ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות
5 במאי 2020
פרוטוקול זה מתאר גישה מגובשת לניתוח עצבי הפנים במודל החולדה, כולל תיאורים של דפוסים inducible שונים של פציעה.
פרוטוקול זה יכול לעזור למדענים לחקור תוצאות לאחר פגיעה בעצב הפנים ושיטות לשיפור ההתחדשות על פני פרמטרים רבים ושונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי האנטומיה של החולדה מאפשרת גישה קלה לעצב הפנים, ואת קנה המידה הגדול שלה מאפשר לנו ללמוד את כל דפוסי הפציעה הרלוונטיים. היישומים של טכניקה זו להרחיב לקראת שיקום של המטופלים לאחר פגיעה עצבית בפנים.
כפוטנציאל הרגנרטיבי החולדה מספקת מודל ניסיוני מתרבה ותמציתי. שיטה זו יכולה לספק תובנה על טיפולים כירורגיים ורפואיים עבור ניתוח עצב הפנים או שיתוק. וזה ניתן לתרגום לדגמי ראש וצוואר אחרים או לעצבים היקפיים אחרים.
לפעול תחת מיקרוסקופ באמצעות שתי הידיים יכול להיות מאתגר. אני ממליץ להתאמן באמצעות גרסה משקפת תחת המיקרוסקופ לפני שתנסה ניתוח עצב הפנים. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להחיל משחה על העיניים של החולדה לגלח את האזור הכירורגי.
להקים שיטה לזיהוי חולדה ולה מניחים גליל גזה מתחת לצוואר. לחטא את העור החשוף עם שלושה כלורקסידין לסירוגין ו 70% קרצוף אתנול ולהניח את החולדה תחת מיקרוסקופ סטריאו. לתפעל את האוזן ipsilateral בכיוון אחורי-anterior כדי לקבוע את הקיפול הטבעי של העור postauricular.
השתמש בלהב מספר 15 כדי לבצע חתך של שניים עד שלושה מילימטרים בקמט הפוסט-אורקולרי. התכנון ומיקום החתך הם הצעדים הקריטיים ביותר להבטחת זיהוי אמין של עצב הפנים תוך מזעור גודל הפצע. לנתח בבוטות דרך fascia תת עורי מיידית ולה מניחים מפשק מיקרו-Weitlaner כדי לשפר את החשיפה לרקמות.
זהה את שריר digastric לפני שהוא נע בכיוון נחות עד מעולה לכיוון החדרתו לאורך בסיס הגולגולת. מורחים בעדינות דרך בטן השריר לאורך נקודת החדרת השריר כדי לחשוף את הגיד של הבטן digastric לפני. הגיד יופיע כתהליך לבן מצולם שנושר מהשריר עם הכנסה מוצקה לבסיס הגולגולת.
לאחר זיהוי של שריר digastric anterior והגיד שלה, להתאים את מפשק Weitlaner כדי להמשיך לסגת בטן השריר. האזור החשוף הוא החלל התלת מימדי שבו נמצא הגזע הראשי של עצב הפנים. לנתח לאורך העצב בכיוון נחות distally מהיציאה של foramen stylomastoid.
כדי לגרום לדפוס פגיעה במחוץ, השתמש במדפים של תכשיטן חלק כדי לתפוס היטב ולדחוס את העצב החלת לחץ קבוע לשחזור במשך 30 שניות כדי להבטיח פציעת ריסוק מתאימה. עבור transection פשוט, לתפוס את האפינוריום המיידי overlying העצב עם מטלאים דק שיניים, ולהשתמש microscissors חדים כדי לחתוך את העצב בצורה נקייה בנקודה הרצויה עם חתך אחד. עבור מודל פער עצבי, השתמש calipers מתכוונן כדי להגדיר את אורך פער העצבים הרצוי כדי להבטיח דפוסי פציעה דומים בין בעלי חיים ולהפוך את העצב כפי שהוכח רק.
לאחר הפציעה הניסיונית נמסר, להשקות את הפצע עם מלוחים סטריליים ולייבש את הרקמה עם גזה סטרילית. לפני סגירת חתך העור על פי הנחיות מוסדיות. כאן, הדמיה חיה של תא המטען הראשי של עצב הפנים עם פציעת ריסוק בערך שניים עד שלושה מילימטרים דיסטלי עד לנקודת הענף של PES הראשון בחולדת Thy1-GFP מהופנטת בוגרת מוצגת.
