Name: בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: חקור בידוד תאי B ממאירים ולא ממאירים מדגי זברה lck:eGFP לחקר לוקמיה לימפובלסטית חריפה ומערכת החיסון הספציפית. השיטה מאפשרת ניתוח זרימה וניתוח תאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מייגן מאלון-פרז לטיפול דג זברה, OUHSC הליבה cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים יונדאי תקווה על גלגלים, אוקלהומה המרכז לקידום של המדע והטכנולוגיה (HRP-067), פרס הפרויקט טייס NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF מחזיק את תיאורטית יבשה & תלמה גיילורד הקתדרה של ילדים המטולוגיה-אונקולוגית לילדים החולים קרן.

בכל ההליכים הכרוכים דג זברה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במרכז למדעי הבריאות באוניברסיטה של אוקלהומה.
1. בידוד שאינם ממאירים B ו- T לימפוציטים מ הטרנסגניים lck:eGFP דגים
<ol><li>עזים ומתנגד הדג באמצעות tricaine 0.02% (MS-222) במים מערכת דגים.</li>
	<li>בחן דגים בן 2-6 חודש עבור פלורסנט thymi, אשר ממוקמים על ההיבט dorsomedial של חלל branchial של דג זברה, אחרים teleosts14. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence (470/40 עירור גל ו מסנן פליטה 525/50) כדי לזהות GFP.</li>
	<li>להכין מראש 50 מ של עיקור מסנן 1 x רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) המכיל 1% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (מיון מדיה). ניתן לאחסן מדיה המיון שאינה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	<li>המתת חסד הדג על-ידי הצבתו בתוך המכיל 0.2% Tricaine במשך כ- 5 דקות, ואחריו טבילה אמבט קרח. לאשר מוות על ידי הפסקת תנועת opercular (גיל).</li>
	<li>מניחים את הדג לאללה בצלחת פטרי ומנתחים איברי הלימפה של עניין, שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח את GFP+ thymi14, ואת הגדרות מיקרוסקופיית שדה בהיר לנתח את הכליה מח וה טחול15. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות דגים בן חודש 3. לימפוציט הפרופורציות ואת מספרים מוחלטים משתנים בהתאם לגיל גנוטיפ (ראה דיון לפרטים נוספים).</li>
	<li>מקם כל איבר ואיבר ביתור צינור 1.5 mL המכיל 500 µL של קור מיון מדיה.</li>
	<li>Homogenize הרקמה על קרח באמצעות מהמגן מיקרו-שפופרת של המרוסקים.</li>
	<li>עוברים רקמות הומוגני מסנן רשת מיקרומטר 35 ליצירת השעיה תא בודד. לשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.</li>
</ol>2. בידוד לימפוציטים ממאירים מ כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; lck:eGFP דג זברה
<ol><li>
החל בגיל 2-4 חודשים, ברמה המיקרוסקופית מסך rag2:hMYC; lck:eGFP דג אחר דפוסים GFP חריג. הערה: B תאים הם GFPהלאו ברקע lck:eGFP , אז B-כל דורש תרגול להכיר; T-כל ברור, כי תאי T הם GFPשלום. כתוצאה מכך, rag2:hMYC, קו כפול-הטרנסגניים lck:eGFP יש שני פנוטיפים: במאור פנים פלורסנט T-כל, אשר בדרך כלל נובעים התימוס להרחיב לתוך הגוף ועל במעומעם פלורסנט B-כל.<ol>
<li>באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מסך הדג באמצעות הגדרות "חשיפה נמוכה" (200 ms, 2.4 x רווח) כדי לזהות כל T בהיר (איור 1 א') ואת "חשיפה גבוהה" (1.5 s, 3.4 x רווח) כדי לזהות עמום B-כל (איור 1 א'). פקדים WT ודגים טרום לוקמיה יש GFP לשפות אחרות רק ב בלוטת התימוס (איור 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>עזים ומתנגד ולבחון את הדגים כמתואר בצעדים 1.1-1.2.</li>
	<li>לסווג את הדגים בהתבסס על היקף GFP פלורסצנטיות, באמצעות מערכת פשוטה קטגוריה 3: הערה: רמה 1: זריחה מופיע גידול הרתי עם רק התפשטות מקומית מוגבלת. רמה 2: זריחה מופיע מעבר התימוס, מעורבים < 50% של הגוף. רמה 3: זריחה מרחיב מעבר ל- 50% של הגוף.</li>
	<li>הפרד את הדג עם כל מאלה ללא סרטן. לפקח על הדג טרום לוקמיה (קרי, דגים ללא גידולים GFP+ ) פעם אחת מדי חודש להתפתחותם של כל חדש. ~ 9 חודשים, כל rag2:hMYC, דג lck:eGFP לפתח T-כל, B-כל, או שניהם.</li>
