Name: מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: למדו את שיטת מסך אחד-היברידית משופרת בשרמרים לזיהוי גורמי שעתוק הקושרים לרצפי DNA אנושיים. שיטה זו מאפשרת סינון של יותר מ-1,000 גורמי שעתוק בניסוי אחד לחקר גנומיקה תפקודית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R35-GM128625 כדי J.I.F.B.].

1. תכשירים
<ol><li>
Sc-−U-−H-צלחות (צלחות פטרי 150 מ מ) הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול זני שמרים את הדנ א-פיתיון.<ol>
<li>להמיס את הנשירה תערובת בסיס חנקן שמרים (YNB), hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH M 5 (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה; ראה בטבלה 2 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.</li>
		<li>בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).</li>
		<li>אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.</li>
		<li>ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, מגניב עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
		<li>להוסיף את לאוצין, טריפטופן את התקשורת. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות 150 מ מ (~ 80 מ לכל מנה). יבש 3-5 ימים בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, וכדי לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צלחות מלבניות YAPD הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול הדשא לזן של ה-DNA-פיתיון ועבור הזדווגות עם אוסף מערך TF.<ol>
<li>להמיס אבקות (ראו טבלה 3 עבור הרכב), למעט אגר, ב- 950 מ"ל בקבוקון 2 ל' מים ולהוסיף בר מערבבים.</li>
		<li>בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).</li>
		<li>אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.</li>
		<li>ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק.</li>
		<li>להוסיף את הסוכר, מערבבים טוב על מערבבים בצלחת של מגניב עד 55 מעלות צלזיוס. שופכים את המדיה לתוך הצלחות מלבני (ראה טבלה של חומרים; ~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה עד 6 חודשים. הערה: למרות שעוצמת media המוצע הוא 70 מ לכל צלחת, 50-80 מ לכל צלחת יכול לשמש. בעיות קריטיות שלושה לשקול מתי שוטף צלחות 1) כי החלקתן כך התקשורת אגר יש עובי אותה ברחבי הבסיס (השתמש בטבלה מפולס או משטח למזיגה צלחת ויוצקים לא בערימות של יותר משבע צלחות) 2) כדי לוודא העדר של בועות אגר המדיה (בועות צריך להיות popped באמצעות מחט סטרילית) ו- 3) ייבוש הלוחות ליום אחד בלבד והגלישה הלוחות בשקיות פלסטיק כדי למנוע כשלים להצמדת שמרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp ו- Sc −U −Trp צלחות מלבניות הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול האוסף מערך TF (Sc −Trp) וכדי לבחור שמרים דיפלואידי לאחר ההזדווגות (Sc −U −Trp).<ol>
<li>להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH 5 מ' (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה) (ראה טבלה 4 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.</li>
		<li>בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).</li>
		<li>אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.</li>
		<li>ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף את לאוצין, היסטידין אורציל (להשמיט את אורציל עבור לוחות −Trp −U Sc).</li>
		<li>לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות מלבניות (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבת סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. מתייבשים ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף את הצלחות בשקיות פלסטיק, לאחסן בחדר קר עד 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −U −H −Trp + 3AT + צלחות מלבניות X-גל הערה: הצלחות האלה ישמש בתור readout לוחות עבור מבחני eY1H.<ol>
<li>להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט ב- 850 מ ל מים (ראה טבלה 5 עבור הרכב). לא pH. שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.</li>
