערה: הנה דוגמה לאופן שבו ניתן לזהות Foxp3+Tregs מושרים.<ol>
<li>דגירה של 1x106 תאים עם FcR חוסם ריאגנט וכתם עם דילולים של 1:100 של CD4-FITC, CD25-PE ו- CD45-PerCP למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, הכתימו את התאים באופן תוך-תאי באמצעות FoxP3-APC.</li>
			<li>תקן את התאים עם 250 μL של מאגר קיבוע (ראה טבלת חומרים), ואחסן ב- 4 °C עד לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה תוך 3 ימים.</li>
			<li>אסטרטגיית הגטינג הבאה מומלצת על מנת לזהות Foxp3+Tregs מושרים בתרחיפים חד-תאיים מבלוטות כבד, טחול או לימפה באמצעות ציטומטריה של זרימה: זהה תאים חיים באמצעות ערכת כתמים של תאים מתים אקווה הניתנים לתיקון חי/מת. לאחר מכן, שער על תאי כבד שהם CD45+ (PerCP, שיבוט RA3-6B2), ותאי שער CD4+ (FITC, שיבוטGK1.5) משער CD45+. מתאי CD4+, זהה את האחוזים של תאי CD25+ (PE, שיבוט 7D4) ו-FoxP3+ (APC, שיבוט 3G3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח היסטולוגי של רקמות כבד עבור הפטיטיס
	<ol>
<li>ביום ה-21, קבעו את מקטעי הכבד (בעובי 5 מיקרומטר) בפורמלין נייטרלי של 10% וכתם עם המטוקסילין ואוזין.</li>
		<li>קבעו את ציוני ההיסטולוגיה תחילה בהספק נמוך (40X) ב-2 צפיות בממוצע ואשרו ב-64X. דרג את חלקי הרקמה כדלקמן: דרגה 0 =ללא דלקת או נמק; דרגה 1 = דלקת לובולרית קלה ללא נמק; דרגה 2= דלקת לובולרית הכוללת &lt;50% מהקטע; דרגה 3=דלקת לובולרית הכוללת ≥ 50% מהקטע; ודרגה 4=דלקת עם נמק.</li>
	</ol></li>
	<li>קביעת רמות הציטוקינים ברקמות בטחולים ובכבדים. 
	<ol>
<li>ביום ה-14 או היום ה-21, הומוגניזציה של דגימות הכבד או הטחול (1 גרם) מכל עכבר ב-1 מ"ל של RPMI/2% FCS עד לקבלת הומוגנייזר מעבדה כללי על הגדרה בינונית. שמור על המדגם קר על קרח.</li>
		<li>צנטריפוגה ההומוגנטית למשך 15 דקות ב 1455 x g ב 4 °C באמצעות צנטריפוגה שולחנית מקוררת. הצמד להקפיא את supernatant ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד מוכן לשימוש. ניתן למדוד את רמות הציטוקינים והכימוקין באמצעות ערכות ELISA מסחריות, בהתאם להוראות הערכה. תקן את רמות הציטוקינים על ידי המרת הרמות (ב-mL או ב-μL) ל-pg/g של רקמה.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי נוגדנים בסרום ל-CYP2E1, ל-CYP2E1 epitope JHDN5 ולמטבוליט של תרופת ה-TFA.
	<ol>
<li>בימים 14 או 21, הרדימו את העכברים עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין. אשרו את עומק ההרדמה התקין על ידי התבוננות בירידה בטונוס השרירים וללא תגובה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן (רפלקס גמילה), בנוסף לאובדן רפלקסים מיישרים ואובדן רפלקסים פלברליים. השתמשו במחט 25 גרם המחוברת למזרק שחפת והתקרבו ללב על ידי קידום איטי של המחט לתוך חלל בית החזה שמתחת לצלעות ומיד לרוחב לתהליך ה-xiphoid. לאסוף דם באמצעות ניקוב תוך לבבי.</li>
		<li>לאחר איסוף הדם, אפשרו לו לקריש אותו בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דגימות הדם ב 295 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסרה, aliquot את sera ו הצמד להקפיא ב -20 °C (76 °F).</li>
		<li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></ol>