הערכה של החזרה ההדרגתית של פלואורסצנטיות בשבוע אחד, שניים, שלושה וארבעה שבועות לאחר פציעה יכולה לשמש כסמן לניטור התחדשות העצבים בבעלי חיים מהו מהומנים אלה. ניתוח היסטומורפי ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות חתך של חלוקת הלסת השולית המאפשר כימות של קוטר האקסונאלי, כמות פסולת, סיבי עצב, אחוז העצב, ומדידות צפיפות. חשוב לעתים קרובות להתאים את המיקום של המפשק לפי הצורך כדי להבטיח כי העצבים האנטומיים הרלוונטיים גלויים בעת זיהוי עצב הפנים.
בעקבות הליך זה ניתן לקצור את העצבים והשרירים הרלוונטיים לניתוח אימונוהיסטוכימי כדי להעריך את מידת ההתחדשות ביחס לקבוצות ניסיוניות אחרות. בעקבות התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בחקר התוצאות התפקודיות לאחר פגיעה בעצב הפנים. באופן ספציפי, כיצד להשפיע על תופעת הסינקינזה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט גישה הניתנת לשחזור לניתוח עצב הפנים במודל של חולדה, תוך התמקדות ספציפית בדפוסי פגיעה ותוצאות רגנרטיביות. הוא מאפשר חקירה של טכניקות כירורגיות וטיפולים רפואיים לשיקום פגיעות בעצב הפנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- מודל החולדה מאפשר גישה קלה לעצב הפנים.
- טכניקת ניתוח זו יכולה לסייע בהערכת פגיעות עצביות ובשיטות ל regeneration.
- המאפיינים האנטומיים של החולדה מאפשרים מחקר מפורט של דפוסי פגיעה שונים.
מטרת המחקר
- להערכת גישות טיפוליות עבור שיתוק או חולשה של עצב הפנים.
- לשיפור ההבנה של תהליכי התחדשות לאחר פגיעות בעצב הפנים.
- לפיתוח טכניקה כירורגית מפורטת שניתן לשחזר במחקרים שונים.
שיטות ששימשו
- המחקר משתמש במודל של חולדה לצורך התערבות כירורגית בעצב הפנים.
- ההליכים המרכזיים כוללים פגיעת מעיכה (crush injury) וניתוק (transection), כאשר שלבים כירורגיים ספציפיים מפורטים לצורך הבטחת אמינות.
- דימות חי (Live imaging) ואנליזות היסטומורפומטריות משמשים למעקב אחר תוצאות ההתחדשות.
- שם דגש על נתיחה שיטתית תחת מיקרוסקופ, הדורשת מיומנות והכנה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה ומניפולציה מוצלחות של עצב הפנים מאפשרות הערכה של תהליכים רגנרטיביים.
- דימוי פלואורסצנציה וניתוח היסטומורפומטרי מספקים מדדים כמותיים של התאוששות העצב.
- הטכניקה חושפת תובנות חשובות לגבי תופעות סינקינזיה בעקבות פגיעה עצבית.
מסקנות
- מחקר זה מבסס פרוטוקול יסוד לניתוח פגיעה והתחדשות של עצב הפנים.
- הוא מאפשר לחוקרים לבחון תוצאות תפקודיות וגישות טיפוליות בשיקום עצבי.
- המתודולוגיה מדגימה השלכות משמעותיות ליישומים רחבים יותר במחקרי עצבים פריפריים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל פגיעה בעצב הפנים של חולדה מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת התחדשות אקסונלית ועכבה, ובכך תומך בתיקוף מטרות בפיתוח טיפולים נוירו-רגנרטיביים. יכולת ההרחבה והנגישות האנטומית שלו מאפשרות הערכה עקבית של דפוסי פגיעה ותגובות התחדשות, ובכך מקלות על הפחתת סיכונים בשלב הפרה-קליני עבור מועמדים נוירוטרופיים או אנטי-אינהיביטוריים. מודל זה מגשר בין מחקר גילוי למחקר תרגומי על ידי אספקת מדדים היסטו-מורפומטריים ותפקודיים כמותיים הרלוונטיים לאסטרטגיות של תיקון עצב הפנים בבני אדם.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני עיכוב אקסונליים ומסלולי רגנרציה בעקבות פגיעות מוגדרות של מעיכה, חיתוך או פער בעצב.
