Name: הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: למדו לגדל אנטרואידים אנושיים מרקמת מעי יילודית לחקר דלקת מעי נמקית. הפרוטוקול מציג בידוד תאי גזע מעיים, טיפול בליפופוליסכריד והערכת שינויים היסטולוגיים וגנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון של המוסד לביטוח לאומי של סוכרת, העיכול, גרנט מחלת הכליה (K08DK106450) ופרס ג'יי Grosfeld של האגודה האמריקאית כירורגי בילדים כדי C.J.H.

לאישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים הושג (IRB #2013-15152) עבור אוסף של דגימות רקמה של חולים שעברו כריתה מעי אן ו רוברט ה' לוריא לילדים החולים שיקגו, שיקגו, אילינוי. כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם הלאומית ולמוסדות הנחיות ותקנות לרווחת האדם. הסכמת ההורים הודיע בכתב היה נדרש וקיבלתי לפני איסוף הדגימה בכל המקרים.
1. מגיב הכנה
<ol><li>להכין פתרון מלאי תרבות המדיה עבור אוסף כל רקמה: 1 ליטר של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), 110 מ של העובר שור סרום (FBS), 11 מ של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%) ו- mL 1.1 של אינסולין מחוטא-מסנן (הריכוז הסופי 0.1%.) פתרון מלאי החנות ב 4 º C.</li>
	<li>הכנת מאגר Chelating #1: 30 מ של תרבות התקשורת (כפי שמתואר 1.1), 600 µL של 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (הריכוז הסופי 10 מ מ), 300 µL של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%) 60 µL של המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.</li>
	<li>הכנת מאגר Chelating #2: 30 מ של תרבות התקשורת (כפי שמתואר 1.1), µL 300 של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי 5 מ מ), µL 300 של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%) 60 µL של המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.</li>
	<li>להכין מדיה Minigut האנושית: 41.4 מ של DMEM/F-12, 5 מ של FBS (האחרון 10%), µL 500 של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), µL 500 של L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), µL 500 של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 µL של המפוטריצין (סופי ריכוז 0.2%), 500 µL של 1 מ' N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic חומצה (HEPES) (הריכוז הסופי 10 מ מ), תוספת של 500 µL של 100 x N-2, B-27 תוספת 1 מ"ל של 50 x פחות ויטמין A עבור הנפח הכולל של 50 מ ל. פתרון מלאי החנות ב-20 ° C.</li>
	<li>הכנת האדם השלם מדיה Minigut: 10 מ של האדם Minigut מדיה (מוכן ב- 1.4), 10 µL של 100 µg/mL Wnt3a (ריכוז סופי 100 ng/mL), 10 µL של µg/mL 100 הראש (ריכוז סופי 100 ng/mL), 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל R-Spondin (ריכוז סופי 1 µg/mL) , 10 µL של µg/mL 500 עוריות פקטורי גדילה (EGF) (ריכוז סופי 50 ng/mL), µL 10 1 M N-אצילוסיסטין (ריכוז סופי 1 מ מ), 10 µL 10 מ מ Y-27632 (ריכוז סופי 10 מיקרומטר), 10 µL של מיקרומטר 500 A-83 (ריכוז סופי 500 ננומטר), 10 µL 10 מ מ SB202190 (סוף ריכוז 10 מיקרומטר), 100 µL של 1 מ' Nicotinamide (הריכוז הסופי 10 מ מ) ו- µL 1 של מיקרומטר [leu] 100 15-גסטרין 1 (הריכוז הסופי 10 ננומטר). נפח כולל 10 מ"ל. פתרון מלאי החנות ב 4 º C. הערה: פתרונות יש להשתמש בתוך 48 שעות.</li>
</ol>2. קריפטה בידוד, ציפוי מרקמות כל
<ol><li>
בזמנו של אוסף בסוויטת פעיל, מקם את דגימת רקמה אנושית קטנה מעיים תוך קר Dulbecco של פוספט Buffered מלוחים (DPBS). לשטוף את הדגימה תוך קר DPBS עד ברור של צואה ודם. לאחסן הדגימה ב 4 ° C RPMI 1640 בינוני עד מוכן לבידוד הקריפטה. הערה: רקמות אפשרות לאחסן יותר מ 24 שעות.<ol>
<li>ודא כי הדגימה נקי של צואה ודם. באמצעות מספריים ויבתר עדין, להסיר את כל עודפי שומן או ניתוח קטעי/סיכות ועוד. שוקלים את הדגימה. הערה: המטרה עבור פיסת כ 0.75-2.5 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לחתוך את הדגימה לחתיכות 0.5 ס מ ומניחים ב30 מ"ל של Chelating מאגר #1 (כפי להכין בשלב 1.2).
	<ol>
<li>לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לסנן רקמות דרך 100 מיקרומטר תא מסננת ולמחוק את הזרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הוסף את הרקמה 30 מ של Chelating מאגר #2 (כמו להכין בשלב 1.3).
	<ol>
<li>לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לסנן רקמות דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולמחוק את הזרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפשרת 500 מ"ל של קרום המרתף מטריקס על הקרח לשימוש בשלב 2.8.</li>
	<li>
להוסיף רקמה 10 מ"ל של DMEM קר צינור חרוטי 50 מ ל ומנערים נמרצות על ידי יד 10 s.
	<ol>