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כוחו של פרוטוקול זה נשען על יכולת השכפול שלו; לכן, זה קריטי לדבוק בצעדים המוצעים. ניסוח של האימונוגן יכול להיות מחסום עבור חלק; עם זאת, שחזרנו את המודל שלנו באמצעות האפיטופ המתואר במסמך שלנו, אשר מסיר את הצורך לבודד את החלק S100 של הכבד. סביר להניח כי אפיטופים או חלבונים נוספים ניתן לשנות ולגרום הפטיטיס בעקבות חיסונים; עם זאת, אנו מתארים את החלבונים שבהם השתמשנו עם תוצאות מהימנות. מספר חלבונים הודגמו כטריפלואורואצטילציה עם חשיפה להרדמה הלוגנית. ככל הנראה בשל התפשטות האפיטופ, חלק מהחלבונים הללו הם גם מטרה לנוגדנים עצמיים ...

מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות המתפתחת in vivo ולהדגים כיצד ניתן להשתמש בה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי, האימונולוגי והגנטי של מחלה זו. המטרה ארוכת הטווח של המחקרים שלנו היא לחשוף מנגנונים האחראים להתפתחות דלקת כרונית בכבד ופציעה על ידי מחקר DIH בחולים רגישים. מחלת כבד ושחמת הכבד מהוות את סיבת המוות השישית בשכיחותה בקרב מבוגרים בין הגילאים 25 ל -64. DILI אידיוסינקרטי, המכונה לעתים הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) הוא הגורם השלישי בשכיחותו לאי ספיקת כבד חריפה בארצות הברית. DIH הוא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות בכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית1. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשיםבנות 2,3,4. סוג של DIH מתפתח אצל אנשים רגישים לאחר מתן של הרדמה נדיפה הלוגנית כגון איזופלורן, sevoflurane, desflurane או halothane. הרדמה זו נקשרת באופן קוולנטי לחלבוני כבד עם מוצרים תגובתיים של חילוף החומרים שלהם, ובכך יוצרת נוגדנים עצמיים חדשניים המסוגלים לעורר תגובות אלרגיות או אוטואימוניות5.
המחקר של מנגנונים פתוגניים המעורבים בהתפתחות של הרדמה וכל צורה של DIH הופרע בעבר על ידי היעדר מודל חייתי המחקה באופן הדוק את האינדוקציה של מחלות אנושיות. פיתחנו מודל מורין ניסיוני של DIH עם תכונות הדומות ל-DILI בתיווך מערכת החיסון בחולים. הפטיטיס מושרית על ידי חיסון עם אחד משני נוגדנים עצמיים ששונו באופן קוולנטי על ידי מטבוליט טריפלואורואצטיל כלוריד (TFA) שנוצר בעקבות חילוף חומרים חמצוני של ההרדמה על ידי האנזים ציטוכרום P450 2E1 (CYP2E1)5. אוטונטיגן אחד הוא שבר הכבד הציטוזולי S100 בכבד, שהוא תערובת של מספר חלבונים6, והאנטיגן האוטו-אנטיגן השני הוא אפיטופ של CYP2E1 המוכר על ידי סרה מחולים עם DILI7 המתווך על ידי מערכת החיסון. על ידי שימוש בעכברי BALB/c, שהם עמידים יחסית להפטיטיס אוטואימונית ניסיונית, אנו מבחינים את המודל שלנו ממודל החיסון המושרה על ידי S100 של הפטיטיס אוטואימונית בעכברי C57Bl/6J8.
