Name: קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: למד טכניקה ציטוגנטית חדשנית לקביעת שיעור ההפריה בכנימת העש הטבק Bemisia tabaci באמצעות צביעת DAPI. פרוטוקול זה משפר את ההבנה של האקולוגיה וההתנהגות של זבובי הלבן ומספק בסיס למחקרי ניהול מזיקים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק של ה-NSF (דב-1020460) כדי M.S.H. מענק אפריק USDA (2010-03752) כדי M.S.H. המחברים מודים ברנן Zehr על צביעת ביצים כנימת עש הטבק עם הרבה מיומנות, זן. המחברים תודה מייק ריהלה להתרת השימוש שלו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הדמיה. המחברים מודים סוזן וקלי מרקו Gebiola על הדימויים ביצה. המחברים תודה סוזן קלי בג'ימי קונוואי על העזרה ברגעים מכריעים במהלך הניסויים.

הערה: ודא כי כל העבודה מתבצעת בטמפרטורת החדר, מאוורר או תחת ברדס fume. כל "טיפות" ב פרוטוקול זה מוגדרים µL 5 – 20, בהתאם ההעדפה של המפעיל.
1. ההגדרה הראשונית
<ol><li>לאפשר כנימות עש הנשי oviposit על עלים נקיים. דוגמאות ההטלה ארנאס כוללים קליפ כלובים או עלים וחתוכים על אגר בצלחת פטרי. תעשה חור coverable קליפ כלוב או צלחת פטרי כיסוי כדי להוסיף ולהסיר את המבוגרים. לחלופין, במהירות לשים כלי קיבול של מבוגרים שנאספו על קרח, ואז להפקיד אותם על העלה. להגביל את משך הזמן בין ההטלה ואת הביצה קיבעון על לא יותר מ- 60 דקות, כדי להבטיח את התצפית של המעבר זרע לתוך pronucleus אבהית הביצים. הערה: יכול להיות גדלו ביצים לא יוסרו מן העלה לבגרות כדי להקליט יחסי מין למבוגרים.</li>
	<li>לפני או במהלך ההטלה כנימת עש הטבק, הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי לנקות אותו עם סבון ומים, ייבוש זה טוב, ומתיחה אז חתיכה של פרפין הסרט מעל קצה אחד, מוודא שהשטח הסרט פרפין לא לשבור (איור 1). הערה: הסרט פרפין הידרופוביות, אטום למחצה, ומאפשר נוזלים לטופס טיפות וביצים כדי להיראות יותר בקלות.</li>
</ol>2. Dechorionation
<ol><li>עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של אקונומיקה פתרון (0.83% נתרן תת-כלורי) לסרט פרפין. הערה: קל לעקוב אחר ביצים אם רק 2-3 ביצים נמצאות כל טיפה. לחלופין, כדי לנהל מספר ביצים גדולות, לאסוף את הביצים בתוך טיפות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). התראה: אקונומיקה היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול אקונומיקה, לא לנשום.</li>
	<li>הסר את הרווחת ובצמח למבוגרים העלה.</li>
	<li>מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ כדי לראות בבירור את הביצים לאסוף את הביצים ביחידים ובזהירות עם מכשיר בדיקה דק. כדי לבצע בדיקה, להוסיף סיכה נדל minuten ב 45 מעלות או בזווית של עבודה נוח לתוך טיפ פיפטה מומסת (איור 2).</li>
	<li>להעביר את הביצים באקונומיקה או 1 x PBS. אם משתמש 1 x PBS, הסר את ה-x 1 PBS עם זכוכית פסטר pipette פעם אחת כל הביצים נאספים, לאחר מכן, להוסיף מלבין הביצים. הערה: בעת איסוף ביצים, הרם לאט את הביצה מבסיסו עד pedicel יוסר העלה. Pedicel הוא דביק, הביצה ידבק נפוץ בין קצה המקדח עד זה מוכנס לתוך האקונומיקה. הערה: מומלץ לשימוש נפרד זכוכית פסטר סיליקון עבור כל ריאגנטים, ניתן לשנות את מדי סוכר עם חום כדי להצר את הטיפים ולהפחית את הסיכון בטעות כ רפה בעברית ביצים כנימת עש הטבק. כדי למנוע שריפה, זיהום, לנקות מדי של סוכר עם מים יונים לאחר כל שימוש.</li>
	<li>המתן 10 דקות. אם יש אינטרס מופרה בביצים שגילן עולה על 1 h, השאירו את הביצים מלבין עד 15 דקות. הערה: ביצים שאינן הישן עד 1 שעות, 10 דקות היא מספקת.</li>
</ol>3. קיבוע
הערה: השלבים הבאים לקוחים מתוך פרוטוקול Hymenopteran17.
<ol><li>הסר את המלבין (המכיל את השברים chorion) עם זכוכית פסטר פיפטה וזורקים אותו. להוסיף טיפות של חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה, להמתין 3 דקות. התראה: להמשיך עם שלב זה ברדס fume. חומצה אצטית היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול חומצה אצטית קרחונית, לא לנשום, במיוחד בשילוב עם המלבין שיורית.</li>
	<li>להסיר את חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק (3:1 של כוהל מוחלט: חומצה אצטית) עם זכוכית פסטר פיפטה. חכה עד רוב הפתרון התאדו (או מקסימום 10 דקות).</li>
	<li>להוסיף טיפות של 70% אתנול הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה, חכה עד רוב האתנול התאדו (או 10 דקות מקסימום).</li>
</ol>4. מכתים
<ol><li>להסיר כל אתנול שיורית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות 1 x PBS הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה כדי לקבל את ה-pH קרוב 7.0. להגדיר את השקופית מיקרוסקופ תא לחות כדי למנוע לייבוש, לדוגמה, בתיבת עצה פיפטה ריק עם מגבת נייר רטובה בפנים (איור 3). המתן לפחות 30 דקות. הערה: זו הנקודה הטובה ביותר אם הפסקה נחוצה, כל עוד תא לחות יכול למנוע לייבוש.</li>
	<li>הסר את PBS 1 x עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של 0.1 μg/mL דאפי, כתם פלורסנט דנ א, עם זכוכית פסטר פיפטה. הגדר את השקופית מיקרוסקופ בחדר חשוך לחות ולא לחכות לפחות 15 דקות. התראה: דאפי היא מטרד, אז תתמודד עם זה עם כפפות.</li>
</ol>5. כביסה
<ol><li>הסר את דאפי עם זכוכית פסטר פיפטה.</li>
	<li>להוסיף טיפות 1 x TBST (פתרון x 5 זני 30 גרם של טריס, g 43.8 של NaCl, 5 מ של polysorbate 20 ו- 1.0 g של נאן3 [pH 7.5], והביא 1 ליטר מים כיתה ה-PCR) את הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה. להמתין 5 דקות לפני הסרת ה-1 x TBST עם זכוכית פסטר פיפטה. חזור על שלב זה פי 2.</li>
