מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית
15 באוגוסט 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות התקן מיקום העכבר המאפשר את המיקום המתאים של עכברים עבור המינהל intranasal של המוח מיקוד פפטיד-siRNA המאפשר גנים יעילים השתקה במערכת העצבים המרכזית.
פרוטוקול זה מפרט את השימוש בהתקן מיקום עבור המסירה האינטראנסאלית של ביומולקולס ל- CNS של העכבר. השימוש במכשיר זה מפחית באופן משמעותי את הטיפול בעכברים ואת זמן הטיפול וכתוצאה מכך יעילות משופרת ושחזור של הטכניקה. כדי להתחיל בהליך זה, להעריך את רמת ההרדמה של העכברים על ידי רפלקס הדוושה על מנת לשמור על המישור הכירורגי.
לאחר מכן, מקם את התקן המיקום במרחק ובגובה המתאימים כדי לאפשר גישה נוחה לכל חברי ההנהלה הנדרשים. לאחר מכן, להחיל משחה על העיניים של החיה. רצועת עכבר אחד עם חגורות כיסא, לוודא את ה forelimbs של העכבר לספק תמיכה טבעית בזמן שהוא במצב רגוע ללא כל אי נוחות.
חזור על ההליכים עבור העכברים הנותרים. מניחים בעדינות כל עכבר על הכיסא המיועד על ידי הנחת גבו במקביל לתמיכת הגב של הכיסא וב-90 מעלות למושב הכיסא. תן לחיה לשכב באופן טבעי בתצב למטה וקדם מבלי לדחוף או ללחוץ.
ברגע שכל העכברים קשורים, מיד להתחיל את החיסון האינטרנסלי. כדי לבצע משלוח תוך-שנתי, טען את המיקרופיט עם שני מיקרוליטרים של פתרון מורכב RVG9R siRNA. החזק את פיפטה ביד הדומיננטית ולתמוך בו ביד השנייה, כדי למנוע תנועות בלתי מבוקרות תוך ניהול siRNA.
מניחים על שתי טיפות microliter קרוב מאוד נחיר אחד, כך העכבר יכול ישירות לשאוף אותו. אם טיפה זעירה אינה נוצרת בקלות, החלף את קצה פיפטה בטיפ חדש וחזור על הפעולה. בעדינות לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהוא שואף ולשמור על המיקום.
כדי למנוע ניקוז של סמים לתוך הריאות חשוב לדחוף את ראש העכבר למטה עם האצבע המורה במשך חמש שניות בזמן שהעכבר שואף. התחל שעון עצר כדי שעון שלוש עד ארבע דקות לאחר מכן כדי לזמן חיסון לתוך nare השני של העכבר הראשון. מרווח זמן זה נחוץ לעכבר כדי להשלים את שאיפת המנה הראשונה ולשחזר נשימה נורמלית.
במרווח של שלוש עד ארבע דקות בין חיסון של nares חלופי על העכבר הראשון, חיסון תוך-רנסאלי מלא של nare אחד בכל אחד משלושת העכברים הנותרים להציב על המכשיר. כאשר שעון העצר נשמע, לחסן את הנחיר השני על העכבר הראשון ולחזור על ההליך עבור העכברים האחרים כמו לעיל. חזור על ההליך עד 20 עד 30 microliters מועבר עבור כל ארבעת העכברים.
זה ייקח בערך 30 עד 45 דקות כדי להשלים את הליך החיסון כולו. החזירו את החיות לכלובים המיועדים להן. אין להשאיר את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על שליטה בעצם החזה.
כדי להעריך השתחת גנים, לחלץ RNA מאזורי מוח שונים עם ערכת טיהור RNA, להפוך שעתוק לתוך cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA, ולבצע qPCR עם זוגות פריימר. רוב אספקת המוח של פפטיד RVG9R שכותרתו עם אלקסה פלואור 488 נבדק לראשונה באמצעות מכשיר מיקום העכבר המתואר כאן. ב 48 שעות לאחר חיסון, איברים שונים הוצאו כדי למדוד פלואורסצנטיות A488.