		<li>בבקבוקון 2 ל' השני, להוסיף את אגר 850 מ ל מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).</li>
		<li>אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.</li>
		<li>הכינו 10 x BU מלחי (1 ליטר) על ידי שילוב של 900 מ ל מים, 70 גרם של נה2HPO4∙7H2O ו- g 34.5 NaH2PO4∙H2O. לערבב באמצעות בר מערבבים כדי להמיס אבקות ולהתאים את רמת החומציות אל 7.0 באמצעות 5 M NaOH. מוסיפים מים כדי להביא 1 ליטר, תא לחץ.</li>
		<li>הכינו את הפתרון X-גל על-ידי הוספת 3.5 גר' אבקה X-גל צינור פלסטיק 50 מל המכיל 42.5 מ של דימתיל formamide. להוסיף אבקת X-גל דימתיל formamide כדי להמיס בקלות רבה יותר (זה לוקח 30 דקות). שמור פתרון מניות בחושך (שימוש אטום 50 מ ל צינור או לכסות בנייר). חנות ב-20 ° C.</li>
		<li>ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. הוסף את הגלוקוז 10 x BU מלחי (ראה טבלה 5 עבור הרכב), לערבב היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף את לאוצין, 3AT X-גל (לקבלת הרכב, ראה טבלה 5 ).</li>
		<li>לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך הצלחות מלבני (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה מכוסה בנייר אלומיניום (3AT ו- X-גל הם רגיש אור) עד כחודש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. איתור מערך TF
<ol><li>
מפשיר את המערך TF-טרף
	<ol>
<li>הפשרת שמרים גליצרול צלחות מניות עם המערך TF-טרף על קרח. הערה: ניתן להפיק TF-טרף מערכים כמו שפורסמו בעבר10,12,13,18.</li>
		<li>Resuspend שמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים בתוך 1-3 דקות לפני השלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הבחינה השמרים לתוך Sc −Trp צלחות מלבניות
	<ol>
<li>ב HDA הרובוט (ראה טבלה של חומרים), בחר 96 צלחות רב טוב כמו המקור, פלטות אגר 96 היעד, וכן סיכת ארוך 96 רפידות. הערה: רפידות pin אינם לשימוש חוזר, צריכים להיות מושלך.</li>
		<li>בחר את התוכנית לשכפל רבים לעשות שני עותקים לכל צלחת 96-ובכן. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע זיהום האחורי של המניות קפוא.</li>
		<li>בחר באפשרות הכוריאוגרף למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.</li>
		<li>תיק המערך מנומר, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יצירת מערכים המושבה 384 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
	<ol>
<li>הרובוט, בחר פלטות אגר 96 כמו המקור, צלחת אגר 384 כמטרה 96 רפידות פין קצר.</li>
		<li>בחר את התוכנית מערך 1:4 . בדרך זו, מאוחדים המושבה 96 ארבע צלחות (המכילים כל אחד של TF שונים) לתוך צלחת אחת 384 המושבה. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע תקשורת בין לוחות שונים.</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 384-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יצירת מערכים המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות הערה: זה יגרום מערכים המכילים ארבע המושבות TF-םימעפ.<ol>
<li>הרובוט, בחר פלטות אגר 384 בתור מקור הלוחות אגר 1,536 כמטרה, רפידות פין קצר 384.</li>
		<li>בחר את התוכנית מקור יחיד וזמינותו של 1:4. המטרה היא להעתיק את כל המושבה אל ארבע המושבות כדי להשיג quadruplicates. השתמש המיחזור ואת revisit אפשרויות כפי שהוא כרוך בהעתקת ארבע פעמים כל המושבה.</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגברה המערך המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
	<ol>
<li>הרובוט, בחר פלטות אגר 1,536 כמו המקור, פלטות אגר 1,536 כמטרה 1,536 רפידות פין קצר.</li>
		<li>בחר את התוכנית רבים לשכפל לשכפל עותקים 3-4. השתמש המיחזור, ולבקר את האפשרות, אבל לזרוק את משטח כאשר מחליפים צלחת שונה של המערך כדי למנוע זיהום לחצות.</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים להשתמש להזדווגות שלבים (ראו להלן). לאחר מכן, שמור את הצלחות בטמפרטורת החדר, העתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב חדש של ההקרנה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H מסך