<li>לסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולאסוף הזרימה (תווית #1). לשמור על צינור #1 על קרח.</li>
		<li>להוסיף רקמה אחרת 10 מ"ל של DMEM קר צינור חרוטי נפרד 50 מ ל ומנערים נמרצות בידי 10 s.</li>
		<li>לסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולאסוף הזרימה (תווית #2).</li>
		<li>חזור על שתי פעמים נוספות עד ישנם ארבעה צינורות חרוט עם הזרימה (שכותרתו צינורות #1-4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מסנן צינור #1 פתרון באמצעות מיקרומטר 100 תא מסננת והעברת זרם דרך לתוך צינור חרוטי 15מל (תווית #1). חזור על #2-4.
	<ol>
<li>צנטריפוגה 15 מ"ל צינורות #1-4 ב 200 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בשכונה זרימה שכבתית, הסר את תגובת שיקוע של צינורות #1-4 וזורקים. להימנע מהפרעה הענן של רקמת מיד מעל בגדר, גם אם זה אומר להשאיר את תגובת שיקוע קצת מאחור.
	<ol>
<li>מאת pipetting לאט, מערבבים יחד את גלולה עם ה99 supernatant צינורות #1-4.</li>
		<li>להעביר את התערובת משפופרות #1-4 לתוך שפופרת חרוט mL 2 יחידה אחת.</li>
		<li>Centrifuge צינור חרוטי ב x 200 גרם במשך 20 דקות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה ב 500 µL של מטריקס קרום המרתף. הערה: לשמור המטריקס קרום המרתף על קרח בכל עת ולעבוד במהירות על השלבים הבאים. מוצר זה polymerizes מהר מאוד בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>החל µL 50 של הדגימה/מרתף ממברנה מטריקס השעיה למרכז באר צלחת 24-. טוב. זה אמור להופיע בצורת כיפה. הערה: השימוש פיפטה צוננת טיפים מסייע בהעברת חלקה של ההשעיה, מזעור הפילמור.</li>
		<li>חזור על 9 פעמים כדי למלא בארות סה כ 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את הצלחת 24-ובכן 37 ° C, 5% CO2 החממה במשך 30 דקות לאפשר הפילמור.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של האדם Minigut מדיה מלאה (כפי להכין בשלב 1.5) כל טוב. החלף את כל יומיים.</li>
	<li>לאסוף את enteroids אחרי 5-10 ימים, כאשר ניצני הוא מדמיין. ראה השלבים 4 ו- 5 עבור אוסף הוראות.</li>
</ol>3. אינדוקציה של NEC ניסיוני
<ol><li>להוסיף 10 µL של 5 מ"ג/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) 500 µL של האדם Minigut מדיה מלאה (כפי להכין בשלב 1.5) היטב כל יום 0. החלף את כל יומיים עד אוסף.</li>
</ol>4. הכנה פרפין הטבעה
<ol><li>
הסר בעדינות את המדיה.
	<ol>
<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להמיס את המטריקס. קרום המרתף עם טיפול לא lyse את enteroids.</li>
		<li>צנטריפוגה PBS/enteroid תערובת ב < 300 x גרם עבור 5 דקות הצניפה ולהסיר PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 4% paraformaldehyde לתקן בטמפרטורת החדר מאובטח.</li>
	<li>
צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה ולאחר מכן הסר PBS.
	<ol>
<li>לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל ל- PBS, צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה ולאחר מכן הסר PBS.</li>
		<li>חזור על שלב 4.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ממיסים נפח מספיק של הרקמה עיבוד ג'ל (כ-300 µL) על ידי הצבת את הכמות הרצויה צינור חרוטי ומחמם זה ב חממה אמבט יבש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 3-10 דקות עד נוזלי.
	<ol>
<li>מוסיפים את הרקמה עיבוד ג'ל כדי בגדר ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>ב coverslip, במקום טבעת שיבוט קטן.</li>
		<li>Pipette הרקמה עיבוד ג'ל תערובת enteroid לתוך טבעת שיבוט רכוב על גבי coverslip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לאפשר את הרקמה עיבוד ג'ל תערובת enteroid לגבש ב 4 ° C עבור 1 h.
	<ol>
<li>להטביע את הטבעת שיבוט עם תערובת הקרושה לתוך 70% אתנול לקראת הטמעת פרפין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid אוסף עבור ה-RNA והפקת חלבונים
<ol><li>הסר בעדינות האנושי Minigut מדיה מלאה מכל קידוח.</li>
	<li>
להוסיף 1 מ"ל PBS, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להמיס את המטריקס קרום המרתף. יש להיזהר לא לבטל את enteroids.
	<ol>
<li>מניחים תערובת PBS/enteroid לתוך צינור חרוטי mL 2 סטרילי.</li>
		<li>צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה.</li>
		<li>הסר בעדינות PBS, מטפל לא כדי להסיר את enteroids.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלב סדרת 5.2 עוד פעמיים.</li>
	<li>להקפיא ב- 80 ° C עד מוכן חלבון ו/או מיצוי ה-RNA.</li>
	<li>ביצוע גנים ביטוי וחלבון בידוד של enteroids באמצעות לרביעיית ומבוססת-PCR וטכניקות מערביות סופג.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

