Name: מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: למדו שימוש במתקן מיקום להצבת עכברים במהלך מסירה אינטראנזלית של siRNA למערכת העצבים המרכזית. שיטה זו משפרת יעילות, שכפוליות ומפחיתה טיפול בעכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי משרד הבריאות של קוריאה & רווחה (HI17C1046) כדי S.K.L.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש של אוניברסיטת הייאניאנג. בפרוטוקול זה, עכברים Balb/c בן 6 שבועות במשקל 20-25 g שימשו (n = 3 לכל קבוצה). בעלי החיים שוכנו במתקן נטול פתוגן עם 12 מחזורי אור/כהה בטמפרטורה מבוקרת ורמת לחות עם גישה חופשית למים ומזון.
1. הרכבת התקן
<ol><li>אסוף את החלקים הבודדים של התקן המיקום כפי שמוצג באיור 1A. הערה: ההתקן מסופק בחלקים בודדים שניתן להרכיבו ולפרק בקלות.</li>
</ol>2. הגדרת חומר
הערה: מינהל התרופות הנוזלי דורש את צעדי הטיפול הבאים.
<ol><li>הכן את החומרים הנדרשים, כולל התקן מיקום, 10 μL מיקרופיפטה, 10 מיקרופיפיפטה מיקרו, פתרון טיפול (למשל, RVG9R-siRNA קומפלקס), שעון טיימר, ו 70% אתנול (להפנות לדמות 2A).</li>
	<li>חבר את קוד החשמל כדי להפעיל את מערכת החימום של המכשיר לפחות 15-20 דקות לפני הניסוי. הטמפרטורה האופטימלית לניסויים בבעלי חיים נשמרת באופן אוטומטי ב-~ 37 ° c.</li>
	<li>להכין את קטמין ההרדמה: xylazine: פוספט באגירה מלוחים (PBS) ביחס של 1:0.5:8.5 ו מורדם כל עכבר עם הזרקה בודדת הצפק (כיתה) בכרך הסופי של 200 μL לכל 20 גרם העכבר. הערה: הינכם מתבקשים לשים לב כי כל תרופה ממוטבת להבטחת מצב ההרדמה לתקופה של 30-45 דקות ניתן לשימוש.</li>
</ol>3. מיצוב העכבר
<ol><li>להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן המשרד צביטה) כדי לשמור על המטוס הכירורגי.</li>
	<li>הנח את התקן המיקום במרחק וגובה מתאימים כדי לספק גישה נוחה לכל הריאגנטים הנדרש.</li>
	<li>ברגע שהעכבר מורדם כראוי, הרימו בעדינות כל עכבר על-ידי העורף שלהם באגודל עם אצבע המצביע והניחו אותו על הכיסא המיועד.</li>
	<li>המיקום הנכון של העכבר על הכיסא הוא מאוד חשוב בשלב זה. הנח את גבו של העכבר במקביל לתמיכה האחורית של הכסא, וב90 ° למושב הכיסא. הרם את הידיים מהעכבר ותן לחיה לשכב באופן טבעי בתנוחת הראש למטה וקדימה, בלי לדחוף או ללחוץ, כפי שמוצג באיור 2B. ודא כי forelimbs של העכבר לספק תמיכה טבעית כאשר בעל החיים הוא במצב רגוע, ללא כל אי נוחות לעכבר.</li>
	<li>לאחר העכברים ממוקמים כראוי, לקשור את העכברים עם חגורת הכיסא, ומיד להתחיל את החיסון.</li>
</ol>4. משלוח Intranasal
הערה: פרוטוקול זה מתאר את מסירת RVG9R: מכלולי siRNA באמצעות התקן מיקום העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, מקסימום של 20-30 μL של פתרון ניתן לבצע בקלות לכל עכבר ב 2 מטיפות μL. כרך זה נמוך יותר מזו של חלל האף של העכבר, שהוא 0.032 ס"מ3, ולכן ההליך אינו גורם לחסימה בנחיר קטלני או חנק. פרוטוקול זה מאפשר את החיסון הסימולטני של לפחות ארבעה עכברים ומקסימום שמונה עכברים לכל מכשיר, וכתוצאה מכך מיטוב הזמן והשתנות מופחתת.
<ol><li>קח את 10 μL מיקרופיפטה והתאם אותו ל-2 μL.</li>
	<li>טען את המיקרופיפטה עם 2 μL של RVG9R: מורכבות siRNA פתרון (למשל, 5.2 μg של siCy5 משלימה עם 104 μg של RVG9R לניסוי משלוח, ו 13.5 μg של siSOD1 מורכב עם 270 μg של RVG9R עבור ניסוי השתקה, בנפח הסופי של 25 μL של PBS המכיל 5% גלוקוז.</li>
	<li>תוך כדי החזקת הפיפטה ביד הדומיננטית, התאימו את התנוחה על ידי הצבת מרפק על ראש הספסל. לתמוך את היד מחזיק את הפיפטה עם היד השנייה כדי למנוע תנועות בלתי מבוקרת תוך מתן.</li>
	<li>הנח ~ 2 μL הורד קרוב מאוד לנחיר אחד, כך שהעכבר יכול לשאוף במישרין את ה-droplet (התייחס לאיור 2B). אם טיפה קטנה לא נוצרת בקלות, לאחר מכן החלף את עצת הפיפטה עם אחד חדש וחזור על הפעולה. השתמש בסטופר כדי לאמת את מרווח הזמן בין החיסונים.</li>
	<li>התקן זה מאפשר טיפול בארבעה עכברים לפחות בכל פעם. אם קבוצה אחרת של עכברים נדרש לחזור על השלב 4.4, להגדיר בר אחר עם ארבעה כיסאות מעל או מתחת לבר הראשון עם ארבעה כיסאות להכיל עד שמונה עכברים בכל פעם על המכשיר.</li>
	<li>חזור על שלב 4.4 עם הנחיר השני לאחר 3-4 דקות מהחיסון הראשון. מרווח זמן זה מספיק עבור העכבר כדי להשלים את האינהלציה של המנה הראשונה ושחזור נשימה רגילה. אם ירידה של הפתרון שואפים מחוץ בשל בטעות מסניף החוצה מן naris של העכבר, מחדש 2 μL נוסף של פתרון.</li>
	<li>חזור על התהליך כולו עם נחיריים חלופיים עד שמנה 20-30 μL תסתיים. זה ייקח ~ 30-45 דקות כדי להשלים את ההליך החיסון כולו.</li>
	<li>שים משחה רטובה על עיני העכברים לפני החזרת העכברים חזרה לכלובים המיועדים שלהם. הערה: אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם חזרו לתודעה מספקת כדי לשמור על שכיבה משנית.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>כדי לאשר את הפקדת המוח של Fluor-התווית RVG9R, מורדם העכברים (כמתואר בשלב 2.3) ולבודד את המוח, כמו גם איברים היקפיים אחרים, כגון ריאות, כבד, טחול, וכליה. מניחים כל איבר בתחנת הדפוס ומדמיינים את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות ImageStation.</li>
	<li>כדי לדמיין את הקרינה הפלואורסצנטית בשל Cy5-label, להכין 20 μm-בעובי הקריודורים, מוכתם עם hoechst 33342, ולבצע סריקת מוח מלא עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.</li>
	<li>כדי להעריך גנים השתקה, לחלץ RNA מאזורי המוח השונים, כגון הנורה הריח, הקליפה, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, המוח המוחי, ואת גזע המוח, עם ערכת טיהור של RNA, לאחור המועתק ל-cDNA באמצעות cDNA ערכת סינתזה, ולבצע qPCR עם זוגות פריימר כמתואר בעבר15.</li>
</ol>