<ol><li>
הכנת ה-DNA-פיתיון זן דשא להזדווגות
	<ol>
<li>במקום השמרים DNA-פיתיון זנים על צלחת −H −U Sc ולגדול במשך 3 ימים ב- 30 ° C.</li>
		<li>צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים זנים שונים של 12-16. דגירה אחת ביום 30 ° C.</li>
		<li>צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים 4 זנים שונים. תקופת דגירה של יום אחד ב- 30 ° C.</li>
		<li>לגרד את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, מקפיד לא לגרד כל אגר ולהוסיף לתוך צינור 1.5 עם 500 µL של מים סטריליים.</li>
		<li>להוסיף 10 – 15 חרוזי זכוכית סטריליים על צלחת מלבנית YAPD. הוסף את המתלים שמרים לצלחת ומנערים ביסודיות בכל הכיוונים עבור 1 דקות להבטיח שהשמרים היא התפשטה דרך כל הלוח.</li>
		<li>הפוך את הצלחת מיד והקש על כך החרוזים לעבור המכסה. הסר ולאחר למחזר את החרוזים.</li>
		<li>לוחיות הרישוי ועם תקופת דגירה אגר בצד למטה של 1 – 2 ימים ב- 30 ° C. לאחר מכן המשך לשלב ההזדווגות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ההזדווגות של שמרים DNA-פיתיון וללחצים מערך TF
	<ol>
<li>להעביר את המערך TF צלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . כל צלחת מערך TF ניתן להעביר ל 3-4 צלחות YAPD (בהתאם למספר הצלחות במערך). מערך TF הגלופות המשמשות להזדווגות חייב להיות בן 2-3 ימים אבל לא יותר כמו ההזדווגות עשוי להיות לא יעיל.</li>
		<li>להעביר את הדשא של זן ה-DNA-פיתיון הלוחות YAPD כבר המכיל את המערך TF עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . השימוש של ההיסט המקרי במקור עם רדיוס של ~0.6 מ מ כדי למנוע לוקח שמרים מאותה נקודה ומערבבים על המטרה כדי להקל על הקשר בין זני שמרים. השתמש את הדשא שמכילות את הדנ א-פיתיון (סעיף 3.1) כמקור ולאחר הלוחות YAPD המכיל את המערך TF הבחין בשלב 3.2.1 כמטרה.</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עבור יום אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הבחירה של שמרים דיפלואידי
	<ol>
<li>העבר את השמרים ובסיומה מן הלוחות YAPD Sc −U −Trp צלחות עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל . מערבבים על מקור ועל המטרה.</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 – 3 ימים (זמן דגירה מוביל לפעילות כתב רקע).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להעביר readout צלחות
	<ol>
<li>העבר את השמרים דיפלואידי מן הלוחות −Trp −U Sc readout צלחות מלבניות Sc −U −H −Trp + 3AT 5 מ מ + 0.4 מ מ X-גל השימוש ברובוט. בחר את הצלחות אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל .</li>
		<li>תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עד 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה של הבדיקה צלחות
	<ol>
<li>עבור זנים DNA-הפיתיון עם רקע עיתונאי פעילות, לצלם תמונות בימים 2, 3 ו- 4. אחרת, לצלם תמונות ימים 4 ו-7. אינטראקציה חיובית מזוהים על ידי צמיחה וצבע כחול של המושבות שמרים, יכול להיקבע באופן ידני, או ניתן לקבוע באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+transcription+factors%3A+function%2C+expression+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Transcription+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-centered+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li>
<li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li>
<li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li>
<li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li>
<li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li>
<li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50(2012).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li>
<li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li>
<li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