רומן זה ex-vivo enteroid מעיים אנושיים המודל משמש שיטה שימושית לצורך המחקר של תפקוד מכשול מעי נמקית (NEC). שיטות עיבוד enteroid המובאת כאן הוסבו מעבודה קודמת של ד"ר מיסטי טוב, מייקל Helmrath, ג'ייסון ורטהיים10,11,12.
הפרטים סביב כל אוסף רקמה והתזמון של בידוד קריפטה הם השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה. רקמות חייב להיות שנאספו באופן מיידי בזמנו של כריתה פעיל ומעובדים לבידוד קריפטה ברגע הרקמה מגיע למעבדה. ...

Enteroids האנושי הם אקסית vivo מערכת תרבות תלת-ממדי שנוצר מתאי גזע מבודד כוכים מעיים של דגימות רקמה אנושית מעיים. מודל זה פורצת היה חלוץ מאת הנס Clevers et al. בשנת 2007, בעקבות הגילוי של Lgr5 + תאי גזע-כוכים של המעי הדק עכברים1. העבודה שלהם הונחו היסודות להקמת אקסית vivo תרבות אפיתל המעי סוגי תאים מרובים, זה יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. מאז התגלית, enteroids שימשו כמודל הרומן ללמוד פיזיולוגיה עיכול נורמלי, הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים כגון מחלות מעי דלקתיות, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי רפואה רגנרטיבית2.
השימוש של enteroids בתור אקסית vivo מודל לחקר פתופסיולוגיה מעיים יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות. מספר עשורים, היו בשימוש בבעלי חיים וקווים מונצחים תא נגזר סרטן המעי ללמוד פיזיולוגיה מעיים3,4,5. תרבויות תא בודד אינם מייצגים את הגיוון של סוגי תאים נוכח נורמלי אפיתל המעי, ובכך חסר לתא צולבות לדבר וספציפיות קטע-ביטוי חלבון, איתות, מחלה הנגרמת הפתוגן6. בתאי גזע enteroids להתמיין סרן סוגי תאים אפיתל כגון enterocytes, Paneth תאים, תאי גביע, תאים enteroendocrine עוד3. הם מפגינים קוטביות, לבצע פונקציות תחבורה אפיתל, וגם מאפשרים קטע המעי ירידה לפרטים6. מאז enteroids ניתן לסכם מספר סוגי תא אפיתל המעי האנושי, הם מסוגלים להתגבר על מגבלה זו מוכרת של מערכות מבוססות תאי סרטן. לאורך זמן, נגזרות של שורות תאים הם subcloned ולהתפתח שהפגינו גיוון רב יותר חלבון בלוקליזציה וביטוי3. להיפך, enteroids יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. אמנם קיימים מודלים רבים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. בשל מגבלות אלו, שמקורם בבעלי חיים הרפוי להיכשל 90% מהזמן כאשר נבדק בניסויים האנושי בגלל ההבדלים רעילות או יעילות3. Enteroids לשמש מודלים קליניים מבטיח כי ניתן להתגבר על ליקויים אלה, המוביל אל הבנה טובה יותר של מורכבות פתופסיולוגיה מעיים, לכן, ועוד חידושים טיפולית מוצלחת וחסכונית. יש גם ראיות האחרונות הגיל של רקמת כי enteroid מופק נשאר חשוב מבחינה ביולוגית7. זהו פרט חשוב במיוחד עבור המודל שלנו מאז enteroids נוצרות מרקמות neonatal, ובכך שומר על רלוונטיות הפיזיולוגיות לחולים עם NEC.
השירות של enteroids בתור מודלים של מחלות אנושיות ממשיכה להתרחב, בתקווה למצוא מרפא לתנאים חמורה ו נרחבת. דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית מעיים של neonates מאופיין נמק המעי וגורם לעתים קרובות לחירור של המעי קיר, הרעלת דם, מוות8. בשל פתופיזיולוגיה multifactorial ומורכבת של NEC, המכניזם המדויק של המחלה יש לא עדיין היה מלא מבואר; עם זאת, הגברת חדירות המעי היה בבירור מעורב תהליך המחלה8. נתון כי המחקר של NEC וסוכנים טיפולית פוטנציאל הוא מאתגר מבחינה אתית של ניסויים, במיוחד לילדים, רצוי מאוד לנצל את מודל enteroid רלוונטי מבחינה ביולוגית של NEC באמצעות רקמה אנושית neonatal. עד כה, enteroids יש תפקיד מוגבל במחקר של NEC. פרוטוקול זה מתאר את השימוש enteroids נגזר דגימות רקמה אנושית מעיים כמו רומן ex-vivo מודל לחקר נמקית.

