Name: הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למדו שיטת הסעה משופרת מונחית MRI להזרקת וקטורים ויראליים אופטוגנטיים למוח מקוק רזוס. שיטה זו מאפשרת ביטוי אופטוגנטי נרחב באזורים קורטיקליים גדולים לחקר פעילות עצבית במכרסמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית למחקר בתר-דוקטורט (AY), הגנה מתקדמים מחקר פרויקטים הסוכנות (DARPA) התארגנות ופלסטיות כדי להאיץ שחזור פציעה (תיקון; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ועל ידי המרכז לדימות מדעי המוח. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של יוניס קנדי רעד של בריאות הילד & התפתחות האדם של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס מספר K12HD073945, המרכז הלאומי לחקר הפרימטים של וושינגטון (WaNPCR, וסטנג p51 OD010425), ו המרכז למדעי המוח (CNT, מרכז המדע הלאומי לחקר הנדסת בסיס במסגרת גרנט EEC-1028725). אנו מודים לקאמילו דיאז-בוטיה, טים הנסון, ויקטור ח'אזייה, דניאל סילברסמית ', קארן ג'יי מקלאוד, ג'וליאנה, ובלייקלי אנדרוס על עזרתם בניסויים ובנאן טיאן, ג'יווי הוא, פיטר לדוצ'ניש, מישל מהריביז, וטוני האון לעזרה טכנית.

כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בעלי חיים הוועדה השימוש (IACUC) והם תואמים את המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. ההליך הבא נעשה באמצעות שני רזוס קופי מבוגר הזכר של 8 ו 7 שנים של גיל, במשקל 17.5 ק"ג ו 16.5 ק"ג (קוף G ו-J קוף), בהתאמה.
הערה: השתמש בטכניקות התקן אספטי עבור כל ההליכים כירורגי.
1. הדמיה בסיסית
<ol><li>הרגעה וצנרור החיה ושמירה על הרדמה כללית תחת isof, הריכוז השתנה בין 0 ל -5% לפי הצורך, תלוי בסימנים חיוניים כגון קצב הנשימה וקצב הלב. עקוב אחר טמפרטורת החיה, קצב הלב, רווית החמצן, תגובות אלקטרוקרדיוגרפיות, והלחץ החלקי בקצה השני של CO2 לכל אורך התהליך.</li>
	<li>הנח את החיה במסגרת סטריאוטקאית תואמת MR (עיין בטבלת החומרים) שבה היא תישאר לאורך כל התהליך. חבר את בעל החיים למכונת התאמה למחשב הנייד התואם ל-MR, והרכב אותו לסורק ה-MRI (3 T).</li>
	<li>לרכוש T1 סטנדרטי (להעיף זווית = 9 °, זמן חזרה/הד זמן = 668.6, מטריצה גודל = 192 x 192 x 80, עובי פרוסה = 1 מ"מ) ו T2 (להעיף זווית = 130 °, זמן חזרה/הד זמן = 52.5, גודל מטריצה = 256 x 256 x 45, עובי פרוסה = 1 מ"מ) האנטומיה התמונות MR כבסיס התייחסות ותכנון כירורגי.</li>
	<li>לשחזר את החיה מהרדמה ולהעביר אותו לאזור המגורים בעלי חיים.</li>
	<li>השתמש בתמונות T1 ו-T2 שנרכשו כדי לקבוע את המיקום של פתיחת הגולגולת. המיקום של פתיחת הגולגולת ניתן לקבוע בדיוק על ידי התאמת האזור הקליפת המוח של העניין MR עם אטלס המח מקוק (Paxinos, חואנג , פטרידה, טוגה 2 מהדורה). בנוסף, תמונות בסיסיות אלה יכולות לספק אומדן עבור מיקומי העירוי הנגיפי. אזורי העניין הקורטיקליים. הפגינו כאן הם M1 ו-S1</li>
</ol>2. MR-השתלת הקאמרית התואמת
<ol><li>הרגעה וצנרור החיה ושמירה על הרדמה כללית עם ניטור סטנדרטי הרדמה כמו ב 1.1.</li>
	<li>הנח את בעל החיים במסגרת הסטריאוטקאית התואמת ל-MR, בה הוא יישאר במהלך השרשה קאמרית ומשלוח וקטורי ויראלי. חברו את בעל החיים למכונת. התאמה למחשב הנייד של מר מיסטר</li>