<ol><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+bottleneck+in+brain+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development.</a> NeuroRx. 2, 3-14 (2005).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e2968(2011).</li>
<li>Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+brain+targeting+drug+delivery+system+by+nasal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route.</a> Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).</li>
<li>Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+proteins+and+peptides+in+the+treatment+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases.</a> The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).</li>
<li>Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nose+to+brain+drug+delivery+via+integrated+nerve+pathways+bypassing+the+blood-brain+barrier%3A+an+excellent+platform+for+brain+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).</li>
<li>Agrawal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nose-to-brain+drug+delivery%3A+An+update+on+clinical+challenges+and+progress+towards+approval+of+anti-Alzheimer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs.</a> Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).</li>
<li>Van Woensel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulations+for+intranasal+delivery+of+pharmacological+agents+to+combat+brain+disease%3A+a+new+opportunity+to+tackle+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM.</a> Cancers. 5, 1020-1048 (2013).</li>
<li>Kulkarni, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology-mediated+nose+to+brain+drug+delivery+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review.</a> Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).</li>
<li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system%3A+mechanisms+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).</li>
<li>Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+CNS+therapeutics+to+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e4440(2013).</li>
<li>Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+anatomy+and+head+position+on+intranasal+drug+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22European+Archives+of+Oto-Rhino-Laryngology+and+Head+%26+Neck%22%5BJournal%5D)">Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).</li>
<li>Zeller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+cell-binding+ligands+to+arginine-rich+cell-penetrating+peptides+enables+cytosolic+translocation+of+complexed+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA.</a> Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+CCR2+in+macrophages+alleviates+adipose+tissue+inflammation+and+the+associated+metabolic+syndrome+in+dietary+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39(2007).</li>
<li>Beloor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA-mediated+control+of+virus+replication+in+the+CNS+is+therapeutic+and+enables+natural+immunity+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus.</a> Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).</li>
<li>Ullah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trileucine+residues+in+a+ligand-CPP-based+siRNA+delivery+platform+improve+endosomal+escape+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA.</a> Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).</li>
<li>Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+therapeutic+stem+cells+to+glioblastoma+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55845(2017).</li>
<li>Mittal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+direct+nose+to+brain+delivery%3A+current+status+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective.</a> Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).</li>
<li>Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+siRNA+to+the+olfactory+bulbs+of+mice+via+the+olfactory+nerve+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway.</a> Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).</li>
<li>Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+carbamazepine+to+mice%3A+a+direct+delivery+pathway+for+brain+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).</li>
<li>Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacokinetic-pharmacodynamic+studies%3A+towards+prediction+of+nose-to-brain+transport+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans.</a> The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).</li>
</ol>

P.K. ו-S.K.L. הם קופדרים. של ביוטכנולוגיה מחותמים P.K. הוא ממציא של PCT פטנט/US07/12152, אשר חלקית כולל תביעות הנוגעות RVG9R. I.U., הקיי, P.K., ו S.K.L. מפורטים כממציאים של פטנט שנשלח (PCT/KR2016/014220), הכולל תביעות הנוגעות להתקן מיקום העכבר.

