באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

בטבע, Cas9 הוא חלבון חיסוני מפני וירוסים פולשים שהאבולוציה מעדיפה Cas9 עם ספציפיות מופקרת אשר יכול לחשוף DNA ויראלי עם מוטציות ספונטניות. בנינו מערכת אבולוציה מלאכותית מכוונת המעדיפה גרסה ממוטבת של Cas9 עם ספציפיות גבוהה. בחירות שליליות וחיוביות פועלות בו זמנית במערכת הקרנת הצלפים.

גרסאות Cas9 עם פעילות מחוץ ליעד מופחתת גם שמירה על פעילות על היעד ניתן לסנן בבת אחת. מוטציות הוכנסו על רצף Cas9 כולו באופן אקראי כדי לייצר את הספרייה להיות מוקרן. וזה אפשר למצוא מוטציות בתנופים בלתי צפויים.

כיום, חוקרים רבים באקדמיה והתעשייה משתמשים Y-סוג Cas9 עבור פיתוחים טיפוליים. עם זאת, הספציפיות של Y-סוג Cas9 אינו ממוטב, אשר יכול לגרום את ארוז היטב. אצל בני אדם, משמעות הדבר היא מוטציות בלתי צפויות בגנים אקראיים, אשר יכול להוביל לתופעות לוואי חמורות.

ישנם רבים Cas9 כמו אנזימים אשר מפותחים טיפולית. הטכניקה שלנו יכולה לשמש כדי לשפר את הספציפיות של דנ"א וגרעין אחרים כמו Jipinger, תאילנד, ו Cas9 גם כגון CPF1. הפיכת ספריה לגדולה מספיק היא המפתח להגדלת האפשרויות כדי לקבל משתנה עם פונקציה חשובה.

הקפד לקבל יעילות גבוהה בשלב הקירור, ולהשתמש בתאים מוכשרים יעילים ביותר. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף ננוגרם אחד של פלסמיד CCDB והן את פלסמיד SGRNA עם אי התאמות כפולות לחמישים מיקרוליטרים של תאי BW25141 GOI מופשרים. מערבבים בעדינות את התאים על ידי צינורות, ומעבירים אותם לקובט אלקטרופורציה מצוננת מראש, 0.1 ס"מ.

הפוך את E-coli עם שתי פלסמידים באמצעות אלקטרופורציה. מיד לאחר השלמת האלקטרופוריה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום SOC. בעדינות pipette הפתרון לערבב את התאים ואת המדיום, ולהעביר את התערובת לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

לשחזר את התאים שהשתנו דגירה אותם ב 32 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות במשך שעה אחת. המשך להכין את תאי הסינון של Snyper כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כאשר מוכן לבצע הקרנת סנייפר, לשנות את תאי ההקרנה סניפר עם 100 ננוגרם של פלסמידים גרסה Cas9 מוכן מכל ספריה באמצעות תהליך elctroporation שתואר בעבר.

לאחר מכן, להעביר 250 microliters של התאים לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר. הוסף 250 פיקוגרמות של ATC לריכוז סופי של 10 ננוגרם למיליליטר. לשחזר הן את התאים המכילים ATC ואת התאים ללא ATC על ידי דגירה אותם ב 32 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות עדינות.

צלחת 25 מיקרוליטרים של התאים המשוחזרים נטולי ATC על צלחת אגר LB, המכיל כלוראמפניקול וקנמיצין. הוסף ATC ATC התאושש המכיל תאים לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר על צלחת אגר 245 מילימטר LB. מיד צלחת התאים המכילים ATC על אגר LB המכיל צלחת המכילה chloramphenicol, kanamycin, ו arabinose.

דגירה כל הצלחות לילה ב 32 מעלות צלזיוס. למחרת, צלם את הצלחות. באמצעות תוכנת CFU פתוחה, לספור את מספר המושבות קיימא, לוודא כי מספר המושבות על הלוח הלא סלקטיבי הוא לפחות עשר פעמים גדול יותר מאשר המגוון של הספרייה, כדי לכסות את כל הווריאנטים.

משוך את המושבות ששרדו על הלוחות הסלקטיביים מכל שלוש הספריות. העבר מושבות אלה מאגר ל 250 מיליליטר של מדיום LB, בתוספת כלוראמפניקול, ודגירה לילה ב 42 מעלות צלזיוס. ראשית, לטעון את התוכנה Cas OF finder כדי לבחור אתרי יעד.

בחר את סוג PAM המתאים לסוג הספציפי של Cas9 ולגנום היעד. מלא את הכרטיסיה רצפי שאילתות. בחר את מספר אי-התאמה ולחץ על לחצן שלח.

לאחר מספר שניות, יופיעו האתרים היעד והחוץ-יעד. באופן כללי, בחר את האתרים מחוץ ליעד עם אי התאמות של 1 עד 3. לאחר מכן, סדר את ה- CRRNA ואת אוליגו ה- RRNA למעקב באמצעות רצפי תבניות וה הגבר את התבנית כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לנתח שני microliters של ה-DNA תבנית מוגברת, על ג'ל 2%agarose ולאחר מכן לטהר את התבנית. דגירה תערובת התגובה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להוסיף 0.5 microliters של DNAse ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן לטהר את SGRNA.

