Name: פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: חקור שיטת פרוטאום ברוחב כימות לניתוח הומוגניות תיוג חלבונים ברמת מולקולה בודדת. השיטה מאפשרת זיהוי הטרוגניות תיוג שאינה נראית במדידות מסה ומובילה ליישומים דיאגנוסטיים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים Masae אונו, Kazuya נישימורה על ניסיוני סיוע וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי אוטם (JPMJPR15F7), יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות, Grants-in-aid יאנג מדענים (א) (24687022), מאתגר מחקר גישוש (26650055) של מחקר מדעי בתחומים חדשניים (23115005), יפן האגודה קידום המדע, ועל ידי המענקים של קרן המדע טקדה וקרן ההנצחה Mochida רפואי ומחקר התרופות. ס מאשר תמיכה מתוכנית RIKEN הבינלאומי תוכנית לשייך (IPA).

1. תא הכנה
<ol><li>לטפח הלה תאים בצלחת 10 ס מ- 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב- Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר המכיל 10% סרום שור בעובר.</li>
	<li>איסוף תאים גדל אקספוננציאלית, ברגע שהם הגיעו 70% confluency, בעקבות ההוראות בקרת האוויר17.<ol>
<li>לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (pH 7.4). הסר PBS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). דגירה 5 דקות ב 37 º C.</li>
		<li>לעקוב אחר ההתקדמות של דיסוציאציה התא על ידי מיקרוסקופ.</li>
		<li>ברגע תאים יתעגל תלושים מתוך קערה, להוסיף 4 מיליליטר מדיום הגידול, לשבור את הצטברות תאים על-ידי pipetting.</li>
		<li>לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 150 גר' 10 דקות בתוך שפופרת צנטרפוגה. הסר את המדיום, resuspend בגדר תא עם 5 מ ל x 1 PBS (pH 7.4).</li>
		<li>חזור על שלב 1.2.6. Resuspend התאים ב- PBS 1 x (pH 7.4) כדי ריכוז סופי של 106 תאים למ"ל באמצעות ספירת מספר בשלב 1.2.5. הערה: התליה תא ניתן aliquoted מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. חוזר מחזור ההקפאה/ההפשרה יש להימנע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. התא פירוק תיוג פלורסנט
<ol><li>להפוך את 10 מ"ל של lysing מאגר (0.1 M בוראט, 1% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) ו- 1% Tween 20). התאם ל pH 12 באמצעות 2 M NaOH. זהירות: NaOH מרוכזת היא מאכל. ללבוש כפפות מתאימים וכוסות בעת הכנת פתרון זה. הערה: ניתן לאחסן מאגר Lysing לשבוע עד אחד בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מיקס 100 μL של lysing מאגר עם μL 1 של 1 מ' dithiothreitol (DTT) ו- 4 μL של dimethylammonio 3-[(3-cholamidopropyl) 50%]-1-propanesulfonate (בחורים).</li>
	<li>לערבב 1 μL של התרבות תאים (כ-1,000 תאים) עם המאגר lysing מעורבות של שלב 2.2. Homogenize את הפתרון על-ידי pipetting באיטיות כדי למנוע בועות. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם עצבנות עדין. Homogenize מחדש את הפתרון על-ידי pipetting לאט.</li>
	<li>להוסיף 1 μL של 2 μg/mL Cy3 NHS-אסתר לצבוע. Homogenize את הפתרון על-ידי pipetting באיטיות כדי למנוע בועות. תקופת דגירה של 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין. הערה: ה-pH גבוה של מאגר זה גורם ניטרול של ליזין שאריות חלבונים, המוביל תגובתיות גבוהה יותר.</li>
	<li>חזור על התוספת של 1 μL של 2 μg/mL Cy3 NHS-אסתר לצבוע. Homogenize את הפתרון על-ידי pipetting באיטיות כדי למנוע בועות. תקופת דגירה של 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין. הערה: זה חזר על תוספת של צבע NHS-אסתר יכול להגביר את היעילות תיוג כי חלק לצבוע Cy3 NHS-אסתר הידרוליזה ולא לבטל את הפעלתם באמצעות ה-pH גבוה של המאגר התגובה.</li>
	<li>להסתגל pH 7.2 על-ידי הוספת μL 100 של 0.8 מ'-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה (HEPES)-NaOH pH 7.2 כדי להרוות את התגובה. Homogenize את הפתרון על-ידי pipetting באיטיות כדי למנוע בועות.</li>