EY1H רובוטית ההזדווגות ההקרנה הגישה המתוארת כאן במידה רבה מגדילה את התפוקה כדי לזהות את קבוצת TFs לאגד לאזור ה-DNA של עניין, לעומת ההקרנה ספריה הקודמים או הקרנה ערוכים גישות המבוסס על שינוי. יתר על כן, את האינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H מבחני הם מאוד לשחזור, כמו 90% של אינטראקציות שזוהו הן חיובית עבור כל המושבות ארבע בדיקות לכל TF, 90% של אינטראקציות תבדקי במסך עצמאית של אותם שמרים DNA-פיתיון זן10 , 12 , 19. יותר חשוב, אינ...

בעיה מרכזית בתחום הביו-רפואי הוא בקביעת המנגנון שבאמצעותו מוסדר כל הגן האנושי. תמלול היא הצעד הראשון בשליטה על רמות ביטוי גנים, זה מוסדר על ידי קבוצות של גורמי שעתוק (TFs) ייחודיים לכל הגנים. נתון כי בני אדם קידוד עבור > 1,500 TFs1,2, המזהה את הערכה המלאה של TFs השולטים הביטוי של כל הגן נותר אתגר פתוח.
שני סוגים של שיטות יכול לשמש כדי למפות TF-DNA אינטראקציות: שיטות ממורכז TF וממורכז הדנ א3 (איור 1 א'). בשיטות TF ממורכז, TF עניין הוא נחקר עבור איגוד לאזורים דנ א גנומי או כדי לקבוע שלה ירידה לפרטים איגוד ה-DNA. שיטות אלה כוללות immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ואחריו רצף תפוקה גבוהה, מיקרו-מערכים מחייב חלבון ו- SELEX4,5,6. בשיטות ממורכז דנ א, רצף ה-DNA של עניין הוא נחקר כדי לקבוע את קבוצת שר זה לאגד רצף ה-DNA. אפלייד נרחב ביותר של שיטות כאלה היא מבחני שמרים אחד-היברידית (Y1H), באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב הגנים7,8,9.
מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן כתב ג'ין הפעלה9,10 (איור 1B). דנ א-הפיתיון שוכפל במעלה הזרם של כתב שני גנים (LacZ ו HIS3) וקבועים DNA-bait::reporter שני משולבים לתוך הגנום שמרים ליצירת chromatinized 'DNA-פיתיון זנים.' TF-הטרף, המקודדת על פלסמיד המבטאת של TF התמזגו לתחום הפעלה (AD) של השמרים Gal4 TF, מוחדרים המתח DNA-פיתיון לדוג עבור אינטראקציות TF-DNA. אם TF-הטרף נקשר רצף ה-DNA-פיתיון, ואז המודעה נוכח TF-הטרף יוביל להפעלת שתי גנים כתב. כתוצאה מכך, תאים עם השפעה חיובית הדדית יכול להיות שנבחר עבור הצמיחה על צלחות חסר היסטידין, כמו גם התגברות על מעכב תחרותי, 3-אמינו-1,2,4-triazole (3-AT), דמיינו כמו מושבות כחול בנוכחות X-גל. כי חזק שמרים Gal4 לספירה משמש, מבחני Y1H יכול לזהות אינטראקציות מעורבים activators תעתיק וכן repressors. בנוסף, לאור העובדה TF-הטרף באים לידי ביטוי של מקדם חזק שמרים (ADH1), ניתן להבחין אינטראקציות אפילו בשביל TFs בעלי רמות ביטוי אנדוגני נמוכה, אשר הם מאתגרים לזהות על-ידי שבב11,12.
ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מבחני Y1H מבוססים על ידביקו TF-הטרף זנים DNA-פיתיון שמרים בהפיכת ספריות TF-טרף במאגר עקב בחירה, המושבה איסוף, ורצף כדי לזהות את TF אינטראקציה, או על ידי שינוי צורה של הפרט שיבוטים8,9. אלה הם פרוטוקולי גוזלת זמן, הגבלת מספר רצפי דנ א יכול להיבדק לכל חוקר. שיפור האחרונות של מבחני Y1H, שנקרא משופרת Y1H (eY1H), גדל באופן דרמטי את התפוקה הקרנה באמצעות פלטפורמה רובוטית של המערך (HDA) צפיפות גבוהה להזדווג זני שמרים DNA-הפיתיון עם אוסף של זני שמרים כל ביטוי שונה TF-טרף10,13 (איור 1C). המסכים הבאים מעסיקים של המושבה 1,536 פורמט המאפשר מבחן TFs האנושי ביותר באמצעות לוחות רק שלוש ארבע פעמים. עוד יותר, בהתחשב בעובדה TF-DNA אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, גישה זו מאפשרת להשוואת אינטראקציות בין DNA-פיתיונות (כגון שתי גרסאות noncoding נוקלאוטיד יחיד) ובין שר אחר או TF גרסאות11,12 ,14.
באמצעות מבחני eY1H, לנו יש מאפשרת את האדם הגדול ואת Caenorhabditis elegans ממורכז DNA TF-DNA אינטראקציות רשתות עד היום. בפרט, זיהינו 2,230 אינטראקציות בין 246 משפרי התפתחותית האנושי 283 TFs12. יתר על כן, יש לנו עובדים eY1H מבחני לחשוף מחייב TF שינו 109 נוקלאוטיד יחיד noncoding משתנים הקשורים עם מחלות גנטיות כגון מום התפתחותית, סרטן, הפרעות נוירולוגיות. לאחרונה, השתמשנו eY1H על רשת הכוללת 21,714 אינטראקציות בין היזמים ג'ין C. elegans 2,576 366 TFs11. רשת זו הייתה לחשוף את תפקיד פונקציונלי של עשרות TFs C. elegans .
הפרוטוקולים להפיק DNA-פיתיון כתמי ולהעריך את הרמות של פעילות עיתונאית הרקע היה דיווח במקום אחר15,16,17. כאן, אנו מתארים של צינור eY1H יכול לשמש למסך בכל אזור דנ א גנומי האנושי נגד מערך של 1,086 TFs אנושי. ברגע שמרים DNA-פיתיון המתח נוצר מערך TF-טרף ניצפית על גבי הלוחות המתאימים, ניתן לבצע פרוטוקול כולו בעוד שבועיים (טבלה 1). וחשוב מכך, יכול להיות parallelized הפרוטוקול כך חוקר יחיד. באפשרותך לסנן רצפי DNA-פיתיון 60 בו זמנית. כדי להדגים את הפרוטוקול, הוקרנו היזמים של שני גנים ציטוקינים CCL15 ו- IL17F. בנוסף, אנו מראים תוצאות המסכים שנכשלו להמחשת סוגי הבעיות שעלולות להתעורר בעת ביצוע מבחני eY1H וכיצד לפתור אותם.