<table><tbody><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27 מינוס ויטמין A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנת מרתף (מטריג'ל)</td> <td>קורנינג</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין-חומצה טראצטית (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ( L-גלוטמין)</td> <td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-גסטרין 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>11875093</td><td></td><td>אינוויטרוגן</td> בינוני</tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל לעיבוד רקמות (היסטוג'ל)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& די סיסטמס בע"מ</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>סיגמא</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

הרומן האנושי אפיתל enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית של יילוד תינוקות. זה מאופיין על ידי מספר שינויים pathophysiologic האפיתל מעיים אנושיים, המוביל אל הגברת חדירות המעי, ליקויי פיצוי, והגדילה מוות של תאים. למרות שיש רבים מודלים חייתיים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. יתר על כן, זה מאתגר מבחינה אתית ללמוד פתופסיולוגיה המחלה או הרומן סוכני טיפולית ישירות בנושאים אנושיים, במיוחד לילדים. לכן רצוי מאוד לפתח מודל הרומן של NEC באמצעות רקמה אנושית. Enteroids הם organoids תלת-ממדי שמקורם בתאי אפיתל המעי. הם אידיאליים עבור חקר אינטראקציות מורכבות הפיזיולוגיות, איתות התא ואת ההגנה פתוגן-פונדקאי. כתב יד זה נתאר פרוטוקול enteroids האנושי הזה תרבויות לאחר בידוד תאי גזע מעיים של חולים שעברו כריתה מעי. התאים קריפטה מתורבתים בתקשורת המכיל חומרים המעודדים בידול לתוך הילידים סוגי תאים שונים של האפיתל במעי האדם. תאים אלה גדלים תערובת סינתטית, סילוק של חלבונים לשמש לפיגום, מחקה קרום המרתף הסלולר במיוחד. כתוצאה מכך, enteroids לפתח קוטביות הפסגה-basolateral. ניהול משותף של ליפופוליסכריד (LPS) בתקשורת גורם לתגובה דלקתית enteroids, המוביל היסטולוגית, גנטית, וכן שינויים בביטוי חלבונים דומים לאלה לראות ב- NEC אנושי. מודל ניסיוני של NEC באמצעות רקמה אנושית עשוי לספק פלטפורמה יותר מדויק עבור תרופות וטיפול בדיקות לפני בניסויים בבני אדם, כאשר אנו שואפים לזהות תרופה למחלה זו.

מיד לאחר ציפוי, מופיעים כוכים מעיים טריים מבודד מוטות מוארך. בתוך שעות, יקבל enteroid בעל מראה עגול (איור 1). במשך מספר ימים, enteroids יתחיל ויוצרים כדורים כפי שניתן לראות באיור 1ב'. ניצני צריך להתרחש בין 5-10 ימים (איור 1c), אוסף enteroid צריכים להתרחש באותו הזמן.
Enteroids גדל גם תערוכת ...