	<li>צור חתך משונן כ 2 ס מ מקו האמצע עם אורך של כ 5 ס מ עם אזמל.</li>
	<li>הסירו את הרקמה הרכה הבסיסית מהגולגולת באמצעות מעליות (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>צור פיום גולגולת עגול (2.5 ס מ) כדי לכסות את התוואי המתוכנן מראש לזריקות באמצעות טרפין (ראו טבלת חומרים).<ol>
<li>הנמך את נקודת המרכוז של הטרפין מעבר לקצה הטרפין. צרו כניסה במרכז פתיחת הגולגולת המתוכננת בצורה מספקת בתוך הראש כדי לעגן את הטרפין באמצעות נקודת המרכוז הניתנת לכוונון של הטרפין. היזהרו כדי למנוע חדירה לחלוטין דרך עומק הגולגולת כמו זה יכול לגרום נזק לרקמות העצביות הבסיסית.</li>
		<li>מדי פעם מרוקן את האזור עם תמיסת מלח לפי הצורך כדי לשמור על לחות הרקמה במהלך פתיחת הגולגולת.</li>
		<li>ברגע שהמרכז נעשה, הנמך את הטרפין על הגולגולת וסובב את הטרפין בכיוון השעון ונגד כיוון השעון בזמן החלת לחץ כלפי מטה עד שמכסה העצם ניתן להסרה באמצעות מלקחיים. היזהרו להימנע מפגיעה ברקמה הבסיסית עם הטרפין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפתיל תפר דק (גודל 6-0) דרך הדורא במרכז פתיחת הגולגולת והרימו את הדורה על ידי משיכת בעדינות את התפר ממשטח המוח היוצר אוהל במרכז פתיחת הגולגולת.</li>
	<li>לאחר מכן, נקב את השכבה בסמוך למרכז האוהל באמצעות מספריים אופטלמולוגיות משובחים כדי למנוע פגיעה במוח. לאחר מכן חותכים את הדורא מהמרכז עד לקצה הפיום וממשיכים לאורך הקצה בעזרת מספריים בעלי אופלית.</li>
	<li>הר הגלילי מותאם אישית (איור 1; ראה סעיף 4 לקבלת הוראות הפקה) לגולגולת על גבי פתיחת הגולגולת כדי לספק תמיכה בצינורית במהלך עירוי לח כגון העקמומיות של האוגן הקאמרית מיישרת טוב. עם העקמומיות של הגולגולת</li>
	<li>לאבטח את השתלים לגולגולת באמצעות ברגים פלסטיק ואקריליק שיניים או כמה ברגים טיטניום.</li>
</ol>3. משלוח וקטורי נגיפי
<ol><li>זמן קצר לאחר השתלת החדר תואם MR והכנסת צינורית הזרקה (איור 1A-B, איור משלים 1) לתוך החדר, למלא את הרשת עם תמיסת מלח (0.9% הנאל) להמחיש את מיקומי ההזרקה באמצעות תמונות אנטומיים MR ו ממלאים את החללים הקאמריים בג שנספג בלחות רטובה כדי לשמור על לחות המוח (איור 1F).</li>
	<li>מכסים את העור ואת הצילינדר עם כיסוי מיקרוביאלית סטרילי לשמור על עקרות של צילינדרים במהלך הובלה וחליטות מר. מניחים קפסולת ויטמין E כדי לסמן את החלק העליון של רשת ההזרקה לזיהוי חיובי.</li>
	<li>בעוד שהחיה נשארת מטוצרת, מנתק את הצינורית האנדוקנה ממעגל ההרדמה ומחבר אותו למכונת מחשב מותאמת מאוד לMR, ומשגר את החיה לסורק ה-MRI.</li>
	<li>רכישת תמונות T1 (זווית היפוך = 9 °, זמן חזרה/הד זמן = 668.6, גודל מטריצה = 192 x 192, עובי פרוסה = 1 מ"מ, 80 פרוסות) כדי לחשב את המרחק מראש רשת ההזרקה ואת משטח קליפת הדופן. הקפסולה ויטמין E הוא גלוי בבירור תמונות T1 ויש להשתמש בו כסמן עבור החלק העליון של רשת ההזרקה (איור 2A). השתמש בכלי הסרגל של תוכנת הדימות של MR כדי למדוד את המרחק בין החלק העליון של רשת ההזרקה לבין משטח קליפת האדמה.</li>