<table><tbody><tr><td>3-אמינו-1,2,4-טריאזול (3AT) ~95% TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>מעכב תחרותי למוצרים של הגן HIS3</td></tr><tr><td>אדנין סולפט (המיסולפט), דיהידראט</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>נדרש לגידול שמרים תקין</td></tr><tr><td>אגר חוזק ג'ל גבוה - דרגה בקטריולוגית</td><td></td><td>אמריקאית בינלאומית AGHGUP</td><td>חומר תזונתי לגידול שמרים</td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>מקור חנקן במדיה שמרים סינתטית</td></tr><tr><td>D+ גלוקוז נטול מים</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>נדרש לגידול שמרים</td></tr><tr><td>תערובת נשירה מינוס His, Leu, Tryp ו-Uracil, עשיר באדנין ללא בסיס חנקן שמרים</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>מדיה שלמה סינתטית נדרשת לקצה גידול שמרים</td></tr><tr><td>מד pH רב-פרמטרי</td><td>Hanna</td><td>Instruments HI2020-01</td><td>למדידת pH של מדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>קיסמים שטוחים 750 קראט</td><td>יהלום</td><td></td><td>לפס שמרים על</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>וולטר שטרן</td><td>100C</td><td>כדי לסחוט שמרים בעת הכנת מדשאות</td></tr><tr><td>גליצרול &ge; 99%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>נדרש לייצור מלאי שמרים קפואים</td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>N, N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>להכנת תמיסת X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>לחלוקת כמויות מדויקות של מדיה לתוך צלחות זינגר</td></tr><tr><td>פפטון, בקטריולוגי</td><td>אמריקאי בינלאומי</td><td>כימי PEBAUP</td><td>מקור חלבון נדרש לגידול שמרים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, 150 מ"מ x15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>לגידול פיתיונות שמרים עבור הקרנה</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>לייצור צלחות אגר מלבניות לשימוש עם Singer Robot</td></tr><tr><td>דיוק בטמפרטורה נמוכה BOD חממה מקוררת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>לדגירת צלחות שמרים בטמפרטורה קבועה</td></tr><tr><td>RePads 1,536</td><td>קצר Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>כדי להעביר את מערך הטרף TF, להזדווג עם שמרים ולהעביר שמרים ללוחות בחירה וקריאה דיפלואידיים</td></tr><tr><td>RePads 384 Singer Instruments קצרים</td><td></td><td>REP-004</td><td>להעברת מערך TF-prey מ-384 ל-1,536 פורמט מושבה</td></tr><tr><td>RePads 96</td><td>Singer Instruments</td> ארוך <td>REP-001</td><td>להעברת מערך טרף TF ממלאי גליצרול לצלחת אגר</td></tr><tr><td>RePads 96</td><td>קצר Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>להעברת מערך טרף TF מפורמט מושבה 96 ל-384</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR רובוט</td><td>Singer מכשירים</td><td></td><td>להעברת שמרים בצורה בעלת תפוקה גבוהה</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (כדורים/ACS מוסמך)</td> <td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>להתאמת pH של מדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>נדרש לפעילות מדווח LacZ ב-X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-202342B</td><td>נדרש לפעילות מדווח LacZ ב-X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td> <td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&-galactosidase הופך לכחול X-gal חסר צבע לזיהוי אינטראקציה בין חלבון ל-DNA</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>מדיום מזין לגידול והתפשטות שמרים</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים (אבקה) ללא AA, פחמימות וללא AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>נדרש לגידול שמרים נמרץ</td></tr></tbody></table>