בגלל המצגות הקליניות המגוונות שלו, DIH קשה למחקר בחולים. מודלים ניסיוניים תרגומיים מציעים את היכולת להעריך את הפתוגנזה של מחלות in vivo ו- in vitro. נכון לעכשיו, אין שיטות חלופיות אחרות לגרימת DIH הבוחנות באופן מלא תגובות חיסוניות in vivo או in vitro מסתגלות או מולדות ללא שימוש בבעלי חיים. יתר על כן, מכיוון שנראה כי טריפלואורואצטילציה של S-100 או אפיטופ CYP2E1 אינה מייצרת אימונוגן מגרה, ואנו גורמים ל- DIH על ידי חיסון עם חלבונים ששונו על ידי TFA, בעלי חיים אלה לא יקבלו אתר, כל הרדמה הלוגנית, ברביטורט או אלכוהול לפני חיסון או הליכים אחרים, בהתחשב בכך שסוכנים אלה עשויים לשנות את הפרמטרים שאנו חוקרים. אף על פי כן, צמצמנו את השימוש בעכבר שלנו על ידי שימוש בהדמיית מחשב כדי לאשר את העדפות הקשירה של האפיטופ CYP2E1 שהתגלה עלידי כך ששיקפו את ה-DIH האנושי המעורב במין הנשי על ידי הוכחה שנקבות עכברי BALB/c מפתחות DIH10 חמור יותר.
למרות מצגות מגוונות של DIH בחולים ואתגרים בחקר מחלות קליניות, שינוי לאחר התרגום של חלבונים מקומיים על ידי מטבוליטים של תרופות תגובתיות הוא מנגנון מפתח מקובל בפתוגנזה DIH העוקב אחר הרדמה הלוגנית11. החוקרים גם מקבלים את העובדה ש-CYP2E1 הוא נוגדן עצמי מרכזי בתהליך זה12,13. תפקידם של תאי CD4+T מווסתים (IL)-4-upregulated המזהים CYP2E1 שעבר שינוי לאחר תרגום וחלבוני כבד אחרים הוא יוזם מקובל של DIH בהרדמה על ידי משיכת נויטרופילים, אאוזינופילים ותאי תורן לתוך הכבד14, ומנגנון זה אושר בצורות רבות של DIH15,16. תאי CD4+CD25+T המושרים על ידי FoxP3 המבטאים את ה-FoxP3 מפחיתים את חומרת ה-DIH, וחסרים יחסיים של תאים אלה בטחול מחמירים את ה-DIH 10,7. לפיכך, רוב ההתקדמות בהבנת DIH התאפשרה על ידי שימוש במודלים של עכברים in vivo כדי להעריך את המנגנונים הגנטיים, המטבוליים והאימונולוגיים של DIH הן in vivo והן in vitro.
מכיוון שאנו וחוקרים אחרים גילינו תפקידים עבור IL-4, נויטרופילים ואאוזינופילים בייזום של DIH באמצעות מודלים שונים של עכברים, אנו מאמינים כי תצפית זו תומכת בטענתנו כי ללא קשר למודל ה-DIH שבו נעשה שימוש, הפטיטיס ופציעה נגרמות על ידי IL-4. כוחו של הפרוטוקול שלנו טמון בשימוש במתודולוגיית in vivo, הן עכברים זכרים והן נקבות, וחזרה על היסטולוגיה, מבחני התפשטות תאי T CD4+ T וציטוקינים. החוזק של השימוש שלנו במחקרים חוץ גופיים הוא שהם מפחיתים את מספר העכברים הדרושים תוך מתן המתודולוגיה לבידוד אינטראקציות תאיות המניעות DIH. אנו ממליצים על שימוש בעכברים זכרים ונקבות מכיוון שהדבר מקטין את האפשרות להטיה לא מודעת בפרשנות התוצאות ומחזק את פוטנציאל התרגום של המחקרים שלנו מכיוון שהשכיחות, השכיחות והחומרה של DIH גבוהות יותר אצל נשיםבנות 17. אנו ממליצים לקבל עכברים ממוכר יחיד; עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, השג פקדים על בני זוג פסולת או עכברים מסוג בר מאותו ספק כמו העכברים שהשתנו גנטית.