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroids הם אורגנואידים תלת מימדיים שמקורם בתאי אפיתל במעיים. הם אידיאליים לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות, איתות תאים והגנה על פתוגן מארח. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לתרבת היכנסים אנושיים לאחר בידוד תאי גזע מעיים מחולים שעברו כריתת מעיים.ניהול שותף של lipopolysaccharide בתקשורת התרבות שלנו גורם לתגובה דלקתית ב enteroids המוביל לשינויים היסטולוגיים, גנטיים, וביטוי חלבון דומה לאלה שנראו ב enterocolitis נמק אנושי. בהתחשב בכך המחקר של enterocolitis נמק וסוכנים טיפוליים פוטנציאליים הוא מאתגר מבחינה אתית בנושאים אנושיים, במיוחד ילדים, רצוי מאוד לנצל את הרומן הזה, מודל enteroid רלוונטי ביולוגית של דלקת enterocolitis נמק באמצעות רקמת יילודים אנושית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי enteroids מסוגלים לסכם מחדש את סוגי התאים מרובים של אפיתל מעיים אנושי והם מסוגלים להתגבר על המגבלות המוכרות של מודלים בעלי חיים ומערכות מבוססות תאים.עוזר להדגים את ההליך יהיה כריסטי Buonpane, תושב כירורגית, וקארי יואן, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלנו. בזמן האיסוף בסוויטה האופרטיבית, מניחים את דגימת רקמת המעיים הקטנה האנושית ב- DPBS קר. לשטוף את הדגימה ב DPBS קר עד שהוא ברור של דם וצואה.יש לאחסן את הדגימה במדיום RPMI 1640 בארבע מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לבידוד קריפטה. כאשר מוכן להמשיך, לבדוק שוב כי הדגימה היא ברורה של צואה ודם. באמצעות מספריים ניתוח עדין להסיר כל עודף שומן או קליפים כירורגיים סיכות.משקל הדגימה ולכוון חתיכה כי הוא כ 0.75 כדי 2.5 גרם. לאחר מכן, חותכים את הרקמה לחתיכות 0.5 ס"מ וממקמים אותם בצינור המכיל 30 מיליליטר של חיץ כלטינג מספר אחד. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לסנן את הרקמה דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולהשליך את הזרימה דרך. מוסיפים את הרקמה המסוננת לצינור המכיל 30 מיליליטר של חיץ כלטינג מספר שתיים. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לסנן את הרקמה דרך מסנן 100 מיקרומטר ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן, להפשיר 500 microliters של מטריצת קרום מרתף על קרח לשימוש מאוחר יותר. מוסיפים רקמה ל-10 מיליליטר של DMEM קר בצינור חרוט 50 מיליליטר ומנערים במרץ ביד במשך 10 שניות.לסנן את ההשעיה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה דרך. תשאיר את הצינור הזה על קרח. מוסיפים קצת רקמה לעוד 10 מיליליטר של DMEM קר בצינור חרוט נפרד של 50 מיליליטר ומנערים במרץ ביד במשך 10 שניות.לסנן את ההשעיה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה דרך. חזור על התהליך פעמיים נוספות עד שיש ארבעה צינורות חרוט המכילים זרימה דרך שכותרתו אחת עד ארבע. לאחר מכן, לסנן את הפתרון בצינור מספר אחד דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר את הזרימה דרך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר גם שכותרתו מספר אחת.חזור על תהליך זה עבור צינורות 2 עד 4. צנטריפוגה צינורות 15 מיליליטר ב 200 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. במכסה המנוע לזרימה למינארית, הסר את העל-טבעי מכל צינור והשליך אותו.