פיתחנו התקן מיקום העכבר עבור עכברים מיקום אופטימלי עבור משלוח האף אל המוח של therapeutics. המכשיר מצויד בפונקציות שונות, המבטיח טיפול בו זמנית קל של בעלי חיים. הוא מצויד גם עם מגיני חימום לתחזוקת טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית של בעלי החיים במהלך הניסויים. העכברים המנוצלים יכולים להישמר בתנוחת הראש למטה-וקדימה באמצעות כיסאות מעוצבים במיוחד, עם אי נוחות מינימלית לבעלי החיים. הגובה של כיסאות מיקום יכול להיות מותאם בצורה כזאת, כפי שהוא הטוב ביותר להמחיש נחיריים בעלי חיים תוך מתן תרופות.
בתוך משלוח המוח יש מספר מגבלות פנימיות, כולל אזור פני השטח הקטן של נחיריים (המאפשר כמות מקסימלית של 20-30 μL למינהל), גירוי באף, נזק אפיתל, וספיגה מוגבלת על פני האפיתל האף18. בניהול של תרופות לעכברים להציב במצב פרקדן נעשה שימוש עבור משלוח המוח על ידי שחרור תרופות נוזלי לתוך בעלי החיים ' נארס חלופי באמצעות פיפטה או צינורות פוליאוריטן (24 G x 19 מ"מ) מחוברים מזרקים מיקרו ליטר19, 20. למרות השימוש במערכות אבובים כדי לשחרר סמים ליד האפיתל הריח הוא גישה מתאימה, זה גורם לגירוי או דלקת באף על הממשל החוזר ונשנה. יתר על כן, הגודל הקטן של חלל האף מגביל גישה זו, במיוחד עכברים כי ניתן להתגבר על ידי חוזר, כמו גם על ידי ניסוחים תרופות הנמשכות רירית האף. אפשרות נוספת היא בניהול של therapeutics לעכברים ער10. עם זאת, גישה זו דורשת הליכים מיומנים לטיפול בבעלי חיים במהלך החיסונים. בנוסף, זה גורם למתח בעלי חיים, ולכן, הוא לא אידיאלי עבור דגמי מחלות, בעיקר מודלים זיהומיות מחלות. יתר על כן, מינון לא עקבי עשוי בקלות לנבוע ניקוז התרופה לתוך הריאות או הקיבה בשל מרתק בעלי חיים מושלמים. הגישה המוצגת כאן מאפשרת למדענים להתגבר על המחסומים הטכניים. הראש מטה-ו-קדימה מפחית את האפשרות של דליפת סמים מהאף אל הריאות תוך שאיפת, העדפה משלוח siRNA ישירה וסלקטיבית למוח. במסירה באמצעות המכשיר מיקום העכבר אינו דורש שום טכניקה מיוחדת לטיפול או לרתק את החיות במהלך החיסון. ארבעה בעלי חיים בכל פעם יכולים להיות מטופלים לתקופה של לפחות 30-45 דקות. ניתן לשנות את התהליך על-ידי כלילת סרגל ארבעה כיסאות נוסף, המאפשר ניהול קל של עד שמונה עכברים באותה הפעלה ניסויית. לכן, בעקבות שיטה זו, מפעיל יחיד עלול לגרום לאספקת סמים למוחות של קבוצות גדולות של בעלי חיים לאורך פרקי זמן ארוכים.
המבנה האנטומי של חלל האף משפיע מאוד על משלוח האף למוח (כפי שנבדק על ידי מרקוס ואח '11 ורוגרוק והדה לנגה21). אזור פני השטח היחסי של חלל האף בעכברים הוא פי 15 יותר מזה של בני אדם ואת השטח היחסי של האפיתל הריח הוא פי 6 יותר. למרות שיש הבדלים משמעותיים באנטומיה של חלל האף בבני אדם למכרסמים, יש כ 45 ניסויים קליניים בדרך באמצעות גישה לטיפול בהפרעות במוח כמה (www.clinicaltrials.gov). המחקר המוצג כאן עולה כי בעת שימוש במסירה של therapeutics, מדענים צריכים לשקול מספר גורמים, כגון מעמד הראש, שינה, וסוכני משלוח נאותה.
הצגנו את התצהיר יעיל וספציפי של שכותרתו התווית של siRNA למוח העכבר. יתר על כן, ירידה משמעותית בביטוי הגנים SOD1 נצפתה לאחר משלוח siRNA אישר אפקטים פונקציונליים. בעבר הצגנו באופן עקבי כי בניהול של מתחמי RVG9R-siRNA המיקוד וירוס הנילוס המערבי (WNV) מפעילה השפעה טיפולית חזקה על המוח של WNV15. בעיקר, משלוח האף אל המוח siRNA נדרש מיקוד תא ליגור (RVG) ו מולקולה טעונה באופן חיובי (9R) כדי siRNA מורכב. בהעדר אלמנטים אלה, מולקולות נוקו באמצעות מעגל מערכתית וכלי הלימפה 48 h טיפול פוסט (איור 3A)15. לכן, בתוכנית הניסיונית שתוארה כאן, בדקנו פפטיד/siRNA לוקליזציה 48 h לאחר חיסון לתמונה רק את רמות שנשמרו במיוחד במוח. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות עבור המסירה של מולקולות אחרות, כגון חלבונים, פפטידים, חלקיקים, או therapeutics אחרים, לטיפול במספר הפרעות הקשורות למוח.