	<li>הוסף 20 μL של 19 מ"ג/מ"ל ביוטין-(פוליאתילן גליקול (PEG))2-אמין, μL 5 של 20 מ"ג/מ"ל 1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Homogenize את הפתרון על-ידי pipetting באיטיות כדי למנוע בועות. תקופת דגירה של h 1 בחושך בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין. הערה: שלב זה biotinylation יש צורך לתקן את מולקולות חלבון על coverslip מיקרוסקופ צפיפות קבועה, עם הטייה לזן חלבון.</li>
	<li>להסיר unreacted ריאגנטים תיוג ולרכז את הדגימה באמצעות עמודת אולטראפילטרציה עם ניתוק kDa 10, ההוראות של היצרן. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
</ol>3. פרוטאום ההפרדה ושחזור
<ol><li>להוסיף 4 x מרחביות דוגמת המאגר (200 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 4% מרחביות, גליצרול 4% ו- 0.4% bromophenol כחול). הערה: כדי למנוע נזק לצבוע, המדגם חלבון צריך לא להיות מחומם כפי שנעשה מרחביות-דף רגיל, יש להשאירו בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבצע מרחביות-דף רגיל עבור המדגם חלבון וסולם מולקולרית, באמצעות ג'ל אקרילאמיד 20%. להעביר את הדגימה הג'ל על מתח קבוע (160 V) עד ההעברה הקדמי פשוט יוצא את הג'ל.</li>
	<li>תמונה של הג'ל כדי לזהות את המיקום של הלהקות חלבון (איור 3).</li>
	<li>גוזרים את החלקים ג'ל כולל שברים חלבון עניין בעזרת סכין חדה, בהתבסס על המיקומים הלהקה. Fractioning 16, 23, 55 ו 120 kDa פסגות, ובבית kDa 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 ו 136 – 226 האזורים מוצגים באיור3.</li>
	<li>תמצית חלבונים באמצעות dialyzer של electroelution עם גודל הנקבוביות של 6-8 kDa, ההוראות של היצרן. הערה: המדגם שחולצו ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ coverslip הכנה
<ol><li>להכין μL 200 אבידין מאגר (5 מ מ HEPES-NaOH pH 7.2, 10 ננוגרם למ"ל אבידין ו- 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA)) עבור כל דגימה.</li>
	<li>להכין coverslips של 22 מ"מ x 22 מ"מ ו- 0.15 מ מ עובי. לחשוף את coverslips מהאוויר פלזמה באמצעות מסך פלזמה המנקה 1 דקות לנקות ולהפעיל משטחים שלהם.</li>
	<li>המעיל coverslips עם אבידין מאת μL 200 ציפוי ספין אבידין המאגר באמצעות coater ספין למשך 5 שניות ב 500 סל ד, ואחריו 30 שניות ב- 1000 סל ד. דגירה על coverslips למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר להן להתייבש.</li>
	<li>היכונו coverslips המדגם חלבון.<ol>
<li>לדלל את הדגימה חלבון (מ- 3.5) 100 פעמים ב- 5 מ מ HEPES-NaOH pH 7.2.</li>
		<li>ΜL מקום 100 המדגם מדולל על פני השטח במרכז coverslip מצופים אבידין (מתוך שלב 4.3).</li>
		<li>דגירה בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את הפקד חיובי.<ol>
<li>המקום 100 μL של 10 ng/mL טהור ביוטין פלורסנט ב- 5 מ מ HEPES-NaOH coverslip pH 7.2 במרכז אבידין מצופה (מתוך שלב 4.3).</li>
		<li>דגירה בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: coverslip בקרה חיובית זה מספק צפיפות אבידין נקודות קשירה, אשר נמצא בשימוש כדי לחשב את לו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את הפקד שלילי.<ol>
<li>ספין-קואט הפלזמה לנקות coverslip עם μL 200 של 5 מ מ BSA HEPES-NaOH ו- 2 מ"ג/מ"ל (ללא אבידין).</li>
		<li>תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר להתייבש.</li>
		<li>להוסיף 100 μL של 10 ng/mL מטוהרים ביוטין פלורסנט 5 מ מ HEPES-NaOH pH 7.2.</li>
		<li>דגירה בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: coverslip שליטה שלילי זה מספק את הכמות של איגוד שאינם ספציפיים של ביוטין פלורסנט coverslip ללא אבידין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף כל coverslip עם 200 μL של מים מזוקקים על-ידי pipetting בקצוות של coverslip כדי לא לגעת אמצע coverslip עם הקצה. חזור על שטיפת זה שלוש פעמים. הערה: לאחר כ רפה בעברית מים על coverslip, מים מיד יוצב בחזרה על coverslip כדי למנוע את זה ממנו להתייבש לחלוטין.</li>
	<li>חושפים את האוויר פלזמה לאותו מספר על coverslips כמו שלב 4.2.</li>
	<li>מניחים את coverslip נקי על coverslip הדגימה מכורך מהשלב 4.7 כדי למנוע ייבוש.</li>
</ol>5. תצפית עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מולקולה בודדת