הימנע משבש את ענן הרקמה מיד מעל גלולה, גם אם זה אומר להשאיר כמה על טבעי מאחור. בכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה לאט לערבב את גלולה עם שאריות על טבעי. מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור חרוט וצנטריפוגה בודדים של שני מיליליטר ב-200 פעמים G וב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר מכן, להסיר את supernatant ולתלות את גלולה ב 500 microliters של מטריצת קרום מרתף מופשר מראש. השתמש טיפ פיפטה מצוננת להחיל 50 microliters של השעיה זו למרכז באר בצלחת 24 גם. דוגמה זו אמורה להופיע בצורת כיפה.חזור על תהליך יישום זה תשע פעמים כדי למלא 10 בארות סה"כ. מעבירים את צלחת ה-24 אינץ' לאנקובטור פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמיזציה. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מדיה מיניגוט אנושי להשלים לכל באר.המשך הדגירה באותם תנאים, הקפד להחליף מדיה זו כל יומיים. ראשית, להוסיף 10 microliters של LPS בריכוז של חמישה מיליגרם למיליליטר ל 500 microliters של מדיה מיניגוט אנושי להשלים בכל באר של הצלחת ביום אפס. המשך דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ולהחליף את המדיה בתוספת כל יומיים עד האיסוף.כדי להתכונן להטמיע פרפין, תחילה להסיר בעדינות את המדיה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS, בעדינות pipette למעלה ולמטה כדי להמיס את מטריצת קרום המרתף תוך הקפדה לא ללטף את enteroids. צנטריפוגה במהירות פחות מ 300 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה ולאחר מכן להסיר את PBS. הוסיפו 4% paraformaldehyde והניחו את הצינור בצד למשך שעה כדי לתקן בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה במהירות פחות מ 300 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה ולאחר מכן להסיר את paraformaldehyde. יש לשטוף בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה במהירות של פחות מ-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את ה- PBS.חזור על תהליך שטיפה זה עם PBS פעם אחת. מניחים את הכמות הרצויה של ג'ל עיבוד הרקמה לתוך צינור חרוט לחמם אותו באינקובטור אמבטיה יבשה ב 65 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד 10 דקות עד שהוא נוזלי. לאחר מכן, מוסיפים את ג'ל עיבוד הרקמה המומסת לכדור ומערבבים בעדינות.מניחים טבעת שיבוט קטנה לתוך כיסוי. פיפטה ג'ל עיבוד רקמות תערובת enteroid לתוך טבעת שיבוט כי הוא רכוב על כיסוי. אפשרו לג'ל עיבוד הרקמה ולתערובת ה-enteroid להתגבש בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן, להטביע את טבעת השיבוט עם תערובת מוצקה לתוך 70% אתנול כדי להתכונן להטמיע פרפין. מיד לאחר הציפוי, קריפטות המעיים המבודדות הטריות מופיעות כמוטות מוארכים. בתוך שעות enteroids ייקח על מראה עגול.במהלך הימים הקרובים יתחילו האנואידים ליצור ספירות. ניצנים צריכים להתרחש בין חמישה ל 10 ימים, וזה כאשר אוסף enteroid צריך להתרחש. הכניסות ההולכות וגדלות מפגינות גם קוטביות, המכילה לומן ריכוזי, גבול אפי ותחום בזיליקטרלי.Enteroids גם להראות שלמות מבנית המיוצגת על ידי cytoskeleton actin חזק. לאחר מספר ימים בתרבות, enteroids מטופלים LBS לחוות אפופטוזיס יותר יש תשואה נמוכה יותר מאשר קבוצת הביקורת. כפי שניתן לראות ב- NEC האנושי במודלים מורין של NEC, ביטוי מוגבר של אגרה כמו קולטן ארבע נמצא ENTEROIDs מטופלים LPS לעומת פקדים.Enteroids ניתן גם לאסוף עבור RNA והפקת חלבון באמצעות qRT-PCR הוקמה היטב וטכניקות סופג מערבי ביטוי גנים ובידוד חלבון יכול להתבצע.