BBB מונע מולקולות מנוהל באופן מערכתית של > 400-600 Da מלהיכנס למוח, התחזות אתגר משמעותי להעברת biomolecules טיפולית למחלות המשפיעות על ה-CN ואת המוח1. ניתן להשיג משלוח סמים ישיר למוח באמצעות הזרקת סטרטיק; עם זאת, זה דורש מומחיות כירורגית והוא מוגבל מאוד במסירה לאזורים האבותיים לאתר ההזרקה, מה שהופך אותו מתאים לשימוש קליני שגרתי2. במסירה למוח יכול לגרום גם משלוח המוח ישירה על ידי עקיפת bbb, המאפשר העברה ישירה ומהירה של מגוון של חומרים למוח3,4. העברה זו נחשבת להתרחש על ידי מנגנוני התחבורה דרך חוש הריח ואת העצבים המשולש המחברים את מעבר האף אל המוח, את הנוזל השדרתי, ואת מערכות הלימפה5. כתוואי האף-אל-מוח הישיר אינו כרוך באיברים היקפיים ורקמות, הוא מפחית באופן משמעותי תופעות לוואי מערכתיות ומשפר את העוצמה. בניהול הוא חלופה מבטיחה לא פולשנית הן נתיבים מקומיים ומערכתית עבור משלוח המוח של סוכנים טיפוליים עשוי לייצג גישה רבת עוצמה כדי להילחם בהפרעות נוירולוגיות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, ו סרטן המוח, והוא חקר בניסויים קליניים מספר6,7,8.
מספר גורמים ניסיוניים, כגון נפח ושיטת חיסון, כמו גם הניסוח pH, משפיעים מאוד על משלוח הסמים אל ה-CN דרך מסלול האף אל המוח9. במחקרים עם עכברים, ההצלחה של משלוח הסמים מאוד תלוי במיקום הראש הנכון, שהוא קריטי לתצהיר המוח יעיל כדי למנוע ניקוז הסמים לתוך הסביבה החיצונית או את הנשימה. בעיקר, רוב המחקרים מכרסם להעסיק מעמד ראש לאחור (supine) עם 70 ° 90 ° הטיה עבור משלוח התרופה האפיתל הריח, למרות הראש מיצוב 0 ° עשוי להעדיף ניקוז לתוך קנה הנשימה9. בהעברת תרופות בעכברים כי הם הערים הערות בתצהיר המוח מופחת לעומת כל יישום במצב פרקדן, בעיקר בשל חוסר יכולת של מדענים להחזיק עכברים בעמדה הרצויה לפרקי זמן ארוכים. יתר על כן, העמדה הפוכה הנדרש על ידי שיטת אחיזת העור המועסקים עבור עכברים ער התוצאות בתצהיר של סמים בעיקר העצב המשולש ואת הנורה ריח, כמו גם איברים היקפיים, כגון כליות וריאות, בתוך 30 דקות . אנימבין מיקום הגוף המתאים ביותר עבור המסירה של therapeutics דרך חוש הריח או המוח המשולש בבעלי חיים גדולים יותר כגון פרימטים לא אנושיים במחקרים קליניים נראה להיות ראש למטה וקדימה (כלומר, כביכול "מתפלל למכה עמדה ")11. עם זאת, מיקום זה לא היה היטב למדו במודל העכבר, ואת מיקום פרקדן הוא נפוץ יותר במחקרים מכרסמים.
בעבר, הראינו כי RVG9R, פפטיד שתוכננה בהתבסס על התחום המינימאלי מינימלי של וירוס כלבת, מציג tropism לתאים ביטוי של קולטן אצטילכולין ניקטימית של קולטני משנה כמו נוירונים ומקרופאגים ומדיטים את ה משלוח תאיים של sirna על ידי מנגנון מעורבים התחייבות הקולטן וממברנה פלזמה זמנית הדלאוליזציה באתר של צבירת קולטן12,13. חשוב מכך, מערכת ורידית מערכתית של מכלולי RVG9R-siRNA מאפשר את המסירה הטרנססקולרית של siRNA לתוך ה-CN14. עם זאת, תוואי מערכתי מדלל את כמות sirna מועברת ל-cn, הנתונים האחרונים להפגין כי בניהול של RVG9R: מכלולי sirna לעכברים ממוקם בראש למטה-ולפנים מעורר את היעד שלה להתפשט המטרה הגן מחדש ב אזורים מרובים של המוח15. חשוב מכך, רמה זו של הנוק-דאון הושגה עם מעט כמו 13.5 μg של siRNA מנוהל על פני ארבע מינון, 2 יום משטר בעוד תוואי IV דורש ~ 5 פי מינון גבוה יותר לכל זריקה כדי להשיג הסתרה דומה. החיסרון היחיד של הגישה הוא שזהו תהליך מפרך, המחייב את השימוש בשתי הידיים במהלך הניהול של הפתרון תוך הקפדה על העכברים לחילופין בראש למטה וקדימה ובתנוחות רגועות בין כל שאיפת לתקופה ארוכה של טיפול ארוך (a 30-45 הליך מזערי עבור ספיגת יעיל של הנפח ~ 20-30 μL לכל עכבר). שימוש בהתקן המיקום של העכבר המוצג כאן מאפשר את המיקום הנכון של עכברים עם לחץ פיסי קטן לבעלי החיים והכוח המבצע את הפרוטוקול, כמו גם הטיפול של מספר גדודים של עכברים בתוך פרק זמן סביר, מתן מחקר מעמיק על השימוש siRNAs כטיפול עבור דלקת המוח הנילוס המערבי בעכברים בשלבים מאוחרים של המחלה15.