<ol><li>הפעלת מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב-שדה או evanescent. התראה: ישיר או קרינת לייזר פזורים יכול לגרום לעין או העור נזק. ללבוש משקפי מגן מתאימים, לחסום את נתיב אור לייזר. הערה: עבור ההתקנה מיקרוסקופ, עיין שלנו הפרסום הקודם16. בקצרה, מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב-שדה או evanescent מצוידים של ובעוצמת 488 ננומטר לייזר עירור, עדשה המטרה מפתח נומרי גבוהה, מצלמה רגישות גבוהה יכול לשמש עבור יחידת מידה זו. עוד, למדידה אוטומטיות, שלב מבוקר-מחשב מדגם translational XY, תריסי לייזר excitations מכני, מערכת מיקוד אוטומטי מומלץ להתקנה.</li>
	<li>להגדיר את coverslip על המיקרוסקופ וחפש את המוקד.</li>
	<li>בצע סריקה אריח כדי לקבל לפחות 100 תמונות. הערה: ההארה לייזר צריך להיות נשלט עם תריסים מכני להיחשף המדגם רק בעת הקלטת תמונות עם המצלמה, כדי למזער את photobleaching. אם קיימות דוגמאות רבות, מדידה אוטומטיות באמצעות תוכנת מחשב כדי לשלוט בהתקנים מיקרוסקופ מומלץ. כל תמונה בדרך כלל כולל 100 – 500 נקודות מולקולה בודדת כאשר משתמשים בעדשה המטרה 60 x.</li>
</ol>6. תמונת ניתוח והפקת מידע
<ol><li>אם התמונה לא שווה בגלל התבנית תאורה לייזר, לבצע עיבוד תמונה כדי לתקנה18.<ol>
<li>רוכשים את תמונת ייחוס על ידי מדידת עם מדגם coverslip המורכב בצורה אחידה-התפשטות צבע בעזרת מצלמה הגדרת כמו שלב 5.3.</li>
		<li>רוכשים תמונה נגדי על ידי מדידת עם אין עירור לייזר באמצעות מצלמת אותה הגדרה.</li>
		<li>לחסר כל ערך פיקסל כל תמונה לדוגמה, הייחוס עם הערך של התמונה היסט.</li>
		<li>מחלקים כל ערך הפיקסל של תמונות לדוגמה החיבור על-ידי ערך הייחוס החיבור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף תמונות שנרכשו כהלכה, להסיר את הרקע של התמונה.<ol>
<li>הסר תמונות המכילות צבירות פלורסנט גדולים באופן ידני.</li>
		<li>להסיר את הרקע של התמונה על-ידי החלת אלגוריתם בעקבות הכדור19 עם רדיוס הכדור של 50 פיקסלים בעזרת ImageJ20.</li>
		<li>חידוד תמונות על-ידי חיסור תמונות מטושטשות באמצעות ImageJ (לחדד את פונקציית תמונה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>נמצא וניתוח מולקולה בודדת כתמים בתמונות.<ol>
<li>לזהות נקודות מולקולה בודדת עם יין הסף אלגוריתם21 באמצעות ImageJ.</li>
		<li>לסנן כתמים עם פחות משני פיקסלים כדי לא לכלול רעש כהה של המצלמה, כתמים יותר מ 20 פיקסלים כדי לא לכלול מצבורים של חלבונים באמצעות ImageJ (רועי מנהל).</li>
		<li>לספור את מספר הנקודות של כל תמונה. באמצעות תמונות המתוקן (שלב 6.1.4), לנתח את ההארה סה כ עוצמות בתוך פיקסלים עבור כל נקודה באמצעות ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב והתפוסה תיוג (LO) באמצעות הנוסחה הבאה: LO = (מספר עבירות במדגם / מספר עבירות של הפקד חיובי) x 100</li>
	<li>לחשב את המספר הממוצע של צבעי פלורסנט מאוגדים מולקולה חלבון יחיד (n̄צבע).<ol>
<li>לנתח היסטוגרמה של עוצמות של כל נקודה. הערה: ההיסטוגרמה בדרך כלל יש מספר פסגות, ומייצג את שיא כל מספר שונה של מולקולות צבען מאוגדים חלבון. הראשון, השני והשלישי שיא בהיסטוגרמה מקביל מולקולות 1, 2 ו-3, בהתאמה.</li>
		<li>לחשב את העוצמה הממוצעת של ההיסטוגרמה. גם לחשב את עוצמת השיא של השיא הראשון על-ידי החלת התאמה לפי עקומת גאוס.</li>
		<li>חישוב n̄צבע על-ידי חלוקת העוצמה ממוצע עם עוצמת שיא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים את interest(s) הפיננסיים מתחרים הבאים: RIKEN הגיש בקשה לרישום פטנט על תוצאות אלו עם ס ו Y.T. בשם ממציאים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לכמת אחידות תיוג כל מין שכותרתו החלבון בתאים לאחר ההפרדה עם מרחביות-דף (שלב 3). ניתן להחליף את שיטת ההפרדה עם שיטות אחרות כגון כרומטוגרפיה נוזלית או אלקטרופורזה נימי, המאפשרים הפרדה, fractionation של החלבונים עם רזולוציה גבוהה, תוך דרישת ציוד מיוחד23. ניתן להחליף את שיטת תיוג באמצעות NHS-אסתר בפרוטוקול הנוכחי עם שיטות אחרות באמצעות maleimide-אסתר או נוגדנים, לדוגמה.
הדרישה תיוג הומוגניות ניתוח תלוי כמה תיוג סוטה תהליך אקראי פשוט, כמו ההנחה בניתוח י...