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-טריניטרובנזן חומצה סולפונית (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP ערכת מצע</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>עכברי BALB/c</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; ערכת התפשטות תאים CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)231131</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מגיב חסימת FCR</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>תוסף כללי</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; תאים שמורים בהקפאה</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>חי/מת ניתן לתיקון ערכת צביעת Aqua Dead Cell&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>רשימת רעלני שעלת</td><td>ביולוגיים</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מי מלח pH 7.4</td> פירס <td>וסחר שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; מעכב פרוטאז מיני טבליות, ללא EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>קלטות דיאליזה Slide-a-lyzer (10 K, 12 מ"ל)</td> <td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; פתרון SDS, 10%</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי balb/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) היא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות נגד הכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשים. המנגנונים הבסיסיים של הבדלי מין אלה בשכיחות אינם ברורים בגלל מיעוט המודלים של בעלי חיים המחקים מחלות אנושיות. עם זאת, מנגנונים בסיסיים נחשבים בעיני רבים כקשורים להפלוטיפים של אנטיגן לויקוציטים אנושי ולהורמוני מין. לעומת זאת, באמצעות מודל של עכבר DIH, גילינו כי IL-4 יזם תאי CD4+ T המכוונים נגד אפיטופ של ציטוכרום P450 2E1 גורם לזרימה של נויטרופילים, מקרופאגים ותאי פיטום לתוך הכבדים של נקבות עכברי BALB/c. באמצעות מודל זה, הראינו גם שתאי T רגולטוריים של FoxP3+המושרים על ידי IL-33 מעניקים הגנה מפני DIH בעכברים נקביים וזכריים. מודל DIH זה מושרה על ידי חיסון עכברים עם אפיטופ של CYP2E1 אשר השתנה באופן קוולנטי עם מטבוליט של תרופה שנקשרה ל- DIH. אפיטופ זה מוכר על ידי חולים עם DIH. השיטה שלנו גורמת להפטיטיס חזקה וניתנה לשחזור ולנוגדנים עצמיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפתוגנזה של DIH. בעוד שמחקרי in vivo יכולים לגרום לכאב ומצוקה מיותרים בעכברים כאשר הם נעשים בצורה לא נכונה, היתרון של מודל in vivo הוא היכולת להעריך את הפתוגנזה של המחלה במספר רב של עכברים. בנוסף, ניתן לחקור את ההשפעות הביולוגיות של חלבוני הכבד שהשתנו באמצעות הליכים פולשניים. הוספת מחקרי מבחנה לתכנון הניסויי מאפשרת חזרה מהירה וניתוח מכניסטי ברמה התאית. לפיכך, נדגים את פרוטוקול המודל שלנו וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנוני in vivo ו- in vitro של DIH.

לוח הזמנים לחיסונים המשמש להשראת DIH המוצג באיור 1 מייצג את שני החיסונים הנדרשים בבסיס הצוואר (יום 0) ובבסיס הזנב (יום 7). איור 2 מציג נתוני התפשטות מייצגים שהתקבלו ביום ה-14 באמצעות CFSE בתגובה ל-CYP2E1, JHDN5, האפיטופ CYP2E1 והמטבוליט הטריפלואורואצטיל (TFA) של חומרי ההרדמה. איור 3 מראה את אסטרטגיית הגטינג ואת ניתוח הציטומטריה של זרימה מייצגת של CD4+CD25+FoxP3+ Tregs מושרים שהתקבלו ביום ה-14. איור 4 מר...

אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

מחלות כבד ושחמת הן סיבת המוות השישית בשכיחותה בקרב מבוגרים בגילאי 25 עד 64. DILI אידיוסינקרטי, המכונה לפעמים דלקת כבד הנגרמת על ידי תרופות, אוטואימוניות או מתווכת חיסונית, היא הגורם השלישי בשכיחותו לאי ספיקת כבד חריפה בארצות הברית, והוא תהליך ההסברה הנגרם על ידי תרופות כבד הנפוץ ביותר. תהליך זה מתרחש בכ-9 עד 12% מהחולים עם דלקת כבד אוטואימונית, וצורה זו של דלקת כבד היא הסיבה השכיחה ביותר להסרת תרופה מהשוק המסחרי.הרוב המכריע של החולים עם דלקת כבד הנגרמת על ידי תרופות הן נשים. פרוטוקול זה מתאר מאפיינים קריטיים הנראים בחולים כגון דלקת כבד, נוגדנים עצמיים והבדלים בין המינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולת השחזור שלה במודל עכבר in vivo, מה שנותן למדענים הזדמנות לצפות בהתפתחות המחלה והשלכותיה.באמצעות פרוטוקול זה, גילינו אפיטופ נפוץ בהרדמה ובהפטיטיס נגיפית שהוא אפיטופ דומיננטי בחולים עם דלקת כבד מרדימה, וקשור באופן משמעותי לפיברוזיס בחולים עם דלקת כבד נגיפית. אנו מאמינים כי ניתן להשתמש במידע זה כדי לפתח בדיקות אבחון ספציפיות לדלקת כבד הנגרמת על ידי תרופות או נגיפית או פיברוזיס קשורה, בתקווה שיוכלו לחזות אנשים בסיכון לפתח מחלה זו או השלכותיה. הטכניקות הכתובות יכולות להיות מכריעות מכיוון שאנו תמיד משתמשים במספר איזונים ובלמים כדי להבטיח שחזור של התוצאות שלנו.בפעם הראשונה שאתה עושה את הניסוי, תן לעצמך מספיק זמן. אחרי הפעם הראשונה, זה עובר די מהר. לאחר המתת חסד של עכבר BALB/c, השתמש בחתך בקו האמצע כדי לחשוף את התוכן התוך בטני בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים ובצע חתך קטן בווריד הנבוב התחתון כדי להסיר את הדם.לאחר מכן הנח אנגיוקטטר בגודל 24 לתוך וריד הפורטל. שמור את ה-PBS באמבט מים בארבע מעלות צלזיוס והשתמש במשאבה פריסטלטית כדי להעשיר את הכבד ב-40 מיליליטר PBS בקצב של 10 מיליליטר לדקה. בעזרת מספריים משחררים בזהירות את הכבד מהבטן ושוקלים את הכבד על סירת שקילה מזופתת.חותכים את הכבד לחתיכות קטנות של 10 עד 15 מילימטר. הוסף את דגימות הכבד כמו גם את מאגר ההומוגניזציה, פי ארבעה ממשקלו של כבד עכבר, לשפופרת פוליפרופילן של 15 מיליליטר והשלם טבליות קוקטייל מעכבי פרוטאז מלאות על פי כתב היד. השתמש בהומוגנייזר רקמות מעבדה כללי במהירות בינונית כדי להומוגניזציה של הדגימות על הקרח עד לקבלת מרקם חלק.צנטריפוגה הכבד הומוגנית ב-1, 500 פעמים G למשך 10 דקות ולאחר מכן שפכו את הציטוזול הסופרנטנט S100 לאחר צנטריפוגה שוב ב-100, 000 פעמים G, הקפיאו את ה-S100 הציטוזולי הסופרנטנטי בקרח יבש והקפיאו את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בטריפלואורואצטילציה, הפשירו את ה-S100 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בבקבוק ארלנמאייר, יש לדלל 20 מיליגרם של עכבר S100 עד 10 מיליליטר במים נטולי יונים.בעזרת מד ה- pH, התאם את ה- pH ל -10 עם אשלגן הידרוקסיד רגיל 1. במכסה אדים, הוסף 4.7 מילימול של S-ETFA לתמיסה. שמור על ה-pH בין 9.9 ל-10.0 על ידי מתן 1-אשלגן הידרוקסיד רגיל בצורה טיפתית למשך כשעה.רשום את הנפח הכולל של אשלגן הידרוקסיד עבור כל תגובה. מעבירים את התמיסות לקלטות דיאליזה נפרדות. הניחו את הקלטות בארבעה ליטר מים נטולי יונים לדיאליזה למשך 72 שעות עם שלושה החלפות ביום.לאחר הדיאליזה, רשום את הנפח הסופי של S100 טריפלואורואצטיל ולאחר מכן הוצא לצינורות מסומנים. הקפיאו את הצינורות בקרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר ריכוז החלבון נקבע על פי כתב היד, אם הוא גדול ממיליגרם אחד למיליליטר, הוסף מיליגרם אחד מכל חלבון מקומי ושונה TFA למיליליטר אחד של מים נטולי יונים בצינורות כדורים נפרדים.הכן ריק בצינור הכדור באמצעות מיליליטר אחד של מים נטולי יונים. בצלחת של 96 בארות, מוסיפים 50 מיקרוליטר מהחלבונים הריקים, המקוריים והמשתנים כל אחד, בשכפול. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט 4% ואחריה 50 מיקרוליטר של חומצה סולפונית 0.1%2, 4, 6-טריניטרובנזן לכל באר.