שום דבר לא זוהה באף אחד מהאיברים בפקדים השליליים. מצד שני, אות A488 פלואורסצנטי חזק זוהה אך ורק במוחה של הקבוצה מחוסן RVG9R. בנוסף, מיקום מיקום העכבר הושווה לשיטת מיקום supine ואת השיטה ערה ליעילות.
התוצאות הצביעו על כך שמיקום העכברים כלפי מטה וקדמתו שיפר את החדירה והתצהיר של RVG9R A488 בכל רקמת המוח. כדי לאשר עוד יותר את משלוח siRNA למוח, סריקת מוח מלאה בוצעה לאחר ניהול תוך-רנסאלי יחיד של RVG9R מורכב Cy5 שכותרתו siRNA. בניגוד PBS או RVM9R, קומפלקס עם RVG9R הביא הצטברות חזקה של siRNA באזורי המוח העיקריים כולל נורת הריח, קליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, המוח ה באמצע, ואת המוח הקטן.
התקן המיקום יכול לשמש לאספקת תרופות או מולקולות ל- CNS העכבר. היישומים להרחיב את הבדיקה של תרפיה, כמו גם בחינת מנגנונים סלולריים ב- CNS. מכשיר מיקום זה שימש את החוקרים להדגמת העוצמה של siRNAs בטיפול במחלת וירוס הנילוס המערבי, כמו גם לחקור טיפולים למחלות אחרות של המערכת העצבים המרכזיים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר למיקום עכברים לצורך מתן תוך-נחרי של פורמולציית פפטיד-siRNA המכוונת למוח, המאפשרת השתקה יעילה של גנים במערכת העצבים המרכזית. השיטה משפרת את היעילות ואת השחזוריות תוך מזעור הטיפול הישיר בעכברים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- תרפיה גנית
- הובלה ביו-מולקולרית
רקע
- מתן תרופות דרך האף הוא נתיב מבטיח לטיפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- טכניקות מתן יעילות הן חיוניות להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- מיקום העכבר עשוי להשפיע על יעילות הולכת התרופה.
- השתקת גנים באמצעות siRNA היא כלי בעל ערך במחקרים במדעי המוח.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול להגשה תוך-אפית (intranasal) יעילה של siRNA למערכת העצבים המרכזית של העכבר.
- הערכת ההשפעה של מיקום העכבר על יעילות הגשת התרופה.
- הדגמת התועלת של התקן למיקום ביישומים של טיפול גנטי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הערכת רמות ההרדמה בעכברים לפני המיקום.
- שימוש במכשיר קיבוע להבטחת מיקום רפוי של העכברים.
- הזרקה תוך-אפית של תמיסת קומפלקס siRNA.
- מיצוי RNA וביצוע qPCR להערכת יעילות השתיקה הגנטית.
תוצאים עיקריים
- נצפתה השתקה גנטית משמעותית באזורי המוח לאחר ההזרקה.
- העברה משופרת של siRNA באמצעות התקן המיקום בהשוואה לשיטות אחרות.
- זוהה פלואורסצנציה חזקה במוחות של עכברים מטופלים, המעידה על העברה מוצלחת.
- מיקום הראש כלפי מטה שיפר את החדירות ואת השקיעה של פורמולציית ה-siRNA.
מסקנות
- מכשיר מיקום העכברים יעיל להחדרת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ניתן ליישם שיטה זו בהקשרים טיפוליים ומחקריים שונים.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון את השימוש במכשיר לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מתן יעיל דרך האף של תרופות המכוונות למערכת העצבים המרכזית (CNS) נותר צוואר בקבוק קריטי בפיתוח של תרפיה גנית ובמדעי העצבים הפרה-קליניים. התקן מיקום זה מאפשר מתן סטנדרטי ובעל תפוקה גבוהה של ביו-מולקולות כגון siRNA, פפטידים או ננו-חלקיקים למוח העכבר, ובכך משפר את השחזוריות ומפחית את השונות במחקרי מעורבות מטרה (target engagement). באמצעות תמיכה במיקום עקבי של הראש כלפי מטה ולפנים, ההתקן מגביר את הביטחון החזוי בספיגה ב-CNS ומפחית סיכונים בקידום תרגומי של מועמדים לטיפול תוך-אפי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה מדויקת של השערות טיפוליות על ידי הבטחת הובלה הדירה של תרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון קומפלקסים של RVG9R-siRNA.