</ol>6. הרכבה
<ol><li>לאחר השטיפה הסופית pipette בקפידה כל הביצים מהסרט פרפין לתוך חלק נקי של השקופית מיקרוסקופ. להסיר את עודף 1 x TBST; לאחר מכן, הוסף µL 20 הגוברת מדיה (גליצרול 80% ו-20% 1 x TBST עם 2% n-propyl-מספר) ומניחים שקופית כיסוי נקי על הביצים.</li>
	<li>לאחסון לטווח ארוך, לאטום את השקופית כיסוי עם לק ברורה, לאחר מכן, לאחסן את השקופית בחושך ב 2 מעלות צלזיוס או מיד להציג אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
<li>Pascal, S., Callejas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecific+competition+between+biotypes+B+and+Q+of+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+from+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain.</a> Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).</li>
<li>Liu, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+mating+interactions+drive+widespread+invasion+and+displacement+in+a+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly.</a> Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+discrimination+in+invasive+whitefly+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Behavior%22%5BJournal%5D)">Mate discrimination in invasive whitefly species.</a> Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+mating+behaviour+drives+asymmetric+reproductive+interference+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies.</a> Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).</li>
<li>Tsueda, H., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+differences+between+Q+and+B+whiteflies%2C+Bemisia+tabaci%2C+on+three+host+plants+and+negative+interactions+in+mixed+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).</li>
<li>Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mating+behavioural+interactions+and+life+history+traits+in+the+competition+between+alien+and+indigenous+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).</li>
<li>Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reproductive+interference+on+the+competitive+displacement+between+two+invasive+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).</li>
<li>Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+concepts+as+applied+to+the+whitefly+Bemisia+tabaci+systematics%3A+how+many+species+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?</a> Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).</li>
<li>Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php">http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php</a> (2018).</li>
<li>Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+insect+supervectors+Bemisia+tabaci+and+Frankliniella+occidentalis+in+the+emergence+and+global+spread+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses.</a> Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).</li>
<li>Giorgini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+symbionts+cause+parthenogenetic+reproduction+in+the+parasitoid+wasp+Pingala+soemius+%28Hymenoptera%3A+Eulophidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+endosymbiont+Rickettsia+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest.</a> Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).</li>
<li>Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mechanism+and+genetic+consequences+of+thelytoky+in+the+wasp+Trichogramma+cacoeciae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae.</a> Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+fitness+benefits+of+the+Rickettsia+bacterial+symbiont+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest.</a> Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+nuclear+genotype+influences+phenotype+of+a+conditional+mutualist+symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont.</a> Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+intracellular+ecosystem%3A+symbiotic+bacteria+share+bacteriocytes+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies.</a> FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).</li>
<li>Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+inheritance+of+a+single+somatic+animal+cell+displayed+by+the+bacteriocyte+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci.</a> Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).</li>
<li>Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה הוא הראשון כדי ללכוד את קצב הפריה או יחס העיקרי של עש. האתגר של פרוטוקול זה הוא כי הוא דורש חוקרים ללמוד כיצד להתמודד עם הביצים כנימת עש הטבק במהירות, להבטיח כי לא יותר 1 h עבר מאז הביצים היו oviposited עד הם קבועים. במהלך הניסויים ראשוני, ביצים זה תוקנו ב 3 h או postoviposition עוד היו זקן מדי כדי להתבונן הפריה, כפי syngamy אירע חטיבות mitotic בעיצומם. בין 1 עד 3 h, לקח pronuclei בצורה יותר עגול. בעוד נוכחות המוקדמות שני גרעינים מציין ביצה מופרית, קצת אחר כך, הפרד של שני גרעינים כהכנה syngamycan מופ...