פרוטאום ניתוח, שמטרתו לכמת את כל סידרת מולקולות חלבון הביע בתא, היא גישה יקר במחקרים עדכניים ביולוגי ורפואי. ניתוח זה נפוץ מסתמך על ספקטרומטר מסה, אשר מזהה מינים חלבון מבוסס על הספקטרום שנוצר באמצעות חלבון יינון1,2,3. שיטה חלופית לניתוח פרוטאום הוא אלקטרופורזה, כולל לזיהוי בג'ל (עמוד), נימי אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל (2D). שיטה זו מתבססת על תיוג פלורסנט שאינם ספציפיים של כל מולקולות חלבון בתאים שנותחה, ואחריו electrophoretic ההפרדה, זיהוי, כימות של כל מיני חלבונים. כדי להשיג חלבון שאינם ספציפיים נדרש תיוג, אסטרטגיה אחת היא להשתמש צבעי פלורסנט ניתן לאגד חלבונים באמצעות אינטראקציות הידרופוביות אלקטרוסטטית, כגון כחול Coomassie ועברית4,5,6 . אסטרטגיית חלופית היא להשתמש תיוג קוולנטיות עם צבעי המכיל N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר או maleimide, אשר באפשרותך לאגוד covalently חלבונים באמצעות משקעים נפוצות כגון אמינים העיקרי תיולים, בהתאמה7, 8.
בינתיים, הרגישות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית הינו אידיאלי עבור ניתוח נמוכה-שפע חלבונים מספר קטן של תאים. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה היא אחת מהשיטות הרגישים ביותר המאפשר זיהוי הפרט צבעי פלורסנט, שכותרתו חלבונים חוץ גופית ו ויוו9,10,11,12, 13,14,15. היישום של שיטת ההדמיה מבוססת-אלקטרופורזה פרוטאום ניתוח צפוי לאפשר מבחני רגישה מאוד ומלאת כמותיים על ידי ספירת חלבונים בודדים עם התווית fluorescently. עם זאת, עדיין לא ברור תיוג עם צבעי פלורסנט היא הומוגנית מספיק על פני כל מולקולות חלבון, ואת ההשפעה הומוגניות זו על ידי חלבונים שונים מינים (איור 1). מדידות פתרון פשוט בצובר יכול לשמש כדי לקבל יחס טוחנת של צבעי פלורסנט כדי הנקרא "צימוד יעילות"8 או 'תיוג יעילות', אך מאפיין זה אינו מספק מידע על אחידות בין תיוג מולקולות חלבון.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול assay לחקור את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון בה תא (איור 2)16. שני השלבים המפתח הזה assay הם הדמיה וטיהור חלבונים. בשלב הראשון, כל החלבונים בתאים מסומנות fluorescently, biotinylated, ואז חילוץ בנפרד באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ואחריו electroelution. בשלב השני, קרינה פלואורסצנטית המאפיינים של מולקולות חלבון בודדים הדגימות שחולצו מוערכים בהתבסס על הדמיה מולקולה בודדת. מנתוני הזה, לצבוע פרמטרים חשובים לניתוח ספירה, כגון אחוז חלבונים המסומנת אחד לפחות, אשר אנו קוראים תפוסה (LO) תיוג16, המספר הממוצע של צבעי פלורסנט מאוגדים מולקולה של חלבון יחיד (n̄ צבע), ניתן לאפיין. בפרוטוקול, שגרת ממוטב עבור תיוג של פרוטאום הלה תא עם צבע 3 Cyanine (Cy3) המבוסס על אסתר NHS מוצג בתור דוגמה, שניתן יהיה לשנותה באמצעות הליכים אחרים תיוג בהתאם ליעדי המחקר הרצוי.