<table><tbody><tr><td><מבחנים חזקים>מסחריים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript ערכת סינתזה cDNA</td><td>BioRad</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>RNAiso בתוספת</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# 9108</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# RR420A</td><td></td></tr><tr><td>צבעים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A30052</td><td></td></tr><tr><td><זן עכבר חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Orient Bio</td><td>N/A</td><td>בן 6-8 שבועות, 20-30 גרם</td></tr><tr><td><חזק>אוליגונוקלאוטידים ופריימרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנושי CD4</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Sense: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3'</td></tr><tr><td>siSOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Sense: 5'-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'</td></tr><tr><td>פריימרים GAPDH</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3' R: 5'-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3'</td></tr><tr><td>פריימרים SOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'</td></tr><tr><td><חזק>פפטידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RVG9R</td><td>פפטרון</td><td>N/A</td><td>YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRR</td></tr><tr><td>RVM9R</td><td>פפטרון</td><td>N/A</td><td>MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRR</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה, אלגוריתמים והתקנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo 4.3</td><td>FlowJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>http://docs.flowjo.com/vx/ מכשיר מיקום עכבר</td><td>Signet Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת פריזמה</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr> <tr><td>תוכנת פריזמה</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr></tbody></table>

מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה intranasal sirna למערכת העצבים המרכזית

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Intranasal (IN) העברת סמים למוח התפתחה כשיטה מבטיחה לעקוף את מחסום הדם-מוח (BBB) להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CN). מחקרים שנעשו לאחרונה מדגימים את השימוש של פפטיד, RVG9R, שילוב מינימלי מחייב קולטן מתחם של וירוס כלבת גליקופרוטאין, ב מעורר את המסירה של siRNA לתוך הנוירונים במוח. בפרוטוקול זה, הניסוח פפטיד-siRNA מועבר intranasally עם פיפטה ביד הדומיננטית, בעוד העכבר מורדם מרוסן על ידי העורף עם היד הלא דומיננטית בתנוחת "ראש למטה וקדימה" כדי למנוע ניקוז לתוך הריאה והבטן בעת האינהלציה. זה מרתק מדויק של עכברים ניתן ללמוד אבל הוא לא קל ודורש אימון ומיומנות כדי לגרום ספיגת הCN האפקטיבית. יתר על כן, התהליך הוא ארוך נמשך, המחייב כ 45 דקות עבור הניהול של נפח כולל של ~ 20-30 μL של פתרון ב 1-2 μL droplet כרכים לכל שאיפת, עם 3-4 תקופות מנוחה מינימום בין האינהלציה. המטרה של מחקר זה היא לחשוף מיקום העכבר מיצוב המאפשר את המיקום המתאים של עכברים עבור יעיל בניהול של הניסוח פפטיד-siRNA. תכונות מרובות משולבים בעיצוב של המכשיר, כגון ארבע או שמונה כיסאות מיקום עם גובה מתכוונן ולהטות כדי לרסן עכברים מותקנים בראש למטה וקדימה, המאפשר ויזואליזציה קלה של נארס עכברים ו פד חימום מובנה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכברים במהלך ההליך. חשוב מכך, היכולת לטפל בארבעה או שמונה עכברים בו זמנית עם מכלולי RVG9R-siRNA באופן זה מאפשר לימודים בסולם זמן הרבה יותר מהיר, לבדיקה של גישה siRNA טיפולית. לסיכום, מכשיר זה מאפשר מיצוב העכבר המתאים ומבוקרת עבור ביישום של RVG9R-siRNA ומולקולות טיפוליות אחרות, כגון חלקיקים או נוגדנים, עבור מסירת המוח.

