קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic
1 באפריל 2019
אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.
הפרוטוקול שליז פיתחה מאפשר לנו לקבוע את שיעור ההפריה של הלבנים. יישום טכניקה זו ישפר את הבנתנו את ההתנהגות והאקולוגיה של whiteflies. Whiteflies הם haplodiploid, ולכן שיעור ההפריה שווה ליחס המין ב oviposition.
פרוטוקול זה הוא הראשון המתואר עבור whiteflies, לדעתנו, והוא יכול להסתיים בתוך שלוש שעות. כדי להתחיל, לעשות חור כיסוי בצלחת פטרי לכסות כדי להכניס ולהסיר את הגחליליות הלבנות למבוגרים. הגדר תא לחות ואופנת בדיקה על ידי החדרת סיכה דקה בזווית עבודה נוחה לתוך קצה פיפטה מומס לעשות בדיקה דקה.
באופן אופציונלי, להאריך טיפים פיפטה זכוכית עם חום לטיפול קל יותר של ביצים לבן. לאחר מכן, לאפשר לבנים נקבה oviposit על עלה נקי, לחתוך כדי להתאים אגר בצלחת פטרי. במהלך oviposition לבן, לנקות מגלשת מיקרוסקופ עם מים וסבון.
יבש אותו היטב למתוח חתיכת סרט פרפין על קצה אחד כדי לאפשר לנוזלים ליצור טיפות וביצים להיראות בקלות רבה יותר. כדי dechorionate ביצים, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפות של 83% נתרן hypochlorite אקונומיקה פתרון לסרט פרפין ממש לפני הסרת מבוגרים ואיסוף ביצים. אקונומיקה וחומצה אצטית קרחונית הן קורוזיביות.
הם צריכים להיות מטופלים עם כפפות במכסה המנוע או באזור מאוורר היטב. DAPI הוא גם מרגיז ויש לטפל בו עם כפפות. לאחר מכן, להסיר את whiteflies למבוגרים מן העלה ולה מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ.
בזהירות להרים כל ביצה מבסיסו עד pedicel מוסר מן העלה. תרגלו על ביצים רבות לפני ביצוע פרוטוקול זה. הרם את הביצים לאט מהבסיס והרם אותו במלואו מהעלה ברגע שאתה יכול לראות כי פדיקל הביצה מוסר מן העלה.
מעבירים שתיים עד שלוש ביצים לכל טיפת אקונומיקה ומשאירים אותן למשך 10 דקות. כדי לתקן את הביצים, השתמש פיפטה זכוכית כדי להשליך את האקונומיקה. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של חומצה אצטית קרחונית ומחכים שלוש דקות.
לאחר מכן, להסיר את חומצה אצטית קרחוני ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק. לאחר מכן, המתן 10 דקות עד שרוב הפתרון התאדה. מוסיפים טיפות של 70% אתנול ומחכים שוב במשך 10 דקות.
כדי להכתים את הביצים, ראשית להסיר כל אתנול שיורית. לאחר מכן, מוסיפים טיפות של 1xPBS לביצים כדי לקבל את ה- pH קרוב לשבע. שים את מגלשת המיקרוסקופ בתא לחות כדי למנוע ייעוד.
לאחר 30 דקות, להסיר את 1xPBS ולהוסיף טיפות של 1 מיקרוגרם לכל DAPI מיליליטר. שים את החלקת המיקרוסקופ בתא לחות כהה והמתן לפחות 15 דקות. כדי לשטוף ביצים, הסר תחילה את פתרון DAPI.
לאחר מכן להוסיף טיפות של 1xTBST לביצים. לאחר חמש דקות, הסר את 1xTBST. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות עבור סך של שלוש שטיפות.
לאחר הכביסה הסופית, בזהירות pipette כל הביצים מן הפרפילם על חלק נקי של מגלשת מיקרוסקופ. הסר TBST עודף והוסף 20 מיקרוליטרים של מדיית הרכבה. לבסוף, מניחים מגלשת כיסוי נקי על גבי הביצים, לאטום את החלקת המכסה עם לק ברור לאחסון לטווח ארוך, ולהמשיך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
פענוח ביצים ואחריו כתמים גרעיניים DAPI אפשר את המשימה של הפריה ומין עובר כאשר נצפה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרונוקלוס הנשי נמצא בסמוך למרכז הביצית הנשית המופרית והביצית הזכרית הלא מופרית, והזרע נראה כפס בהיר ליד פסגת הביצית הנשית בלבד. יישום אחד של טכניקה זו היא לקבוע אם אנדוסימביוטים חיידקיים משפיעים על יחסי המין העיקריים של whiteflies.
לדוגמה, יחסי המין העיקריים של ביצים שהונחו על ידי גחליליות B.tabici נגועות ובלתי נגועות בריקטסיה לא הראו הבדל משמעותי בין יחס המין בשני הטיפולים. באשר לביצים שגודלו לבגרות, תוצאות דומות נראו למבוגרים נגועים בריקטסיה ולא נגועים, ולא סיפקו ראיות, לפחות במחקר זה, ל שיעורי הפריה גדולים יותר על ידי נקבות נגועות ריקטסיה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע אם זרע בין ספציפי יכול להפרות ביצים.