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

זיהוי קבוצות גורמי שעתוק (TFs) המסדירים כל הגן האנושי היא משימה מרתיעה הדורש שילוב של גישות ניסוייות וחישוביות רבים. שיטה אחת כזו היא וזמינותו (Y1H) אחד-היברידית שמרים, באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב גנים. מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל., היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן על הפעלת גנים כתב. ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מסכי Y1H מבוססים על להפוך ספריות TF-טרף או מערכים זני שמרים DNA-פיתיון. כאן, אנו מתארים צינור, שנקרא Y1H משופרת (eY1H) מבחני, איפה TF-DNA אינטראקציות הם שנחקרו על-ידי הזדווגות זנים DNA-הפיתיון עם אוסף ערוכים של זנים TF-טרף באמצעות מערך צפיפות גבוהה פלטפורמה רובוטית (HDA) המאפשר הקרנה ב- 1536 תבנית של המושבה. דבר זה מאפשר עלייה דרמטית בערך תפוקה (רצפי DNA-פיתיון 60 נגד > 1,000 TFs לוקח שבועיים לכל חוקר) ו הפארמצבטית. אנו מדגימים סוגים שונים של התוצאות הצפויות על-ידי בדיקת יזם האנושי רצפים נגד מערך של 1,086 TFs האנושית, כמו גם דוגמאות של בעיות שעשויות להתרחש במהלך מסכי וכיצד לפתור אותם.

שלושה גורמים עיקריים יש לשקול בעת ניתוח תוצאות מבחני eY1H: הפעילות העיתונאית רקע של המתח DNA-פיתיון, עוצמת הפעילות העיתונאית המתאים TF-DNA אינטראקציות, ואת מספר מושבות חיובי. הפעילות העיתונאית רקע (קרי: autoactivity) של המתח DNA-פיתיון מתייחס הצמיחה הכללי ואת הצבע של המושבות שמרים בצלוחית readout, אפילו בהיעדר TF-טרף. באופן אידיאלי, זנים שאינם autoactive להראות על רקע לבן או בהיר צבע חום, עם מושבות עבור אינטראקציות חיוביות להיות גדול וכחול. Autoactive DNA-פיתיון זנים הצג צמיחת שמרים מדיה חסר היסטידין, צבע כחול בנוכחות X-...

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של > 1,000 TFs בניסוי יחיד.