מעמד הראש במהלך הניהול הוא השפעה מרכזית על היעילות של מסירת סמים למוח. כאן תיארנו את הראש מטה-and-קדימה מיקום באמצעות התקן מיצוב העכבר עבור המינהל בתוך המוח מיקוד פפטיד-siRNA הניסוח למסירה של התערובת לתוך ה-CN של העכבר. כדי לאמת את המסירה דרך המסלול, השתמשנו RVG9R פפטיד, בעבר הראו לאגד ביעילות לתאים עצביים הן בתוך מבחנה ובvivo14,16.
בדקנו לראשונה את משלוח האף אל המוח של פפטיד RVG9R עם התווית אלקסה Fluor 488 (RVG9R-A488) באמצעות התקן מיקום העכבר המתואר כאן. ב 48 h postinoculation איברים שונים, כולל המוח, את הסינוס, הריאות, הכבד, את הטחול, ואת הכליות היו למדוד רקמות הקשורים A488 פלואורסצנטית. 488 לבדה, או פפטיד בקרה (RVM9R-a488)14 שאינו מאגד, שימשו כפקדים שליליים. כצפוי, אף לא488 או RVM9R-A488 זוהו באף אחד האיברים ב 48 h postinoculation (איור 3a, שמאל). מצד שני, פלורסנט חזקה האות488 זוהה אך ורק במוחם של הקבוצה מחוסן RVG9R. בנוסף, השוונו את עמדת המיקום של העכבר על שיטת המיקום פרקדן ששימש בעבר17, כמו גם את השיטה ער, עבור יעילות. אנו חוסנו כמות קבועה של RVG9R-A488 (100 μg) ו הפצה ביולוגית ב 48 h postinoculation. התוצאות הראו כי מיצוב הראש עכברים למטה ו-קדימה שיפור החדירה ואת התצהיר של RVG9R-A488 ברחבי רקמת המוח (איור 3a, ימין). לעומת זאת, בעלי החיים מחוסן במצב פרקדן הביא למשלוח של RVG9R-a488 למוח, אבל לא חזק כמו לראות עם השיטה מיקום המכשיר. כדי לאשר עוד משלוח siRNA למוח, אנו ביצעו סריקת מוח מלא לאחר אחד בניהול של RVG9R מוחלטת כדי 400 pmol (5.2 μg) של Cy5-התווית siRNA. בניגוד PBS או RVM9R, complexing עם RVG9R הביא להצטברות חזקה של siRNA באזורי המוח העיקריים, כולל הנורה הריח, הקליפה, ההיפוקמפוס, התלמוס, את ההיפותלמוס, המוח האמצע, ואת המוח הראשי (איור 3B ).
בסופו של דבר, אנו המועסקים בניתוח RT-qPCR כדי לאמת את המסירה תאיים של siRNA פונקציונלי מיקוד הסופראוקסיד dismutase -1 (SOD1) גן. עכברים היו מחוסן intranasally במשך 3 פעמים בימים רצופים עם RVG9R: siSOD1 (13.2 μg של siRNA), ואת הביטוי mRNA SOD1 נותחו 24 שעות אחרי החיסון האחרון. RVG9R: siSOD1 המינהל הביא ירידה משמעותית של הביטוי הSOD1 בנורת הריח (63%), קליפת המוח (47%), ההיפוקמפוס (61%), תלמוס (53%), ההיפותלמוס (55%), המוח המאמצע (39%), והמוח המוחי (30%) (איור 4). לסיכום, השימוש במכשיר מיקום מאפשר קל בחיסונים של RVG9R-משלימה siRNA בעכברים, וכתוצאה מכך משלוח siRNA ספציפי המוח גרימת השתקה תפקודית של הגן היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig1.jpg"> איור 1 : הצגת צילומים של מכלול ההתקן. כיסאות המיקום מורכבים על הדוכן בגובה המתאים עם ברגים. לאחר ההרכבה, המכשיר מחובר לספק כוח לחימום לטמפרטורה הפיזיולוגית במהלך החיסון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig2.jpg"> איור 2 : הצגת צילומים של הליך החיסון באמצעות מתקן המיקום. (א) ציוד ניסיוני הנדרש עבור החיסון בחיסונים. (ב) בעלי חיים בראש למטה ולפנים יושבים על המכשיר (משמאל) והפקדת 2 μl DROPLET עבור בחיסון (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig3.jpg"> איור 3 : הפצה של פפטיד התווית ו siRNA לאחר בניהול. (א) ביוהפצה של intranasally מחוסן RVG9R פפטיד ב 48 h לאחר יחיד בחיסון. המוח ואיברים היקפיים אחרים הוערכו לנוכחות של זריחה בעכברים מחוסן עם תמיסת מלח (PBS), A488, Rvm-a488, rvm-a488 (משמאל). הדמיה של העכברים שטופלו כאמור לעיל בזמן שהם ערים, במצב פרקדן, ובתוך מיצוב העכבר לתכנן בראש למטה וקדימה (מימין). (ב) ביוהפצה של RVG9R: מתחם sirna במוח (n = 3 לכל קבוצה). התפלגות של sirna Cy5 הוא היה דמיינו בתוך המוח המלא שמפרקים עם מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד בעלי חיים מחוסן עם תמיסת מלח (PBS), sirna מוחלטת עם פפטיד שליטה (RVM9R-siCy5), או את המוח מיקוד הRVG9R פפטיד (RVG9R-siCy5). סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. קיצורים: o. b = נורת הריח; מיכל הקליפה; היפופוטם = היפוקמפוס; היפו = ההיפותלמוס; tha = תלמוס; m. b = אמצע המוח; מלצר = מוח משכל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig4.jpg"> איור 4 : ביישום של RVG9R: siSOD1 משרה גן היעד השתקה באזורים מרובים של המוח. ניתוח qPCR עבור murine SOD1 mRNA באזורי המוח המצוין 24 שעות לאחר האחרון בחיסון מלוחים (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R), ו RVG9R: siSOD1 (RVG9R). הSOD1 היחסיים להשתקה הנורה הריח, הקליפה, ההיפוקמפוס (העליון), התלמוס, ההיפותלמוס, המוח הקטן (האמצעי), ואת המוח הבינוני (התחתון) מוצג. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD יחסית ל-החברה לאחר נרמול עם הנתונים המתאימים של עכברים המתייחסים לתמיסת מלח (n = 3 לכל קבוצה). הקריקטורה המתארת את אחוז SOD1 mRNA באזור המוח המצוין לאחר החיסון IN מוצג (מימין למטה). * *P &lt; 0.01, * ** p &lt; 0.001. קיצורים: o. b = נורת הריח; מיכל הקליפה; היפופוטם = היפוקמפוס; היפו = היפוקמפוס; tha = תלמוס; m. b = אמצע המוח; מלצר = מוח משכל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות התקן מיקום העכבר המאפשר את המיקום המתאים של עכברים עבור המינהל intranasal של המוח מיקוד פפטיד-siRNA המאפשר גנים יעילים השתקה במערכת העצבים המרכזית.

מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בהתקן מיקום עבור המסירה האינטראנסאלית של ביומולקולס ל- CNS של העכבר. השימוש במכשיר זה מפחית באופן משמעותי את הטיפול בעכברים ואת זמן הטיפול וכתוצאה מכך יעילות משופרת ושחזור של הטכניקה. כדי להתחיל בהליך זה, להעריך את רמת ההרדמה של העכברים על ידי רפלקס הדוושה על מנת לשמור על המישור הכירורגי.לאחר מכן, מקם את התקן המיקום במרחק ובגובה המתאימים כדי לאפשר גישה נוחה לכל חברי ההנהלה הנדרשים. לאחר מכן, להחיל משחה על העיניים של החיה. רצועת עכבר אחד עם חגורות כיסא, לוודא את ה forelimbs של העכבר לספק תמיכה טבעית בזמן שהוא במצב רגוע ללא כל אי נוחות.חזור על ההליכים עבור העכברים הנותרים. מניחים בעדינות כל עכבר על הכיסא המיועד על ידי הנחת גבו במקביל לתמיכת הגב של הכיסא וב-90 מעלות למושב הכיסא. תן לחיה לשכב באופן טבעי בתצב למטה וקדם מבלי לדחוף או ללחוץ.ברגע שכל העכברים קשורים, מיד להתחיל את החיסון האינטרנסלי. כדי לבצע משלוח תוך-שנתי, טען את המיקרופיט עם שני מיקרוליטרים של פתרון מורכב RVG9R siRNA. החזק את פיפטה ביד הדומיננטית ולתמוך בו ביד השנייה, כדי למנוע תנועות בלתי מבוקרות תוך ניהול siRNA.מניחים על שתי טיפות microliter קרוב מאוד נחיר אחד, כך העכבר יכול ישירות לשאוף אותו. אם טיפה זעירה אינה נוצרת בקלות, החלף את קצה פיפטה בטיפ חדש וחזור על הפעולה. בעדינות לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהוא שואף ולשמור על המיקום.כדי למנוע ניקוז של סמים לתוך הריאות חשוב לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהעכבר שואף. התחל שעון עצר כדי שעון שלוש עד ארבע דקות לאחר מכן כדי לזמן חיסון לתוך nare השני של העכבר הראשון. מרווח זמן זה נחוץ לעכבר כדי להשלים את שאיפת המנה הראשונה ולשחזר נשימה נורמלית.במרווח של שלוש עד ארבע דקות בין חיסון של nares חלופי על העכבר הראשון, חיסון תוך-רנסאלי מלא של nare אחד בכל אחד משלושת העכברים הנותרים להציב על המכשיר. כאשר שעון העצר נשמע, לחסן את הנחיר השני על העכבר הראשון ולחזור על ההליך עבור העכברים האחרים כמו לעיל. חזור על ההליך עד 20 עד 30 microliters מועבר עבור כל ארבעת העכברים.זה ייקח בערך 30 עד 45 דקות כדי להשלים את הליך החיסון כולו. החזירו את החיות לכלובים המיועדים להן. אין להשאיר את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על שליטה בעצם החזה.כדי להעריך השתחת גנים, לחלץ RNA מאזורי מוח שונים עם ערכת טיהור RNA, להפוך שעתוק לתוך cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA, ולבצע qPCR עם זוגות פריימר. רוב אספקת המוח של פפטיד RVG9R שכותרתו עם אלקסה פלואור 488 נבדק לראשונה באמצעות מכשיר מיקום העכבר המתואר כאן. ב 48 שעות לאחר חיסון, איברים שונים הוצאו כדי למדוד פלואורסצנטיות A488.שום דבר לא זוהה באף אחד מהאיברים בפקדים השליליים. מצד שני, אות A488 פלואורסצנטי חזק זוהה אך ורק במוחה של הקבוצה מחוסן RVG9R. בנוסף, מיקום מיקום העכבר הושווה לשיטת מיקום supine ואת השיטה ערה ליעילות.התוצאות הצביעו על כך שמיקום העכברים כלפי מטה וקדמתו שיפר את החדירה והתצהיר של RVG9R A488 בכל רקמת המוח. כדי לאשר עוד יותר את משלוח siRNA למוח, סריקת מוח מלאה בוצעה לאחר ניהול תוך-רנסאלי יחיד של RVG9R מורכב Cy5 שכותרתו siRNA. בניגוד PBS או RVM9R, קומפלקס עם RVG9R הביא הצטברות חזקה של siRNA באזורי המוח העיקריים כולל נורת הריח, קליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, המוח ה באמצע, ואת המוח הקטן.התקן המיקום יכול לשמש לאספקת תרופות או מולקולות ל- CNS העכבר. היישומים להרחיב את הבדיקה של תרפיה, כמו גם בחינת מנגנונים סלולריים ב- CNS. מכשיר מיקום זה שימש את החוקרים להדגמת העוצמה של siRNAs בטיפול במחלת וירוס הנילוס המערבי, כמו גם לחקור טיפולים למחלות אחרות של המערכת העצבים המרכזיים.

a-positioning-device-for-placement-mice-during-intranasal-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת intranasally מנת להחדיר תרופות לעכברים ערים לצורך מיקוד המוח מתוארת. שיטה זו מאפשרת למינון חוזר לאורך תקופות ארוכות באמצעות ממשל אפי של תרופה ללא הרדמה, ומשלוח אף למוח עם חשיפה מינימאלית מערכתית.