המחקר של הקצאת סקס, או את ההשקעה היחסית בצאצאים זכר ונקבה, הוא אבן יסוד של אקולוגיה התנהגותית1,2,3. בנוסף כוחה לבדיקת דגמי התנהגות מסתגלת, לדעת את האסטרטגיה הקצאת סקס של אורגניזם עשוי לשפר את דגמי שלה המלאכותיות. במינים רבים, הקצאת מין נשלטת על ידי אמהות. כדי לקבוע מין ההקצאה, חשוב לקבוע את היחס סקס ראשי או את הפרופורציה של נקבות בזמנו של ביצה התצהיר. למרות היחס מין אצל הבוגרים עשוי לספק רמזים להקצאת סקס, דיפרנציאלי התפתחותית התמותה בין קטינים זכר ונקבה עשויים בדרך כלל להטות היחס סקס למבוגרים באופן משמעותי. במינים מסוימים של דבוראים, הסדר של חרקים המכיל נמלים, דבורים, צרעות, היחס מין העיקרי נקבע עם מבחני cytogenetic, מכתימה את העוברים כדי להציג את ה-DNA הגנטי. בגלל hymenopterans haplodiploid, ביצה זכר התחלתית הוא הפלואידי ומכיל רק את הנקבה pronucleus (n), בעוד ביצים הנשי התחלתית דיפלואידי ומכילים pronuclei גם זכר וגם נקבה (2n). למרות Aleyrodidae, משפחת האכלה sap של פשפשים (פשפשאים) המכונה כנימות עש, גם haplodiploid, לא חלה assay הוקמה כדי למצוא את יחס מין העיקרי חרקים אלה. זה אולי מפתיע בהתחשב האינטנסיביות של מחקר של כמה מזיקים רציניים הקוסמופוליטית במשפחה הזאת ואת החשיבות של יחסי מין באינטראקציות תחרותי של כנימות עש4,5,6,7 ,-8,-9,-10 ב המלאכותיות בדרך כלל. בחרקים haplodiploid גם יחסי מין הם עכבות סקס נחישות מערכות, מתן אפשרות הפריה סלקטיבית, יחסי מין יציב להשתנות עם הסביבה2. כאן אנו מציגים טכניקה כדי לקבוע את היחס המין העיקרי של המתחם מינים של כנימות עש המכונה באופן קולקטיבי כנימת עש הטבק sweetpotato, עש ב. שם זה מין אחד כוללת מינים יותר מ-28 ברחבי העולם11, כולל חלק12,הכללית מזיקים פולשנית המזיק ביותר13. היישום של טכניקה זו לקביעת מין דפוסי הקצאת עש ב ו Aleyrodidae אחרים יאפשרו חקירה קפדנית יותר של משתנים, כולל טמפרטורה, מצמח פונדקאי, endosymbiotic חיידקים או צמח/כנימת עש הטבק גורמי מחלה, שעשוי להשפיע על יחסי המין העיקרי כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק המלאכותיות.
. אנחנו מודעים כל טכניקות דומות מכתים ביצה עבור עש. הפרוטוקול נוח בהשוואה מכתימים שיטות אחרות ביצי חרקים14 כפי שהוא משמיט שלב קיבוע בין לילה, לפיכך, יכול להסתיים בתוך 3 שעות. דוגמה אחת של יישום, של החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, מזוהה עם הטיית נקבה שלנו שורות מעבדה עש ב 1 קטין במזרח התיכון-אסיה (MEAM1)15,16. בשורה אחת דרב עש הטבק MEAM1 מעבדה ("MAC1," שנאספו מן המרכז החקלאי Maricopa), אנחנו נבדוק אם ריקטסיה-נקבות (R.+) נגוע להפרות יותר ביצים מאשר נקבות (R.–) נגוע.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>כל</td><td></td><td>תמיסה 5x עשויה מ-30 גרם Tris, 43.8 גרם NaCl, 5 מ"ל Tween-20 ו-1.0 גרם NaN3 pH 7.5, והובאה ל-1 ליטר עם מים בדרגת PCR</td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>קלורוקס</td><td></td><td>כל אקונומיקה ביתית תעבוד כל עוד ניתן לדלל אותה ל-0.83% נתרן היפוכלוריט</td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI דילקטט</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>כל</td><td></td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי <td>מדולל ל -70% EtOH</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> ניקון <td>ניקון אקליפס 50i שימש בניסוי זה, אך ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן עירור של 340/380 ננומטר והגדלה של פי 4-10 לפחות</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Wild</td><td></td><td>A Wild M5A שימש לניסוי זה, אך ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ שבו המפעיל יכול לראות בבירור את ביצי הזבוב הלבן</td></tr><tr><td>כיסויי שקופיות מיקרוסקופ</td><td>כל</td><td></td><td>השיטות מיועדות לכיסויי שקופיות בגודל 18 מ"מ על 18 מ"מ. יהיה צורך להוסיף מדיית הרכבה נוספת עבור כיסויי שקופיות גדולים יותר.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיכות נדל של Minuten</td><td>סיכות נדל BioQuip</td><td>1208SA</td><td>Minuten הן אופציונליות לעיצוב כבדיקות עם קצות פיפטה</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3כל</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>n-פרופיל-גלאט</td><td>סיגמא/סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>פיפטות Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20A</td><td>פיפטות פסטר חד פעמיות מזכוכית בורוסיליקט 5.75 אינץ'. ייתכן שיהיה צורך גם במבער בונסן אם המפעיל ירצה להאריך ולהצר פיפטות</td></tr> מים <tr><td>בדרגת PCR</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>כל</td><td></td><td>קצות פיפטה הם אופציונליים לעיצוב כבדיקות עם סיכות נדל דקות</td></tr><tr><td>נורת טפטפת קטנה</td><td>כל</td><td></td><td>חובה להתאים לפיפטה פסטר</td></tr><tr><td>טריס</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה cytogenetic