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

המטרה של בדיקות שמרים חד-היברידיות משופרות היא לזהות את קבוצת גורמי התמלול הנקשרים לרצף DNA של עניין. היתרון של טכניקה זו הוא כי שמרים משופרים אחד היברידית assays יכול להעריך יותר מ 1000 גורמי שעתוק בניסוי אחד. לעומת זאת, אימונופרציפציה כרומטין מעריך רק גורם שעתוק אחד בכל פעם.שיטה זו מהווה כלי מפתח עבור גנומיקה תפקודית כדי לזהות את הרפרטואר של גורמי שעתוק הנקשרים מקדמי גנים משפרי ולזהות גורם שעתוק שונה מחייב וריאנטים שאינם קידוד. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שינג ליו פוסט-דוק מהמעבדה שלי. להפשיר את צלחות מלאי גליצרול שמרים עם מערך טרף TF על קרח.השתמשו מחדש בשמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים והמשיכו לשלב הבא תוך 1 עד 3 דקות. כדי לזהות את השמרים ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, השתמש ברובוט מערך בצפיפות גבוהה כדי לבחור 96 צלחות multiwell כמקור, 96 צלחות אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה ארוכות. רפידות סיכה אינן ניתנות לשימוש חוזר ויש להשליך אותן.בחר את התוכנית ספוט רבים כדי ליצור שני עותקים לכל 96 גם צלחת. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום אחורי של המניות הקפואות. כמו כן, בחר את האפשרות להסתחרר למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.בצע את ההוראות איפה ומתי למקם את הצלחות ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך Sc מינוס טריפטופן צלחות מלבניות. לארוז את המערך המנוקד ולהדגירה אותו בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. כדי ליצור 384 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 96 צלחות אגר כמקור, 384 צלחת אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה קצרות.לאחר מכן בחר את תוכנית המקור היחיד של המערך 1:4. בדרך זו, ארבעה 96 לוחות מושבה יתאחדו לצלחת מושבה אחת 384. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום בין צלחות שונות.לארוז את הצלחות ותדגר את הצד המנוקד של מערך 384 המושבות אגר ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. כדי ליצור 1536 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 384 צלחות אגר כמקור, את צלחות אגר 1536 כיעד, ו 384 רפידות סיכה קצרות. לאחר מכן בחר בתוכנית המקור הבודדת של 1:4.המטרה היא להעתיק כל מושבה לארבע מושבות כדי להשיג פי ארבעה. השתמש באפשרויות המיחזור והבקרה מחדש מכיוון שזה כרוך בהעתקת כל מושבה 4 פעמים. בצע את ההוראות של הרובוט ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך הצלחות לפני אריזה ודגירה של צד מערך המושבה המנוקד 1536 אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.כדי להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 1536 צלחות אגר כמקור, 1536 צלחות אגר כמטרה, ו 1536 רפידות סיכה קצרות. בחר בתוכנית 'שכפל רבים' כדי לשכפל 3 עד 4 עותקים. השתמש באפשרות מיחזור ובקר שוב אבל לזרוק את הפנקס בעת מעבר לצלחת אחרת של המערך, כדי למנוע זיהום צולב.אפשר לרובוט להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן. לבסוף, שקית הצלחות הדגירה הבחין 1536 המושבה מערך אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים כדי להשתמש עבור מדרגות הזדווגות. כדי להכין את מדשאות זן פיתיון DNA להזדווגות, לזהות את זני פיתיון שמרי DNA על צלחת Sc מינוס uracil והיסטידין ולגדול במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 12 עד 16 זנים שונים. דגירה הצלחת יום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. למחרת, רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 4 זנים שונים.דגירה את הצלחת ליום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מגרדים את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, ומוודאים לא לגרד אגר. מוסיפים את השמרים לצינור 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של מים סטריליים.עכשיו להוסיף 10 עד 15 קדילי זכוכית ותליית שמרים על צלחת מלבנית YAPD. לנער ביסודיות לכל הכיוונים במשך דקה אחת כדי להבטיח את השמרים מתפשטים לאורך הצלחת. הפוך את הצלחת מיד, והקש כך חרוזים ללכת למכסה.מוציאים וממחזרים את חרוזים. שקית הצלחות דגירה אותם בצד אגר למטה במשך 1 עד 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המשיכו לשלב ההזדווגות.