מנהל אפי של Therapeutics CNS לעכברי Awake

סרטון זה מדגים את ההעברה התוך-אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר הנושא גידול במוח. הניהול התוך-אפי הלא פולשני של תאי גזע עוקף את מחסום הדם במוח, ומקל על העברתם לאתר הגידול במוח ליישומים טיפוליים.

העברה תוך אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים (NSCs) במודל מורין: הליך למסירה ממוקדת גידול של NSCs טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר נושא גידול במוח

מקור: Ullah, I., et.al. מכשיר מיקום למיקום עכברים במהלך העברת siRNA תוך-אף למערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים טכניקת מתן תוך-אף מדויקת להעברת קומפלקסים של פפטיד-siRNA המכוונים לתאי עצב למוח העכבר באמצעות מכשיר מיקום מיוחד. עכברים מורדמים מאובטחים במצב ראש למטה וקדימה כדי לייעל את שאיפת ה-siRNA תוך מניעת ניקוז ריאות. פפטיד המטרה מקל על ספיגה מתווכת קולטנים בנוירונים, ומאפשר העברת siRNA ממוקדת והשתקת גנים במוח.

אספקה תוך-אפית של siRNA למוח העכבר באמצעות מכשיר מיקום

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

מקור: Kanazawa, T., et al. שיטות חדשניות למתן תוך-אף בהרדמה באינהלציה להערכת מתן תרופות מהאף למוח. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים מתן תוך-אף של תרופות עם תווית רדיו בעכבר מורדם כדי להשיג העברת תרופות מהאף למוח. הוא מסביר כיצד תרופות חוצות את אפיתל האף ונעות דרך מסלולים עצביים כדי להגיע למוח, כמו גם כיצד תנועת הריסים משפיעה על שימור ופינוי תרופות. בנוסף, הסרטון מתאר שיטת קנולציה הפוכה חלופית, הכוללת החדרת צינורית דרך הוושט כדי להעביר תרופות כנגד תנועת הריסים, שיפור השמירה ושיפור יעילות ההובלה.

מתן תרופות תוך-אף בעכברים באמצעות פיפטה וקנולציה הפוכה להעברת תרופות מאף למוח

אנו מתארים שיטה למקד תרופות למערכת העצבים המרכזית או על ידי השתלת קטטר או ביצוע הזרקת בולוס לתוך החדר לרוחב הנכון בעכברים. אנו מתמקדים באופן ספציפי על המשלוח של אנטיסנס. טכניקה זו היא להתאמה בקלות לתרופות אחרות ולחולדות.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

MicroRNAs ממלאים תפקידים מכריעים במוח ומהווים מטרות פוטנציאליות למידול ניוון עצבי. עם זאת, הפרעה ברמות ה-miRNA היא מאתגרת בשל האורך הקצר של ה-miRNA וחוסר הנגישות של רקמת המוח. סרטון זה מציג שיטה לעיצוב אנטגומיר והעברה ספציפית למוח באמצעות נוירופפטיד בעכברים.

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בליפוזומים קטיוניים/אניונים עם פפטיד ממוקד עצבי כמערכת העברת מערכת העצבים המרכזית כדי לאפשר ל-siRNA לחצות את ה-BBB.  אופטימיזציה של מערכת אספקה לטיפולים, כמו siRNA, תאפשר אפשרויות טיפול נוספות לפריונים ומחלות ניווניות אחרות.

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

כאן, אנו מתארים שתי שיטות רומן מינהל תוך-אפי יציב בהרדמה אינהלציה עם לחץ פיזי חיות ניסוי. גם נתאר שיטת הערכה כמותית של סמים רמות הפצה במוח באמצעות מסלול האף-אל-מוח באמצעות radiolabeled14ג]-אינולין כמו מצע מודל של מקרומולקולות מסיסים במים.

הרומן שיטות לניהול תוך-אפי בהרדמה אינהלציה כדי להעריך את האף-אל-מוח תרופות

כאן, אנו מתארים שיטה להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית העכברוש על ידי שתילת קטטר לתוך החלל המותני הפנימי של עמוד השדרה. אנו מתמקדים במסירת מחלת האנטי-הגיונית, למרות ששיטה זו מתאימה גם לאספקה של שיטות טיפוליות אחרות.

משלוח פנימי של אנטי-סנס וליגונו, במערכת העצבים המרכזית של חולדה

למדו שימוש במתקן מיקום להצבת עכברים במהלך מסירה אינטראנזלית של siRNA למערכת העצבים המרכזית. שיטה זו משפרת יעילות, שכפוליות ומפחיתה טיפול בעכברים.

מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית

גלה סרטונים נוספים