a-novel-human-epithelial-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את התפתחות מחלת דלקת המעי הנמקית במודל אנטרואיד יילודים שמקורו באדם המושרה על ידי טיפול בליפופוליסכרידים. מודל זה עוזר לחקור פתופיזיולוגיה של המעי.

אינדוקציה של דלקת מעיים נמקית במודל אנטרואיד אפיתל אנושי

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית (NEC) ובידוד לאחר מכן של תאי חיסון למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד.

מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים...

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

הנגיף הסינציאלי הנשימתי האנושי (HRSV) יכול לגרום לברונכיוליטיס חמורה בתינוקות צעירים. חלק מהפתוגנזה של מחלת HRSV חמורה נגרמת על ידי התגובה החיסונית של המארח. גירוי של תאי חיסון אנושיים ראשוניים עם HRSV מספק מערכת מודל מהירה וניתנת לשחזור לחקר הפעלה של מסלולים דלקתיים וזיהום.

מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

למדו לגדל אנטרואידים אנושיים מרקמת מעי יילודית לחקר דלקת מעי נמקית. הפרוטוקול מציג בידוד תאי גזע מעיים, טיפול בליפופוליסכריד והערכת שינויים היסטולוגיים וגנטיים.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

גלה סרטונים נוספים