כדי להזדווג עם פיתיון הדנ"א של השמרים וזנים במערך TF, העבר את מערך ה- TF לצלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את צלחת אגר 1536 כמקור ואת היעד, ואת כרית סיכה קצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'.בחרו 4 לוחות מקור ואת אפשרויות המיחזור והבחינה מחדש. ניתן להשתמש בכל לוחית מערך TF להעברת 3 עד 4 לוחות YAPD. לוחות מערך TF המשמשים להזדווגות חייבים להיות בני יומיים עד שלושה ימים, אך לא יותר מכיוון שהזדווגות עשויה להיות לא יעילה.כדי להעביר את הדשא של זן פיתיון DNA לצלחות YAPD שכבר מכילות את מערך ה- TF, בחר את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה ואת כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'. השתמש בהיסט אקראי במקור עם רדיוס של כ 0.6 מילימטרים כדי למנוע נטילת שמרים מאותה נקודה ובחר לערבב על היעד כדי להקל על מגע בין זני שמרים.השתמש במדשאה המכילה את זני פיתיון ה- DNA כמקור, ואת לוחות YAPD המכילים את מערך TF המנוקד כמטרה לפני אריזת הצלחות ודגירה אותם בצד אגר עד ב 30 מעלות צלזיוס ליום אחד. לבחירת שמרים דיפלואידים, בחרו את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה, ובחרו את כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר את התוכנית שכפול.בחר ערבב במקור ובמטרה. אפשר לרובוט להעביר את השמרים המוארים מצלחות YAPD ל- Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן לפני אריזת הצלחות ודגירה בצד אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. עכשיו, בחר את צלחות אגר 1536 כמקור ואת היעד ואת כרית סיכה קצרה 1536.בחר את התוכנית שכפול. מעבירים את שמרי הדיפלואידים מ-Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן ל-3-AT ו-X-gal המלבניים המכילים צלחות באמצעות הרובוט. לארוז את הצלחות דגירה אותם בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס עד 7 ימים.עבור זני פיתיון DNA עם פעילות כתב רקע גבוה, לצלם בימים 2, 3, ו 4. אחרת, צלם בימים 4 ו-7. שמור את לוחות מערך TF בטמפרטורת החדר והעתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב הקרנה חדש.כדי להמחיש את סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות מראות שמרים חד-היברידיים משופרים, אזורי האמרגן של הגנים CCL15 ו- IL17F הוסנו מול מערך של 1086 TFs אנושיים. מקדם CCL15 הוא דוגמה לפיתיון דנ"א לא אוטומטי, שבו ניתן לזהות בקלות אינטראקציות, אפילו חלשות. מקדם IL17F הוא דוגמה לפיתיון דנ"א אוטואקטיבי עם פעילות כתב רקע לא אחידה שבה ניתן לזהות אינטראקציות מסוימות, בעוד עבור מספר TFs, לא ברור אם פעילות הכתב גבוהה מהרקע.ישנן מספר בעיות שעלולות להתרחש בעת ביצוע בדיקות משופרות שמרים היברידית אחת. במקרה זה, המושבות קטנות מדי ולא הצליחו לעבור. בדרך כלל, כ-95% מהמושבות לטרף TF מציגות צמיחה תקינה.בדוגמה זו, אין צמיחה שמרים בחלק של הצלחת. בעיה זו קשורה בדרך כלל לכישלון בשלב ההזדווגות אם כרית סיכה 1536 אינו מצליח ליצור קשר עם השמרים במדשאת זן פיתיון DNA, במערך TF, או בצלחת ההזדווגות. בשתי דוגמאות אלה, לא מזוהות אינטראקציות.בעיה זו קשורה לעתים קרובות או מוטציות לא מכוונות בגנים הכתב, בפרט LacZ, או autoactivity גבוה מדי כי להסוות אינטראקציות. במקרה זה, הצלחת מציגה כתמים כחולים אקראיים אשר קשורה לעתים קרובות לזיהום חיידקי. הדבר החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון הוא הכנת צלחת נכונה.ודא כי כל הרכיבים מתווספים כי גובה אגר הוא אחיד כמו כל השלבים הבאים תלויים בכך. למרות שרוב reagents אינם מסוכנים, חשוב ללבוש כפפות בכל עת, כדי למנוע זיהום של דגימות וצלחות. כמו בכל בדיקת איגוד DNA, חשוב לאמת את האינטראקציות שזוהו באמצעות בדיקות תפקודיות כגון בדיקות עיתונאיות, הפלת גורם שעתוק או נוקאאוט, ואחריו מדידת ביטוי של גן היעד.שיטה זו אפשרה זיהוי של גורמי שעתוק המווסתים גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים מסוימים, כמו גם גורמי שעתוק עם קשירה חלופית לגרסאות הקשורות למחלות שאינן קידוד.

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לבנייה המהירה של גורמי שעתוק מלאכותיים (ATFs) עם כתבי ה-GFP מאותו מקור וכימות של יכולת ATFs כדי לעורר ביטוי של GFP באמצעות cytometry זרימה.

סינתזה והקרנה של גורמי שעתוק הופעל כימי עם כתבים המבוסס על ה-GFP מהיר

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

למדו את שיטת מסך אחד-היברידית משופרת בשרמרים לזיהוי גורמי שעתוק הקושרים לרצפי DNA אנושיים. שיטה זו מאפשרת סינון של יותר מ-1,000 גורמי שעתוק בניסוי אחד לחקר גנומיקה תפקודית.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

גלה סרטונים נוספים