<table><tbody><tr><td>22x22x0.15 מ"מ כיסוי</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 ננומטר לייזר ארגון</td><td>קוהרנטי</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 ננומטר מראה דיכרואית</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488 ננומטר מסנן פליטה</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>560 ננומטר מסנן</td><td></td><td></td> פליטה Semrock Di02-R561 <td></td></tr><tr><td>560 ננומטר</td><td>Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 ננומטר לייזר סיבים</td><td>MBP תקשורת</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x עדשת טבילה בשמן</td><td>אולימפוס</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-PEG-אמין</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>ביוטינילציה Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borate</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-ester dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dialyzer&nbsp; - D-tube, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td> מצלמת EMCCD <td>נקלאי-טסק</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי Epi</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Gel viewer</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>תערובת פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטרצין ג'יבקו</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Diener אלקטרוני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>גודל טיהור עמוד 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

תא proteomes מאופיינים לעיתים קרובות באמצעות מבחני אלקטרופורזה, שבו כל המינים של חלבונים בתאי מסומנים בכיתוב הלא ספציפית הפלורסנט, הם הבחינו מאת photodetector בעקבות הפירוד שלהם. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה יכולים לספק זיהוי חלבונים העדינה יכולתה להמחשת מולקולות בודדות פלורסנט. עם זאת, היישום של שיטת הדמיה עוצמה אלקטרופורזה מבחני היא הקשו על ידי חוסר של דרכים כדי לאפיין את ההומוגניות של תיוג פלורסנט של כל מיני חלבונים על פני פרוטאום. . הנה, פיתחנו שיטה כדי להעריך את ההומוגניות תיוג פרוטאום בהתבסס על assay הדמיה קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת. במדידה שלנו באמצעות מדגם הלה תא, היחס של חלבונים עם צבע אחד לפחות, שבו אנחנו כינה 'תיוג תפוסה' תוויות (לו), היה נחוש בדעתו טווח של 50% ל 90%, תומך הפוטנציאל הגבוה של היישום מולקולה בודדת הדמיה כדי ניתוח פרוטאום רגיש ומדויק.