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

מינים אחדים למציצת צוף כנימות עש הם חלק המזיקים יבשתי המזיק ביותר ברחבי העולם בגלל הנזק היבול שהם ממיטים ווירוסים צמח שהם וקטור. למרות מחקרים רבים של הביולוגיה של המינים הללו בסביבות שונות, פרמטר היסטוריית החיים, יחסי מין הצאצא, קיבל תשומת לב מועטה, עדיין חשוב לניבוי המלאכותיות. היחס סקס ראשי (יחס מין בבית ההטלה) של כנימת עש הטבק לא דווחה, אך ניתן למצוא על ידי קביעת שיעור הפריה הביצית של החרק haplodiploid. הטכניקה מערבת את dechorionation של ביצים עם אקונומיקה, סדרה של צעדים קיבוע של היישום של הכתם פלורסנט כללי ה-DNA, דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, מחייב הדי הפלורסנט), כדי לאגד pronuclei נשי. כאן, אנו מציגים את הטכניקה, דוגמה של היישום שלה, כדי לבדוק אם החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, השפיע על היחס המין העיקרי של עש. שיטה זו עשויה לסייע לימודי אוכלוסיה של כנימות עש, או לקבוע אם קיימת הקצאת סקס עם גירויים סביבתיים מסוימים.