	<li>עבור T - או B-כל תא בידוד, בחר רמה 3 דגים (כולם מעורבים > 50% של הגוף), אשר תשואה יותר מ 2 x 106 כל התאים, ועוד רבים בדרך כלל.</li>
	<li>המתת חסד את הדגים כמו שלב 1.4. הערה: קיימות שתי שיטות לקבלת כל התאים: כל גוף המגון ואת טכניקת שטיפת הצפק16. השיטות נבדלים המספר המוחלט של התאים שנאספו לצורך מיון, לפיכך, כמויות FACS הזמן הנדרש ועלות (ראה דיון לפרטים נוספים).</li>
	<li>עבור אחת מהשיטות, תחילה מניחים את הדג לאללה בצלחת פטרי, באמצעות סכין גילוח, להסיר את הראש כולל באזור הרתי. זה ניתן לעבד בנפרד, אם רצונך בכך, או המשמש עבור צביעת היסטולוגית.</li>
	<li>
שיטת שטיפת הצפק
	<ol>
<li>באמצעות פיפטה P1000, לשטוף את חלל הצפק דגים עם 500 µL של קור מיון מדיה, איסוף את התאים ואת התקשורת שפופרת 5 מ.</li>
		<li>באמצעות טיפ פיפטה טריים, להזריק µL 200 – 300 נוספים של אמצעי המיון קר לתוך חלל הגוף. לאחר מכן, משתמש קצה פיפטה, להחיל לחץ עדין על הגוף דגים כדי הבלטת התאים מתוך חלל הגוף. לאסוף מדיה זו ולהוסיף שפופרת 5 מ.</li>
		<li>חזור על שלב 2.8.2 2 – 3 פעמים. שמור את התאים שנאספו מיון מדיה על קרח.</li>
		<li>לסנן את המתלים תא למרות רשת מיקרומטר 35 לסנן לפני cytometry זרימה/FACS ולשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
המגון כל הגוף
	<ol>
<li>לאחר הסרת ראש דג, למקם את הגוף צינור 1.5 mL המכיל 200 µL של מיון מדיה.</li>
		<li>Homogenize על הגוף באמצעות מהמגן מיקרו-שפופרת של המרוסקים.</li>
		<li>להוסיף על µL 300 נוספים של קור מיון מדיה. לסנן את המתלים תא למרות מסנן רשת 35 מיקרומטר. הוסף מדיה מיון לפי הצורך כדי לשטוף את כל התאים דרך המסנן, עד רק רקמות פסולת נשאר על המסנן. לשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cytometric ניתוח של לימפוציטים B נורמלית או ממאיר
<ol><li>ניתוח cytometric תזרים קבוע ו/או FACS פרמטרים על פי המדריך של היצרן.</li>
	<li>
רוכשים מספר אירועים בתחילה לאפיין את הדגימה הרצוי. לנתח את עונה 1 פרק 104 כדי 5 x 10 אירועים4 לפני מיון לקביעת השערים ספציפי עבור והשלבים המיון.
	<ol>
<li>לקבוע שערים: הגדרת שערים תא לימפוציט, קדמון באמצעות פיזור קדמי (FSC) ופרמטרים פיזור (האס) בצד, למעט פסולת הסלולר (איור 2 א-ג)17. FSC ואת האס יתאימו תא גודל/קוטר, צפיפות, בהתאמה. הערה: GFP–, GFPהלאוותאים GFPשלום שונים 10 ל- 100-קיפול מבחינת עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלהם GFP, עושה הפרדה בין אוכלוסיות אלה פשוטה (איורים 2-5). אפליה חי-מת יכול להידרש בשלב זה באמצעות יוד propidium (PI) או 7-aminoactinomycin מכתים הכדאיות D (7-AAAD). ניסויים קודמים עם PI בדרך כלל להדגים > 95% הכדאיות של GFP+ תאים לאחר FACS.</li>
		<li>אל תכלול את התא doublets, על פי הפרמטרים של המכונה FACS בשימוש.</li>
		<li>בתוך השערים הלימפה או קודמן, לקבוע את המספר ואת אחוז תאים GFP+ .</li>
	</ol>
</li>
	<li>שימוש phycoerythrin (PE) ועוצמות GFP, להגדיר שער עבור GFP– לעומת GFPהלאו לעומת GFPשלום תאים. הערה: בתאי B התערוכה פלורסצנטיות GFP עמום ולהראות בתאי T GFP בהיר בקווים lck:eGFP . איברי הלימפה או דגימות הגידול רבים מכילים שתי האוכלוסיות GFP+ . B-השושלת תאים/B-כל ה-GFPהלאו הינם השושלת T תאים/T-כל הם GFPשלום. הגדרת שערים כדי להבחין בין GFP–, GFPהלאוותאים GFPשלום , ולאסוף אוכלוסיות אלה בנפרד (איור 2A-C, איור 3 א-C, איור 4A ו- איור 5A).</li>
	<li>למיין כל האוכלוסייה תא שונים 15 מ"ל צינורות פוליפרופילן המכיל 2 מ"ל של מיון מדיה, או ישירות לתוך צינורות שונים mL 1.5 המכיל מאגר המתאים עבור ניתוחים נוספים (למשל, ה-RNA, דנ א או חלבון החילוץ, מאפשר-השתלת, וכו '.).</li>
	<li>לשמור תאים מטוהרת על הקרח לפני ניתוח נוסף.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