	<li>לרכוש תמונות T2 (זווית היפוך = 130 °, זמן חזרה/הד זמן = 52.5, גודל מטריצה = 256 x 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, 45 פרוסות) כדי לקבוע את מדריכי הצינורית האופטימליים עבור כל אתר המבוסס על אתר ייעודי של אינפוזיה (איור 2B-C). כפי שהוזכר קודם לכן, רשת הצינורית מלאה בתמיסת מלח, שהיא הטובה ביותר הנראית בתמונות T2. באמצעות תוכנת הדמיה MR, לגלול דרך מטוסי ילתית ו משונן למצוא את מיקום היעד של אינפוזיה.</li>
	<li>לאחר הפשרה וקטור ויראלי למשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, לערבב את וקטור ויראלי עם הסוכן הניגודיות MR gadoteridol (יחס של 250:1; 2mM Gd-DTPA, ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטה או מערבולת ערבוב. הערה: הטכניקה המוצגת נבדקה עבור וקטורים AAV עם ביטוי הנהיגה CamKIIa מיזם של C1V1 התמזגו כדי EYFP (AAV 2.5-Camkiia-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 מולקולות וירוס/mL; ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לטעון את הווירוס מעורב לתוך 0.2 mL לחץ גבוה העירוי צינורות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הקמת שדה סטרילי מחוץ לסורק MR להכנת קו העירוי הנגיפי.</li>
	<li>באמצעות צינורות העירוי בלחץ גבוה, לחבר קו הארכה ארוך (כ 3-5 מטרים, בהתאם למיקום של משאבת האינפוזיה ביחס MR נשא) למזרק תואם MR 3 מ ל ו הראשי עם תמיסת מלח.</li>
	<li>לחבר את הקצה המרוחק של קו השלוחה הארוכה אל הקצה החזיתי של הצינורות 0.2 mL IV טעון עם הווירוס ולצרף את הצינורית עמידים לריפלוקס עם טיפ 1 מ"מ צעד (איור 2D; ראה סעיף 5 לקבלת הוראות הפקה) עד הסוף של הרכבה עם מחבר קטטר סגנון התפס (ראה טבלת חומרים) (איור 2e).</li>
	<li>לבסוף, הגדר את המזרק במשאבה תואמת MR (ראה טבלת חומרים). הנח את בקר המשאבה בחדר הבקרה של הסורק כפי שהוא אינו תואם ל-MR.</li>
	<li>באמצעות התמונות האנטומיות בסיסית MR שהתקבלו לפני, בחר את מיקום רשת ההזרקה ועומק ההכנסה הדרושים כדי להגיע לאתר העירוי של היעד. סמן את עומק ההכנסה על הצינורית באמצעות קלטת סטרילית.</li>
	<li>התחילו את העירוי בקצב של 1 μL/min ומאמתים באופן חזותי את זרימת הנוזל בקו האינפוזיה על ידי התבוננות בפליטה של נוזלים מהצינורית.</li>
	<li>הכנס את הצינורית באופן ידני דרך רשת ההזרקה לעומק היעד תוך שמירה על הזרימה בקו העירוי, מאחר שפעולה זו תמנע מהרקמה המוחדרת לסתימת הצינורית במהלך ההכנסה.</li>
	<li>לרכוש מהר (2 דקות) פלאש T1 משוקלל תמונות (להעיף זווית = 30 °, זמן חזרה/הד זמן = 3.05, גודל מטריצה = 128 x 128, פרוסה עובי = 1 מ"מ, 64 פרוסות) עבור ניטור מקוון של עירוי וקטורי ויראלי.</li>
	<li>לאחר החדרת החוצה ~ 10 μL של וקטור כזה וירוס מספיק מוחדרת לזהות בסורק MR, להשיג תמונות MR כדי לוודא את המיקום הנכון צינורית כפי שניכר על ידי התפשטות נצפתה של הווירוס. אם העומק של הצינורית שנוספה שגויה, כוונן את העומק בהתאם או הוצא לאט את הצינורית ונסה שוב לבצע את ההוספה כמו ב-3.12.</li>
	<li>ניטור האינפוזיה באמצעות הדרכה של תמונות MR מקוונת (פלאש T1 משוקלל) ולהגדיל את קצב העירוי ל 5 μL/min על ידי 1 μL/min צעדים מדי כמה דקות (איור 3A).</li>
	<li>לאחר החדרת כ 40 μL של וקטור ויראלי, להתחיל להקטין את קצב האינפוזיה על ידי 1 μL/min שלבים ולעצור את האינפוזיה לאחר ~ 50 μL מוזרק ולהשאיר את הצינורית במקום 10 דקות.</li>
	<li>הסר את הצינורית באיטיות מהמוח ועבור למיקום הבא. חזור על שלבים 3.9 עד 3.19 עבור כל מיקום.</li>