כדי לבדוק אם ריקטסיה משפיע על הקצב הפריה של עש ב MEAM1 נשים, אנחנו גדלו ריקטסיה-נגוע (R.+) או uninfected (R.–) נולד ב- עש הטבק על לוביה הצמח (Vigna unguiculata) הפרד בין הכלובים-27 ° C, 70% לחות יחסית, של 16 h אור/8 h כהה photoperiod. R+ ו- R– הרביעית לחלל כנימות עש היו בזהירות להסיר עלים, מבודד צינורות רצועת µL 200. כאשר מבוגרים הגיח, הם היו שנאספו בקבוצות של 50% נשים, הועבר עלים נקיים בפטרי (n</...

אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

הפרוטוקול שליז פיתחה מאפשר לנו לקבוע את שיעור ההפריה של הלבנים. יישום טכניקה זו ישפר את הבנתנו את ההתנהגות והאקולוגיה של whiteflies. Whiteflies הם haplodiploid, ולכן שיעור ההפריה שווה ליחס המין ב oviposition.פרוטוקול זה הוא הראשון המתואר עבור whiteflies, לדעתנו, והוא יכול להסתיים בתוך שלוש שעות. כדי להתחיל, לעשות חור כיסוי בצלחת פטרי לכסות כדי להכניס ולהסיר את הגחליליות הלבנות למבוגרים. הגדר תא לחות ואופנת בדיקה על ידי החדרת סיכה דקה בזווית עבודה נוחה לתוך קצה פיפטה מומס לעשות בדיקה דקה.באופן אופציונלי, להאריך טיפים פיפטה זכוכית עם חום לטיפול קל יותר של ביצים לבן. לאחר מכן, לאפשר לבנים נקבה oviposit על עלה נקי, לחתוך כדי להתאים אגר בצלחת פטרי. במהלך oviposition לבן, לנקות מגלשת מיקרוסקופ עם מים וסבון.יבש אותו היטב למתוח חתיכת סרט פרפין על קצה אחד כדי לאפשר לנוזלים ליצור טיפות וביצים להיראות בקלות רבה יותר. כדי dechorionate ביצים, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפות של 83% נתרן hypochlorite אקונומיקה פתרון לסרט פרפין ממש לפני הסרת מבוגרים ואיסוף ביצים. אקונומיקה וחומצה אצטית קרחונית הן קורוזיביות.הם צריכים להיות מטופלים עם כפפות במכסה המנוע או באזור מאוורר היטב. DAPI הוא גם מרגיז ויש לטפל בו עם כפפות. לאחר מכן, להסיר את whiteflies למבוגרים מן העלה ולה מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ.בזהירות להרים כל ביצה מבסיסו עד pedicel מוסר מן העלה. תרגלו על ביצים רבות לפני ביצוע פרוטוקול זה. הרם את הביצים לאט מהבסיס והרם אותו במלואו מהעלה ברגע שאתה יכול לראות כי פדיקל הביצה מוסר מן העלה.מעבירים שתיים עד שלוש ביצים לכל טיפת אקונומיקה ומשאירים אותן למשך 10 דקות. כדי לתקן את הביצים, השתמש פיפטה זכוכית כדי להשליך את האקונומיקה. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של חומצה אצטית קרחונית ומחכים שלוש דקות.לאחר מכן, להסיר את חומצה אצטית קרחוני ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק. לאחר מכן, המתן 10 דקות עד שרוב הפתרון התאדה. מוסיפים טיפות של 70% אתנול ומחכים שוב במשך 10 דקות.כדי להכתים את הביצים, ראשית להסיר כל אתנול שיורית. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של 1xPBS לביצים כדי לקבל את ה- pH קרוב לשבע. שים את מגלשת המיקרוסקופ בתא לחות כדי למנוע ייעוד.לאחר 30 דקות, להסיר את 1xPBS ולהוסיף טיפות של 1 מיקרוגרם לכל DAPI מיליליטר. שים את החלקת המיקרוסקופ בתא לחות כהה והמתן לפחות 15 דקות. כדי לשטוף ביצים, הסר תחילה את פתרון DAPI.לאחר מכן להוסיף טיפות של 1xTBST לביצים. לאחר חמש דקות, הסר את 1xTBST. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות עבור סך של שלוש שטיפות.לאחר הכביסה הסופית, בזהירות pipette כל הביצים מן הפרפילם על חלק נקי של מגלשת מיקרוסקופ. הסר TBST עודף והוסף 20 מיקרוליטרים של מדיית הרכבה. לבסוף, מניחים מגלשת כיסוי נקי על גבי הביצים, לאטום את החלקת המכסה עם לק ברור לאחסון לטווח ארוך, ולהמשיך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.פענוח ביצים ואחריו כתמים גרעיניים DAPI אפשר את המשימה של הפריה ומין עובר כאשר נצפה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרונוקלוס הנשי נמצא בסמוך למרכז הביצית הנשית המופרית והביצית הזכרית הלא מופרית, והזרע נראה כפס בהיר ליד פסגת הביצית הנשית בלבד. יישום אחד של טכניקה זו היא לקבוע אם אנדוסימביוטים חיידקיים משפיעים על יחסי המין העיקריים של whiteflies.לדוגמה, יחסי המין העיקריים של ביצים שהונחו על ידי גחליליות B.tabici נגועות ובלתי נגועות בריקטסיה לא הראו הבדל משמעותי בין יחס המין בשני הטיפולים. באשר לביצים שגודלו לבגרות, תוצאות דומות נראו למבוגרים נגועים בריקטסיה ולא נגועים, ולא סיפקו ראיות, לפחות במחקר זה, ל שיעורי הפריה גדולים יותר על ידי נקבות נגועות ריקטסיה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע אם זרע בין ספציפי יכול להפרות ביצים.אם לא נצפתה הפריה, אפשר לגבות ולבדוק אם הזרע מועבר במהלך ההזדווגות על ידי התבוננות בזרע של הנקבה. אם ההפריה מתרחשת, אפשר להשוות את יחס המין של מבוגרים עם שיעור ההפריה כדי לקבוע את הכדאיות של התפתחות צאצאים היברידיים.