איור 4 מייצג את נתוני התמונה הגולמיים לשברים שונים משקל מולקולרי של חלבונים מן התא הלה lysate, כמו גם את הפקד חיוביים ושליליים. בעוד חלבון לדוגמה והן חיוביות לשלוט בנספח 100 – 500 נקודות לכל תמונה, הפקד שלילי מציג אף אחד או כמה נקודות, מראה כי הפרוטוקול מעכב מספיק שאינם ספציפיים קשירה של צבעי השטח coverslip. עוצמת ספוט היסטוגרמות הדגימות חלבון, הפקד חיובי להציג מספר פסגות, המייצג איגוד סטוכסטי של צבעים אמינים העיקרי חלבונים ו אבידין tetramer במבנים<sup class=...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

שיטה זו מדגימה את הכיול של כימות כמות החלבון בדגימה נוזלית עם תהליך מולקולה אחת לספירה. באופן ספציפי, זה יכול להמחיש כיצד אוכלוסיות חלבון ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי בכל רמת מולקולה. שיטות קודמות ביצעו מדידות בתפזורת כדי לנתח את היחסים הטוחנות של מולקולות פלואורסצנטיות וחלבונים, אך הן אינן יכולות לחשוף כיצד אוכלוסיות חלבונים הטרוגניות מסומנות בפועל.השיטות שלנו יכולות לעשות את זה ישירות ברמת המולקולה הבודדת. השיטה שלנו יכולה להיות מורחבת לכיוון בדיקות ריכוז מולקולריות רגישות ומתקדמות, שיובילו לשיטות אבחון עתידיות, ויאפשרו ממצאים יעילים של מולקולות פתוגניות בדגימות. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניתוח מיני חלבון יחיד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים, כמו גם ניתוח מינים מרובים באמצעות תוויות לא ספציפיות עבור כל החלבונים המופרדים על ידי אלקטרופורזה או כרומטוגרפיה.הנקודה הקריטית ביותר של הטכניקה היא קבלת שכפול נתונים. אני ממליץ לשמור על אותו מצב ניסיוני ככל האפשר בעת מדידת דגימות מרובות. הדגמה חזותית של טכניקה זו תספק כיצד להפוך כל צעד ניסיוני ליציב ובלתי ניתן לשחזור.זה גם יראה כמה צעד נדיר בפרוטוקולים ביוכימיה, כגון ספין ציפוי וכביסה של כיסויי מיקרוסקופ. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מאגר ה- lysing ואת 1%Tween-20 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. השתמש נתרן הידרוקסידי כדי להתאים את ה- pH ל 12.מער

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

אנו מציגים את פרוטוקול התיוג הממוטב המותאם לשני הכוללים מידע מפורט עבור כל אחד מהצעדים הבאים: חילוץ חלבונים, כימות, משקעים, עיכול, תיוג, הגשה למתקן הפרוטאוניקס וניתוחי מידע.

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים חד-תאיים באמצעות אסטרטגיית תיוג איזוטופי דו-פלקס ועיכול ArgC. תהליך עבודה זה מאפשר פרופילינג כמותי, שכפול ורגיש מאוד של הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד.

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)

חקור שיטת פרוטאום ברוחב כימות לניתוח הומוגניות תיוג חלבונים ברמת מולקולה בודדת. השיטה מאפשרת זיהוי הטרוגניות תיוג שאינה נראית במדידות מסה ומובילה ליישומים דיאגנוסטיים עתידיים.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

גלה סרטונים נוספים