דגרו את הצלחת בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של 10% SDS לכל באר, ואחריו 25 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה 1. לאחר חיסון והרדמה של העכבר, השתמש במספריים מיקרו-כירורגיים כדי לחשוף את החלל התוך בטני.זהה את הטחול. חותכים את הטחול בפדיקל ומניחים אותו בצלחת פטרי עם PBS המכיל סרום עגל עוברי 2%. כדי לשחרר את התאים, תקעו את הטחול בין שתי שקופיות זכוכית חלבית ושפשפו אותן זו בזו.השתמש בפיפטה אלקטרונית כדי להעביר את התאים לצינור פוליפרופילן חרוטי של 50 מיליליטר. כדי לשטוף, הוסף PBS המכיל 2% FCS לצינור כדי להגיע לנפח של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-335 פעמים G באמצעות צנטריפוגה מקוררת על שולחן. יוצקים את הסופרנטנט וחוזרים על שלב הכביסה.הוסף מיליליטר אחד של חוצץ ACK לתוך הצינור כדי לשטוף במשך דקה אחת להסרת כדוריות אדומות. לאחר מכן חזור על שלב הכביסה PBS בתוספת FCS. לאחר תיוג תאים עם CFSE למשך 30 דקות, הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר של ציטוכרום-P450 2E1, JHDN5 או אובאלבומין טריפלואורואצטיל כדי לעורר תאים מסומנים למשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.לאחר הדגירה, צבעו את התאים ב-CD4 המסומן באלופיקוציאנין ביחס של 1:100 למשך 30 דקות על קרח. לאחר לפרוטומיה של העכבר המחוסן, כמתואר בכתב היד, יש לשרוף את וריד השער בעזרת מחט בגודל 25 ואז לחתוך את הווריד הנבוב התחתון מתחת לוורידי הכליה. באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, יש להחדיר לכל כבד 40 מיליליטר PBS בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה.לאחר זילוף, בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים, חותכים את הכבד ברגלי הכבד, מסירים את כיס המרה ואז חותכים את הכבד בהילום. על מסננת נירוסטה 300 רשת, השתמש בעלי מזרק סטרילי של 20 מיליליטר ו-PBS קר כדי לשבש את הכבד. בעזרת המסך, סנן את מתלה התאים המתקבל לצינורות צנטריפוגה מעוקרים מראש של 50 מיליליטר.הביאו כל תרחיף ל-50 מיליליטר באמצעות PBS קר ולאחר מכן שטפו את התרחיף בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 פעמים G השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שלבו כדורים על ידי טיפול בצינורות חדשים של 50 מיליליטר. השעו את הכדורים המשולבים ב-45 מיליליטר של 35% פרקול ב-PBS ו-100 יחידות בינלאומיות למיליליטר הפרין. לאחר מכן, סובב כל צינור ב 500 פעמים G למשך 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט והשעו את הגלולה בחמישה מיליליטר PBS ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר ליזה ACK לכל כדור ואחסנו על קרח למשך 10 דקות. לאחר שטיפה נוספת עם PBS על ידי צנטריפוגה ב-370 פעמים G, השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שטפו את התאים עם PBS בתוספת FCS על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 פעמים G.השתמש בהמוציטומטר אלקטרוני כדי לספור את התאים. בניסוי זה, התגובות החיסוניות של תאי CD4+T נקבעו באמצעות ציטומטריית זרימה.נתוני התפשטות מייצגים התקבלו ביום ה-14 באמצעות CFSE בתגובה למטבוליט טריפלואורואצטיל, ציטוכרום-P450 2E1, אפיטופ ציטוכרום-P450 2E1, JHDN5. בארות ללא אנטיגן שימשו כבקרות. בהשוואה לביקורת, עכברי BALB/c פיתחו שגשוג בתגובה לאובאלבומין וציטוכרום-P450 2E1 שעברו טריפלואורואצטילאט, אך לא JHDN5.שלושה שבועות לאחר ש-TFA עבר תחליב בחיסון אדג'ובנטי מלא של פרוינד, עכברי BALB/c נקבות פיתחו יותר דלקת כבד אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בהשוואה לעכברי BALB/c זכרים. ניתוח היסטולוגי של רקמות הכבד מראה גם דלקת כבד חמורה יותר בעכברים נקבות מאשר בעכברים זכרים. מספר תאי הכבד CD4+CD8+NK+ו-NKT+היה גבוה משמעותית בנקבות מאשר בזכרים.אמנם לא היו הבדלים בתאי B שנראו בין העכברים הללו זכרו שלמרות שמדובר ביום ארוך, ניסוח זה יחזיק מעמד זמן רב. ניתן לבצע הליך זה גם כדי לטריפלואורואצטילאט את האפיטופ. הליך זה אפשר לחוקרים לנתח את מהלך הזמן של התפתחות מחלות כבד ולהגדיל את הפוטנציאל לתגליות חדשות של חלבונים ומסלולים.S-ethyltrifluorothioacetate הוא רעיל, ויש לטפל בו במכסה אדים. בנוסף, מומלץ בחום תרגול וטכניקות מעבדה טובות.