- ערך תפעולי: תומך בהגשה עקבית של תאים או ריאגנטים נוירו-אקטיביים כדי להעריך מעורבות של מטרה ומודולציה של מסלולים.
- ערך ניבוי: כימות היסטו-מורפומטרי של קוטר אקסונים, צפיפות סיבים ופינוי פסולת מספק מדדים אובייקטיביים ליעילות המטרה ולהפחתת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מודלים סטנדרטיים של פגיעה המתאימים לסריקה בעלת שחזוריות גבוהה של תרכובות פרו-רגנרטיביות או אנטגוניסטים מעכבים.
- תוצרים כמותיים: דימוי חי של אקסונים המסומנים פלואורסצנטית ואנליזה היסטומורפומטרית מאפשרים מעקב רגנרטיבי כמותי ואורכי.
- יכולת הרחבה: מודל החולדה מאפשר מניפולציה כירורגית במקטעי עצבים שונים, החל מתוכנית הגולגולת ועד למקטעים חוץ-טמפורליים, ובכך תומך בהערכה רב-פרמטרית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת הערכה של התאוששות תפקודית וצמצום סינקינזיה, בהתאמה למדדים קליניים בשיקום עצב הפנים.
- מידול פרה-קליני: מאפשר הערכה של מניפולציות במערכת העצבים המרכזית או באיברי המטרה, ושל טיפולים תאיים במערכת עצבים פריפרית הרלוונטית למחלה.
- קידום מותאם סיכונים: שיעורי הישרדות אמינים ועקביות בין-מינית תומכים בהחלטות go/no-go לפני מעבר למידול במינים מסדר גבוה יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
המודל משתלב בתהליכי הגילוי על ידי מתן אפשרות לתיקוף מטרה באמצעות פגיעה מבוקרת בעצב, התקדמות לפיתוח בדיקה לסריקת תרכובות, ותמיכה בהערכה פרה-קלינית של טיפולים רגנרטיביים באמצעות מדדי תוצאה פונקציונליים ומבניים.
- ביולוגיה של התגליות: מאפשרת בדיקת השערות לגבי מעכבים ומעודדים של צמיחת אקסונים באמצעות פרדיגמות פגיעה סטנדרטיות.
- סריקה: מספקת מודלים הדירים של פגיעה עצבית להערכת השפעות של תרכובות על קינטיקה ודיוק של הרגנרציה.
- אנליטיקה: מדדים היסטומורפומטריים ומבוססי פלואורסצנציה מספקים נתונים כמותיים לניתוח תגובה למנה ומעורבות מטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר מדדי רגנרציה אקסונלית לתוצאות פונקציונליות כמו סינקינזיס, ובכך תומך ברלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה כירורגית שניתן להשתמש בה שוב לבדיקות איטרטיביות על פני מספר מודליות טיפוליות ונקודות זמן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחדשות אקסונלית באמצעות מדדי פגיעה והתחדשות כמותיים וניתנים לשחזור.
- ערך תפעולי: טכניקות ניתוח סטנדרטיות ופרוטוקולים להערכה לאחר הניתוח משפרים את העקביות בין מעבדות ואת אמינות הנתונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות מוקדמות של go/no-go על ידי הבהרת הביולוגיה של המטרה והפחתת הסיכון לכישלון בתוכניות לשיקום עצבי בשלבים מאוחרים יותר.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לשיקום עצבי בהתבסס על מודולציה מאומתת של המטרה במודל של עצב פריפריאלי בעל רלוונטיות קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה והיכרות עם נוירו-אנטומיה של מכרסמים תחת הנחיה של מיקרוסקופ סטראו.
- תלות במכשור ייעודי הכולל רטרקטורים מסוג micro-Weitlaner, פינצטות צורפים, מיקרו-מספריים וקליפרים מתכווננים להשראת פגיעה סטנדרטית.
- מחייב שימוש בקווי דורגנים של רפורטרים (למשל, Thy1-GFP) או עיבוד אימונוהיסטוכימי למעקב אקסונלי אורך וניתוח היסטו-מורפומטרי.
- דורש פרוטוקולים של טיפול פוסט-אופרטיבי כדי להבטיח את הישרדות החולדות ולמזער משתנים מתערבים בהערכת הרגנרציה.
- יכולת מניפולציה גנטית מוגבלת בהשוואה למודלים של עכברים עשויה להגביל את הניתוח המכניסטי באמצעות גישות של knockout גנטי או ביטוי יתר.