אם לא נצפתה הפריה, אפשר לגבות ולבדוק אם הזרע מועבר במהלך ההזדווגות על ידי התבוננות בזרע של הנקבה. אם ההפריה מתרחשת, אפשר להשוות את יחס המין של מבוגרים עם שיעור ההפריה כדי לקבוע את הכדאיות של התפתחות צאצאים היברידיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה ציטוגנטית חדשנית המשתמשת ב-DAPI להערכת שיעור ההפריה ויחס המין הראשוני של המזיק הפולש ההפלופלואידי Bemisia tabaci. הפרוטוקול נועד לשפר את ההבנה של התנהגות החרקים הלבנים והאקולוגיה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ציטוגנטיקה
- אקולוגיה
- אנטומולוגיה
רקע
- ציפורים לבנות הן חרקים הפלודיפלואידיים.
- שיעור ההפריה נמצא במתאם עם יחס המינים בעת ההטלה.
- טכניקה זו היא הראשונה מסוגה המתוארת עבור ציפורים לבנות.
- הבנת שיעורי ההפריה יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות להדברת מזיקים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לקביעת שיעורי ההפריה של הפספוסה הלבנה.
- שיפור הידע על האקולוגיה וההתנהגות של הפספוסה הלבנה.
- מתן פרוטוקול מהיר ויעיל עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת חור הניתן לכיסוי בצלחת פטרי לטיפול בבפגנים לבנים.
- הקמת תא לחות לתנאים אופטימליים.
- ייצור גשש דק למניפולציה מדויקת.
- ביצוע צביעת DAPI להערכת שיעורי הפריה.
תוצאות עיקריות
- ניתן להשלים את הפרוטוקול בתוך שלוש שעות.
- הוא מאפשר קביעה מדויקת של שיעורי ההפריה.
- התוצאות יכולות לשפר את ההבנה של דינמיקת האוכלוסיות של הwhitefly.
- מספק בסיס למחקרים עתידיים בנושא ניהול מזיקים.
מסקנות
- טכניקה זו מהווה התקדמות משמעותית במחקר על זבובים לבנים.
- היא מציעה שיטה מהימנה להערכת פרמטרים רבייתיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לבחון השפעות אקולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
קביעה כמותית של שיעורי הפריית ביצים ב-Bemisia tabaci באמצעות צביעת DAPI ציטוגנטית מאפשרת מדידה ישירה של יחסי מין ראשוניים, פרמטר קריטי למידול דינמיקת אוכלוסיות של מזיקים. יכולת זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף מטרות להתערבויות המשפיעות על ביולוגיה רבייתית. השיטה מספקת זרימת עבודה סטנדרטית להערכת ההשפעה של גורמים גנטיים או סביבתיים על הקצאת מין, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון בשרשראות פיתוח של ביוטכנולוגיה חקלאית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מנגנוני רבייה ונתיבי הקצאת מין במזיקים הפלופלואידיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת השפעתם של אנדו-סימביונטים או גורמים גנטיים על תוצאות ההפריה.
- מסייע במידול חיזוי של מבנה האוכלוסייה לצורך תיקוף יעדים באסטרטגיות להדברת מזיקים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה ציטוגנטית הניתנת לשחזור לצורך כימות שיעורי הפרייה ויחסי מין ראשוניים.
- מסטנדט את הכנת הדגימה והדימוג עבור מחקרים השוואתיים המשכיים.
- מאפשר הערכה מהימנה של משתנים ניסויים המשפיעים על הצלחת הרבייה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים מעבדתיים לדינמיקה של אוכלוסיות רלוונטית לשטח, על ידי קישור שיעורי הפריה ליחסי המין בקרב בוגרים.
- תומך ברצף מהגילוי המכניסטי ועד למחקרים תרגומיים על התערבויות למשכיות מזיקים.
- מפחית את הסיכונים הכרוכים בקידום אסטרטגיות של בקרה ביולוגית או שינוי גנטי, באמצעות אספקת נקודות קצה רבייתיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקה ציטוגנטית זו משתלבת ברצף מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני בביוטכנולוגיה חקלאית, ותומכת בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות רבייתיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה את ההפריה ואת הקצאת המין כדי להבהיר נתיבים רבייתיים ולבחון היפותזות סביבתיות או גנטיות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וסטנדרטיות לצורך ניתוח השוואתי של טיפולים ניסיוניים.
- אנליזה: מספקת מדידות המבוססות על צביעת גרעין התא כדי לתמוך בהשוואה סטטיסטית של שיעורי הפריה ויחסי מינים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין בדיקות מעבדה לתוצאות ברמת האוכלוסייה הרלוונטיות להדברת מזיקים.
- שימוש חוזר במיזם: מציעה פרוטוקול לשימוש חוזר שניתן להתאימו למחקרים של מינים מזיקים או מינים הפלואדיפלואידיים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בביולוגיה של הרבייה ובתיקוף מטרות לבקרת מזיקים.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה מהיר, סטנדרטי וניתן לשחזור לצורך ניתוח ציטוגנטי.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקת התערבויות המכוונות למנגנוני רבייה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של אסטרטגיות בקרים ביולוגיות וגנטיות על בסיס נקודות סוף רבייתיות כמותיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בציטוגנטיקה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטיפול בדגימות.
- נדרשת גישה לריאגנטים לצביעת DAPI, לתשתית דימוי פלואורסצנטית ולמתקנים לטיפול בטוח בחומרים כימיים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות (reproducibility) ויכולת השוואה של הנתונים.
- ניתן להתאים למינים אחרים בעלי רבייה הפלואדיפלואידית או למיני מזיקים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות כוללות את הצורך בהכנה קפדנית של הדגימות ואפשרות לשונות בטיפול בביצים.