determining-egg-fertilization-rate-bemisia-tabaci-using-cytogenetic

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

יכולת התחרותית ההפרש בין...

הבדלי שומה ביכולת תחרותית בזרע<em&gt; דרוזופילה</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד endosymbionts מ tabaci בימייה פרפר באמצעות נתיחה וסינון. לאחר הגברה, דגימות DNA מתאימים לרצף הבאים ולימוד של הדדיות בין endosymbionts ו whitefly.

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

לוחות תמותה לאפשר כימות של מקורות ושיעורי התמותה בקרב אוכלוסיות החרקים ולתרום להבנת, חיזוי, מניפולציה הדינמיקה באוכלוסייה של agroecosystems. שיטות ביצוע וניתוח טבלאות עוקבה מבוסס החיים בשדה של חרק עם חיים לא בוגר sessile שלבים מוצגים.

מתודולוגיית פיתוח טבלאות החיים עבור חרקים Sessile בשימוש השדה כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק, כותנה כמו מערכת מודל

הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

ב פרוטוקול זה, שיטות לעריכת נישואין בתוך המשפחה צלבים, להערכת ההצלחה של אלה צלבים, מתוארים על הנמלה Vollenhovia emeryi. פרוטוקולים אלה חשובים עבור ניסויים להבנת בסיס גנטי של סקס נחישות מערכות דבוראים.

אינדוקציה והערכה של נישואי קרובים צלבים באמצעות הנמלים, Vollenhovia Emeryi

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.

גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד למדוד נתוני פרמטרי חיים נפוצים אצל יתושי Aedes aegypti , כולל פריון, גודל כנפיים, פוריות, יחס מין, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידות אלה יכולות לשמש להערכת כשירותם של יתושים טרנסגניים.

כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

למד טכניקה ציטוגנטית חדשנית לקביעת שיעור ההפריה בכנימת העש הטבק Bemisia tabaci באמצעות צביעת DAPI. פרוטוקול זה משפר את ההבנה של האקולוגיה וההתנהגות של זבובי הלבן ומספק בסיס למחקרי ניהול מזיקים עתידיים.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

גלה סרטונים נוספים