- ערך תפעולי: מפחית שונות תלוית-מפעיל במינונים, ובכך תומך בהערכות אמינות של מעורבות המטרה (target engagement) ושל מודולציה של מסלולים ביולוגיים.
- ביטחון במידע החזוי: משפר את העקביות בקריאת סממנים ביולוגיים, כגון השתקת גנים או הפחתת ביטוי חלבונים (knockdown), בין קבוצות הטיפול השונות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות סטנדרטיות לסריקות המשך על ידי הבטחת הולכה אחידה של תרכובות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: שיפור השחזוריות של הבדיקה באמצעות מיקום מבוקר של בעלי החיים והפחתת סטרס כתוצאה מטיפול.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תמיכה בהערכה של מודליות מגוונות הכוללות siRNA, ננו-חלקיקים ונוגדנים להולכה למערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות להחדרה עקבית לאזורי מוח מרכזיים המעורבים במודלים של ניוון עצבי או זיהום נגיפי.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקה מהירה של מועמדים טיפוליים באמצעות עיבוד מקבילי של עד שמונה עכברים במפגש אחד.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות go/no-go על ידי שיפור הביטחון בנתוני החשיפה למערכת העצבים המרכזית (CNS) ובנתוני המודולציה של המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
המכשיר משתלב בתהליך הגילוי, החל משלב אישור המטרה המוקדם ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות, ובכך תומך בהערכות אמינות של הובלה למערכת העצבים המרכזית (CNS) לפני מחקרים המאפשרים הגשת בקשה ל-IND.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן עקבי של siRNA או תרופות פפטידיות לצורך תיקוף של מודולציה של מטרה in vivo.
- סריקה: משפר את המוכנות והשחזוריות של הבדיקה על ידי סטנדרטיזציה של מיקום בעל החיים במהלך מתן תרכובות דרך האף.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה כמותית של ספיגה למערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות פלואורסצנציה, qPCR או קריאות של סמנים ביולוגיים בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי שיפור האמינות של מדדי מסירה ל-CNS המשמשים במחקרי טווח מינונים ובדיקות יעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית להערכת מספר שיטות טיפול המכוונות ל-CNS לאורך פרויקטים ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהגעה למערכת העצבים המרכזית (CNS) ובמעורבות המטרה על ידי הפחתת השונות הפרוצדורלית.
- ערך תפעולי: משפר את התפוקה והסטנדרטיזציה, ומפחית את זמן העבודה הידנית ואת התלות בטכנאי.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי שיפור איכות הנתונים והפחתת התוצאות השליליות השגויות במבחני הגעה ל-CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפול תוך-אפי, בהתבסס על נתונים הדירים של ספיגה ב-CNS.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בהערכת הרדמה וקשירה נכונה של בעלי החיים כדי להבטיח נוחות ומיקום מדויק.
- תלוי בגישה לציוד להגשה תוך-אפית, כגון מיקרופיפטים וטיפים סטריליים, ליצירה עקבית של טיפות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין הצוותים כדי להבטיח מיקום אחיד של הראש כלפי מטה ולפנים, ותזמון עקבי בין ההזרקות לנחירים.
- יש להתאימו לזנים או לגדלים שונים של עכברים באמצעות תכונות של כיוון גובה והטיה של הכיסא.
- מוגבל לפרוצדורות הדורשות הגשה תוך-אפית מדויקת; אינו מתאים לנתיבי מתן תוך-ורידיים או אוראליים.