פיתח ואנו מספקים פרוטוקול כדי לבודד תאים B lck:eGFP דג זברה מהונדס, הוספת זה דגמים אחרים rerio ד עם B-השושלת תוויות3,4. באופן מפתיע למדי, הזיהוי של ה-GFPהלאו B תאים בשורה זו הלכה מעיניהם מאז התיאור שלו בשנת 2004. באופן כללי, lck נחשבת תא T ספציפי6, אך מחקרים אחרונים מצאו ביטוי בלתי צפוי lck על ידי הרוצח הטבעי, מיאלואידית תאים, כמו גם כמו בתאי B כמוצג כאן18,<s...

דג זברה מציעים תכונות רב עוצמה, כגון manipulability גנטי, פוריות גבוהה, המוגבהת אופטי והתפתחות מהירה המאפשרים לימוד פיתוח חוליות שימוש בגישות גנטיות. יתרונות אלו, יחד עם התכונות המשותפות של hematopoiesis teleost, יונקים, להפוך rerio ד אידיאלי עבור ניתוחים ויוו של הפונקציה lymphopoiesis, לימפוציטים, מהמראה שלהם המוקדם בהזחלים לאורך הבגרות. פיתוח דם דג זברה מתבססת שנשמרת היטב תהליכים גנטיים משותפים עם יונקים, אלה להרחיב מערכת החיסון מסתגלת. בנוסף, מולקולרית מנגנונים המסדירים פיתוח הלימפה נשמרים להפליא בין דג זברה ויונקים1.
במהלך העשורים האחרונים 2, הטרנסגניים rerio ד קווים שושלות דם ספציפית את התווית, חסר מבחינות אלה שושלות מוטציה קווים נוצרו2,3,4,5. באחת מהן, הקו הטרנסגניים lck:eGFP , משתמשת דג זברה לימפוציט חלבון טירוזין קינאז (מזל) יזם לנהוג GFP ביטוי6. גן זה, אשר מתבטאת במיוחד על ידי T-השושלת מבשרי והן לימפוציטים T בוגרים, מאפשר ויוו מעקב אחר התפתחות הרתי תא T ו- ex-vivo טיהור תאי T-היוחסין מאת FACS7. בעבר, השתמשנו הקו הזה ב מסך מוטגנזה מכוונת ENU קדימה-גנטית כדי לזהות מוטציות germline נוטה T-כל וכדי ללמוד רכשה תחושתיים אירועים גנטיים הקשורים תא T-oncogenesis-8,-9.
לאחרונה, המעבדה שלנו עוד הרחיב את התועלת של דג זברה lck:eGFP . בכפול-הטרנסגניים rag2:hMYC (MYC אנושי), rerio lck:eGFP ד ידועים לפתח T-כל 10, גילינו B-השושלת כל להתרחש גם11. בניגוד T-כל במודל זה, אשר לזרוח בהירים עקב גבוה ביטוי GFP, B-כל הם במעומעם פלורסנט עקב רמות נמוכות GFP, ומאפשר דג עם B-כל להיות מכובד בגסות מאלה עם T-כל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביטוי זה-GFP דיפרנציאלית מאפשרת גם ההפרדה של GFPהלאו B-כל התאים של GFPהיי תאי T-כל שימוש FACS11. יתר על כן, ביטוי נמוך lck אינה ייחודית דג זברה B-כל, בתור האדם B-כל רמות גם צ'ק נמוך של LCK11,12. באופן דומה, תאים נורמליים B-היוחסין של rerio ד, בעכברים ובבני אדם לבטא גם רמות נמוכות של מזל/מזל/LCK, עם תאי B לא בשלה יש11,הביטוי הגבוהה ביותר13. על בסיס לכל תא, B-שושלת התאים בשורות דג זברה או נגזרות lckeGFP אקספרס 1-10% GFP באותה מידה כמו לימפוציטים מסוג T. האלה GFPהלאו תאים מאפיין אקספרס תא B mRNAs כגון pax5, cd79b, blnk, ה"לקשור, ighm, ighzואחרים, ואני יכול להיטהר מן מח, בלוטת התימוס, טחול או ציוד היקפי דם11. לכן, שני B - ו T-שושלת התאים יכולים להיות מבודדים מן lckeGFP דג זברה, ובמקרה של rag2hMYC, lckeGFP חיות, B - ו T-כל התאים גם11.
כאן, אנחנו מציגים פרוטוקול שלנו ביעילות לטהר FACS שאינם ממאירים בתאי B lck:eGFP דג זברה, ואת תאי B שאינם ממאירים או ממאיר של rag2hMYC; lck:eGFP דג, באמצעות רקמות מקור שונים. באופן דומה ניתן לכמת תאים כאלה על ידי cytometry זרימה ללא בידוד FACS, אם רצונך בכך. גילוי של ביטוי נמוך lck -כתוצאה מכך, נמוך ביטוי GFP-מאת B תאים פותח דלתות חדשות של אפשרויות ניסיוני lckeGFP דג זברה, כגון vivo ב B תא מחקרים התפתחותיים. לפיכך, הקו הזה מהונדס, דווח לראשונה בשנת 2004, יש חיים חדשים אנו שואפים לנצל את זה כדי ללקט תובנות טריים בדבר חסינות מסתגלת דג זברה.

<table><tbody><tr><td>35 ומיקרו; m רשת</td><td>Sefar מסנן טכנולוגיה</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור עגול תחתון עם מכסה מסננת תאים</td> פלקון <td>קורנינג מותג</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 מיקרוסקופ פלורסנט</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאנססולפונט; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>ראה Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>גרסה 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזרים של מיקרו-צינורות עליים</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>העברת פלסטיק pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>ראה Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד malignant ותאי b non-malignant מ lck:egfp דג זברה