לאחר מכן, לטפל 10 מיקרוגרם של RNA מועתק במבחנה עם 250 יחידות של phosphatase אלקליין מעיים עגל במשך שלוש שעות ב 3 מעלות צלזיוס, בנוכחות 100 יחידות של מעכב RNAse, ולאחר מכן לטהר את SGRNA מטופלים. ראשית, לשמור על תאי HEK293 T ב- DMEM בתוספת 10%FBS ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. לאחר מכן, מערבבים שני מיקרוגרם מסוג פראי או חלבון Snyper Cas9 עם שני מיקרוגרם של SGRNA, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות כדי להפוך את קומפלקסים RNP.

טריפסיניזציה וספירה של התאים, ולאחר מכן לשטוף אותם ולהכין אותם במאגר אלקטרופולציה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. אלקטרופוראט קומפלקסים RNP לתוך התאים באמצעות פולס אחד של 1300 וולט עבור 30 אלפיות השניה. מיד לאחר האלקטרופוריה, צלחת התאים על צלחת 48 באר מלא 500 microliters של DMEM, בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לשמור על תאי HEK293 T ב- DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. יום לפני ההמרה, נסה וספיר את התאים.

אם עובדים בקנה מידה של 48 בארות, צלחת 10, 000 תאים ל באר ו 250 microliters של מדיום צמיחה מלאה. באמצעות רגנט transfection מבוסס שומנים, להכין 250 ננוגרם של P3S Cas9 פלסמיד ו 250 ננוגרם של SGRNA עבור transfection. לאחר מכן, מערבבים את הפלסמידים ב-25 מיקרוליטרים של MEM ללא סרום.

לדלל מיקרוליטר אחד של רגנט transfection עם 25 microliters של MEM ללא סרום. הדגירה תערובת זו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבבים את תערובת הפלסמיד עם תערובת רגנט transfection ודגירה בחדר במשך 20 דקות כדי ליצור קומפלקסים ליפופקטמין פלסמיד.

לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של תערובת זו ישירות לכל תאים המכילים היטב. בעדינות לנענע את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב. להחגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 48 עד 72 שעות לאחר transfection, לפני ההתנסות לביטוי טרנס-גנים.

לאחר בידוד הדנ"א הגנומי שהוכן בעבר, צור ספריות רצף עמוקות על ידי הגברה PCR של GDNA עם פריימרים מיקוד על היעד מחוץ ליעד. לאחר מכן, השתמש בפרימרים של אינדקס כדי לסמן כל דוגמה. השתמש במחשב רצף מהדור הבא כדי לחשוף את ספריות הבריכה ל רצף קצה משויך.

לאחר ביצוע מסך סנייפר, ניתן לחשב את אחוז מושבות ההישרדות על ידי חלוקת מספר המושבות על צלחת LB סלקטיבית על ידי מספר המושבות על צלחת LB לא סלקטיבית. בעוד אחוז זה הוא בדרך כלל נמוך מאוד כאשר מבוצע עם ספריות של SP Cas9, להיטים חיוביים אמיתיים ניתן להעשיר על ידי חזרה על המסך עם הבריכה ששרדה. מסך סנייפר מייצג מציג שיעור הישרדות של 100% המתקבל לאחר המסך השלישי.

ניתן לבצע חילוף באמצעות RNPs או פלסמיד מקודד Snyper Cas9 עבור מטרות שונות, ואת הפעילויות המתקבלות על היעד מחוץ ליעד נמדד על ידי מטרות רצף אמפליקון. ברוב היעדים, Snyper Cas9 מראה את אותה רמה של פעילויות יעד ויחסי ספציפיות גבוהים יותר בהשוואה לסוג הפראי. ניתן להשתמש ב- SGRNAs חתוך גם כדי לשפר עוד יותר את הספציפיות.

יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בשלב הניקוי הראשון חשוב מאוד לא לאבד את השיבוטים עם ספציפיות גבוהה. צעדי סינון מאוחרים יותר חוזרים על יעילות טרנספורמציה פחותה מאז השיבוטים כבר מועשרים בשלב ההקרנה הראשון, ויש פחות סיכוי לאבד אותם. יהיה יותר משובוט אחד שמצאנו במסך של סנייפר.

פעילויות על היעד מחוץ ליעד של שיבוטים אלה צריך להיות מאופיין ביעדים שונים רבים ככל האפשר כדי לבחור שיבוטים עם הביצועים הטובים ביותר. בשיטה זו, מדענים יכולים לשפר את הספציפיות של אנזימים דמויי Cas9 ללא אובדן פעילות על המטרה. בנוסף, מדענים אינם זקוקים לידע מוקדם על מבנה החלבון כדי לבצע שיפורים.