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

זיהום של עכברים עם adenovirus להביע autoantigen אדם גדול ציטוכרום P450 2D6 (hCYP2D6) המוכרים על ידי סרה של חולים הסובלים מסוג 2 תוצאות אוטואימוניות הפטיטיס בצורה מתמשכת של מחלה אוטואימונית בתיווך הכבד המאופיינת סיסטיק נרחב צהבת, ואת הדור של CYP2D6 ספציפית התגובה החיסונית.

CYP2D6 מודל החיה: כיצד לגרום דלקת כבד אוטואימונית עכברים

הסרטון מדגים השראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי על ידי הזרקת שילוב של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים מיאלין ושחפת מיקובקטריום בלתי פעילה. המודל מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני מחלה ולבחון התערבויות טיפוליות.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

כתב יד זה מתאר את השיטות לאינדוקציה וניקוד של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסויי (EAE), יחד עם הערכת התפלגות תאי החיסון ורמות ציטוקינים mRNA בבלוטות הלימפה, הטחול, הדם וחוט השדרה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR כמותי, בהתאמה, בשלבי מחלה שונים.

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

חקור מודל אימונולוגי חי בעכברי BALB/c לחקר הפטיטיס האוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות. המודל מאפשר ניתוח שחזורי של הבדלי מין בהתפתחות המחלה ובתגובות החיסון.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

גלה סרטונים נוספים