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

דג זברה (רזבורה rerio) הם במודל רב עוצמה ללמוד פיתוח לימפוציטים. כמו של יונקים, rerio ד בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית הכוללת B ו- T לימפוציטים. מחקרים של דג זברה lymphopoiesis קשים בגלל נוגדנים זיהוי סמני פני שטח התא rerio ד הם בדרך כלל לא זמין, שמסבך בידוד ואפיון של אוכלוסיות שונות לימפוציט, כולל B-היוחסין תאים. קווים הטרנסגניים עם שושלת היוחסין הספציפי fluorophore ביטוי משמשים לעתים קרובות כדי לעקוף את האתגר הזה. הקו הטרנסגניים lck:eGFP שימש ללמוד פיתוח תא T rerio ד , יש גם מנוצל ועד פיתוח מודל T cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). למרות lck:eGFP דגים היה בשימוש נרחב כדי לנתח את T-שושלת היוחסין, הם לא שימשו ללמוד תאי B. לאחרונה גילינו כי הרבה תאים דג זברה B גם להביע lck, אם כי ברמות נמוכות. כתוצאה מכך, lck:eGFP B תאים לבטא גם רמות נמוכות של GFP. על סמך ממצא זה, פיתחנו פרוטוקול לטהר תאים B-השושלת lck:eGFP דג זברה, אשר אנחנו מדווחים כאן. השיטה שלנו מתאר כיצד לנצל את סדרן תא לפעיל על-פלורסנט (FACS) לטהר בתאי B lck:eGFP דגים או שורות קשורים, כגון כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; דגים lck:eGFP . בשורות אלו, בתאי B, במיוחד לא בוגר B תאים, אקספרס GFP ברמות נמוכות אבל לזיהוי, ולאפשר להם להיות מכובד מתאי T, המבטאות GFP מאוד. בתאי B יכול להיות מבודד מח, בלוטת התימוס, הטחול, דם או רקמות אחרות. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטהר את תאי B rerio ד , המאפשר לימודים ממוקד בנושאים כמו התפתחות תא B ו- B לימפוציטים גידולים ממאירים.

השתמשנו cytometry זרימה כדי לנתח, FACS לבודד GFPהלאו ותאים GFPשלום התימוס, מח הכליות, הטחול של דג זברה מהונדס lck:eGFP . ניתוח של דגים בת 3 חודשים גילה שהתימוס הכיל בעיקר לימפוציטים GFP+ . GFP+ תאים במידה רבה הוגבלו לשער הלימפה שתואר קודם לכן על-ידי Traver et al.17. שתי האוכלוסיות GFP+ ברורים GFPהלאו, GFPשלום,יכול להיות שנצפו התימוס. GFPשלום לימפוציטים ייצג א...

דג זברה מהונדס lck:eGFP אקספרס GFP מאוד לימפוציטים מסוג T, השתמשו ללמוד פיתוח תא T ו לוקמיה לימפובלסטית חריפה. הקו הזה יכול לשמש כדי מחקר B תאים, אשר אקספרס lck ברמות נמוכות. פרוטוקול זה מתאר טיהור תאי B ממאיר, שאינם ממאירים של דג זברה lck:eGFP .

בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

לאחרונה מצאנו כי תאי B רבים ב- LCK GFP זברהפיש מבטאים רמות נמוכות של GFP. פעולה זו הופכת קו זה לכלי שימושי לחקר תאי B ותאי T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעכשיו אנחנו יכולים לחקור תאי B ותאי T מ LCK GFP זברהפיש או שאנחנו יכולים ללמוד B-ALL ותאי T-ALL מדגים עם סרטן.שיטות אלה מאפשרות פיתוח תאי B ומחקרי B-ALL בזברה- דגי זברה. שרלוונטיים להבנת המערכת החיסונית הסתגלותית וזה ממאירות נפוצה בסרטן ילדים. אם מעולם לא עשית ניתוחים אלה לפני ייתכן שתרצה לחדד את הטכניקה שלך כמה פעמים עד שתוכל להשיג תימוס טוב דגימות מח עצם.הדגמה חזותית תסייע לצופים לזהות פלואורים ו- B-ALL בדגים ולבחור את ההגדרות הנכונות להפלות תאי B ו- T לבידודם. לאחר הרדמה עם 0.02% Tricaine במים מערכת דגים להשתמש במסנן GFP על מיקרוסקופ epifluorescence לבחון חודשיים עד שישה חודשים זברה דגי תימי פלואורסצנטי בהיבט המדיאלי הגבי של חלל הענף. לאחר איתור התימוס במקום דגים המתת חום בצלחת פטרי ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להסיר את התימין החיובי GFP.והגדרות מיקרוסקופיה בהירה כדי לקצור את מח הכליות ואת הטחול. מניחים כל איבר שנאסף בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של מדיום מיון קר ולהשתמש homogenizer microtube עלה הומוגניזציה של הרקמות על הקרח. לאחר מכן, מסננים את הרקמה ההומוגנית באמצעות מסנן רשת של 35 מיקרומטר כדי ליצור השעיה של תא יחיד ולמקום את התאים על קרח.החל מחודשיים עד ארבעה חודשים השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן rag2:hMYC LCK EGFP דגים באמצעות הגדרות חשיפה נמוכה כדי לזהות לוקמיה לימפובלסטית חריפה תא T בהיר או T-ALL והגדרות חשיפה גבוהה כדי לזהות בעלי חיים B-ALL עמום. בקרת סוג פראי ודגים טרום לויקמיים יש GFP מקומי רק התימוס. לסווג את הדגים על סמך היקף פלואורסצנטיות GFP באמצעות מערכת פשוטה שלוש קטגוריות.דג ברמה אחת מדגים אות פלואורסצנטי כגידול תימי עם התפשטות מקומית מוגבלת בלבד. דגים ברמה 2 מדגימים אות פלואורסצנטי מעבר לתימוס המערב פחות מ-50% מהגוף. ודגים ברמה שלוש מדגימים אות פלואורסצנטי המשתרע מעבר ל-50% מהגוף.להפריד את הדגים עם כל מאלה ללא סרטן. ולפקח על הדגים טרום לויקמי ללא גידולים חיוביים GFP פעם בחודש לפיתוח של ALL חדש. עבור T או B-ALL בידוד התא להשתמש סכין גילוח כדי להסיר את הראש ואת האזור התימי של דג ברמה המתת דם שלושה ולהנחות את הגוף בצלחת פטרי.השתמש P-1000 פיפטה לשטוף את חלל הצפי דגים עם 500 microliters של מדיום מיון קר, איסוף התאים בינוני בצינור חמישה מיליליטר. באמצעות קצה פיפטה טרי להזריק שניים עד שלושה נוספים 200 כדי 300 כרכים microliter של מדיום מיון קר לתוך חלל הגוף ולהשתמש בקצה של פיפטה כדי להפעיל לחץ עדין על גוף הדגים כדי להבליט את התאים מתוך חלל הגוף לתוך צינור חמישה מיליליטר. לאחר מכן, מסננים את ההשעיה של התא באמצעות מסנן רשת רשת של 35 מיקרוליטר.ולמקום את התאים על קרח עד הניתוח שלהם על ידי ציטומטריה זרימה. עבור הומוגניזציה של כל הגוף להשתמש homogenizer microtube עלה כדי homogenize את הגוף של הדג ולהוסיף 300 microliters נוספים של מדיום מיון קר לצינור. מסננים את מתלי התא באמצעות מסנן רשת רשת של 35 מיקרומטר, שוטפים את המסנן באמצעי מיון נוסף לפי הצורך עד שרק פסולת רקמה נשארת על המסנן.לאחר מכן, מניחים את התאים על קרח עד הניתוח שלהם. לניתוח ציטומטרי זרימה של התאים המבודדים להגדיר את הפרמטרים cytometer זרימה על פי הנחיות היצרן. ולרכוש 10, 000 עד 50, 000 אירועים כדי להגדיר את פיזור קדימה ופרמטרים פיזור בצד להגדרת שערי הלימפוציטים ותאי הצאצאים ולא לכלול את הפסולת התאית.אל תכלול את כפילויות התא ולהשתמש בשערי הלימפה ו/או מבשר כדי לקבוע את המספר והאחוז של התאים החיוביים GFP. באמצעות פיקוריתרין ואת התעצמויות GFP להגדיר שערים עבור GFP שלילי לעומת GFP נמוך לעומת תאים גבוהים GFP. לימוד היכן למקם את השערים לבודד את התאים הגבוהים GFP נמוך GFP הוא קריטי להשגת אוכלוסיות טהורות של תאי B ו- T.שתי אוכלוסיות חיוביות GFP נפרדות, GFP נמוך B תאים ותאי GFP גבוה T ניתן להשיג מן התימוס. תאי B המתגוררים מח הכליה של דגי זברה בן שלושה חודשים להביע רמות נמוכות של GFP. תאים גבוהים GFP הם נדירים עם זאת, המציין כי רק אחוז קטן של לימפוציטים T נמצאים מח העצם בגיל שלושה חודשים.כמו כן, דגימות טחול להראות אחוזים גבוהים יותר של GFP נמוך מאשר תאים גבוהים GFP. בדגים מהופנטים כפולים שעדיין לא פיתחו לוקמיה לימפובלסטית חריפה, ביטוי GFP בתימוס, מח העצם והטחול דומה לזה שנצפה בדגי LCK EGFP מהופנטים. עם זאת, מספר הלימפוציטים לכל איבר גדל.ככל הנראה, בשל התפשטות מונעת MYC של אוכלוסיות תא B ו- T לא בוגרות שבהן מקדם הסמרטוטים פעיל. בדגים מהופנטים כפולים עם B ו- T-ALL שפיתחו סרטן פלואורסצנטי בשישה חודשים B-ALL הם סרטן פלואורסצנטי עמום המכיל בעיקר תאים נמוכים GFP. לעומת זאת, דגים פלואורסצנטיים בהירים יכולים לספק מחסה לאוכלוסיות T-ALL מבודדות או מעורבות של תאי B-ALL ו-GFP גבוהים של GFP.ואכן, כפי שהוערך על ידי ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית GFP תאים נמוכים מבטאים רמות גבוהות יותר של תעתיקי תאי B. ותאי GFP גבוהים מבטאים רמות גבוהות יותר של גנים של תאי T, LCK וסמן GFP. זה קריטי ללמוד כיצד לזהות דגים עם B-ALL על ידי מיקרוסקופיה.וכיצד להגדיר כראוי את שערי ציטומטריית הזרימה להפרדת אוכלוסיות גבוהות GFP נמוך GFP. בעקבות הליך זה, אתה יכול לבודד DNA, RNA, או חלבון מן GFP נמוך GFP תאים גבוהים GFP עבור PCR, רצף, מה יש בדם או בניסויים השתלת vivo. ברגע שלמדנו שלדגי LCK GFB יש תאי B פלואורסצנטיים בנוסף לתאי T, נוכל לחקור את שני סוגי התאים מאותה חיה כדי להעריך B ו- T-ALL.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הגבלת תא דילול מבחני השתלת משמשות כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת דג הזברה syngeneic כי לפתח לוקמיה fluorescently שכותרתו ופרטים כיצד לבודד השתלת תאים אלה לוקמיה על הגבלת דילול לתוך חלל הצפק של דג הזברה מבוגר.

כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של בידוד תאי גידול בעלי תווית פלואורסצנטית של לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T (T-ALL) מדגי זברה בוגרים וכימות שלהם באמצעות צבע כחול טריפאן.

בידוד תאי T-ALL עם תווית פלואורסצנטית: שיטה לבידוד תאי T-ALL מדגי זברה בוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים של שריר השלד של דג הזברה ורבדומיוסרקומה עוברית (ERMS) לתוך דג זברה מוטנטי מוטנטי הומוזיגוטי של rag2E450fs. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל של התחדשות וטרנספורמציה ממאירה של תאי שריר.

השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

השתמשנו בצביעת התפשטות תאים כדי לזהות תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה מסוג T של דג הזברה. הכתם נשמר בתאים שאינם מתחלקים ומצטמצם במהלך התפשטות התאים, מה שמאפשר בחירה של תאים רדומים להמשך חקירה. פרוטוקול זה מספק כלי פונקציונלי לחקר התחדשות עצמית בהקשר של שקט תאי.

זיהוי תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T של דג זברה באמצעות צביעת התפשטות תאים 

חקור בידוד תאי B ממאירים ולא ממאירים מדגי זברה lck:eGFP לחקר לוקמיה לימפובלסטית חריפה ומערכת החיסון הספציפית. השיטה מאפשרת ניתוח זרימה וניתוח תאים בודדים.

בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה

גלה סרטונים נוספים