	<li>לכסות את הצילינדר עם כיסוי סטרילי בסוף הזריקות, לפני הובלה בעלי חיים. ואז להעביר את החיה. לחדר הניתוח</li>
	<li>או לחקור את התא תואם MR ולסגור את החתך כירורגי על ידי החלפת כנף העצם ושריר על גבי ואת העור באמצעות טכניקות אספטי סטנדרטי או להחליף את החדר עם גליל טיטניום ודורה מלאכותי (ראה יזדדן-שאהורל ואח ' 20169) להקלטה עצבית ולגירוי.</li>
</ol>4. הפקה קאמרית מותאמת לMR
<ol><li>הרכיבו צינורית ניילון ברשת ההזרקה (איור 1A-B) בעיבוד שבבי לפי המידות שצוינו (איור משלים 1).</li>
	<li>3D להדפיס את הצילינדר תואם MR מתוך יריעות אקרילוניטריל בוטריפן (ABS0 פלסטיק (איור 1C-E) (ראה קובץ משלים 1 – 3; ראה טבלת חומרים עבור מדפסת תלת-ממד וחומרים). הערה: עיצוב אחד שומר על רשת הזרקת צינורית קבועה בתוך גליל תואם MR (איור 1C), בעוד אחרת מאפשר סיבוב של הרשת, הרחבת אזור ההזרקה (איור 1C-E).</li>
	<li>הפתיל רשת הזרקת צינורית ולהקיש על החלל המקביל של התא תואם MR, כך ששתי החתיכות מוצג השחלה זהה. הערה: ניתן להשתמש בכל סוג של השחלה בתנאי שלשני הרכיבים יש את אותו השרשור.</li>
	<li>הכנס צינורית ניילון הזרקת הרשת על ידי לתוך החור הקיש של גליל תואם MR.</li>
</ol>5. הפקת צינורית עמיד בפני הריפלוקס13
<ol><li>לגזור צינורות סיליקה 30 ס מ עם 0.32 מ"מ מזהה ו 0.43 mm OD עבור צינורות סיליקה הפנימי (ראה טבלת חומרים) באמצעות להב תער.</li>
	<li>חותכים 7.5 ס מ ארוך ו 5 ס"מ-סיליקה אבובים עם מזהה 0.45 מ"מ ו 0.76 mm OD עבור צינורות סיליקה החיצוני (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לדבוק את צינורות 7.5 ס מ החיצוני לצינורות הפנימי 30 ס מ עם ציאנואקריאקרילי כגון הצינור הפנימי מרחיב 1 מ"מ מעבר לצינור החיצוני, מה שהופך את הצעד עמידים לריפלוקס (איור 2D). כדי לוודא כי הציאנואקריאקרילי אינו נכנס לתוך הצינורות הפנימיים, מניחים את הציאנואקריאקרילי על החלק החיצוני של הצינורות הפנימיים הרחוקים מהצינורית.</li>
	<li>הדבק את הצינורות באורך 5 ס מ לקצה השני של אבובים הפנימי עבור מצורף בסגנון קלאמפ מחבר קטטר (ראה שלב 3.10).</li>
</ol>

<ol><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li>
<li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li>
<li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839(2018).</li>
<li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys%3B+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li>
<li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li>
<li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided%2C+convection+enhanced+delivery+%28CED%29+of+AAV+vector+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li>
<li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).</li>
<li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li>
<li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li>
<li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li>
<li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li>
</ol>

להיקפית יש אינטרס פיננסי בחברת נוירולינק, חברה המפתחת טיפולים קליניים באמצעות גירוי מוחי.

כאן, אנו מתווה טכניקה אפשרית ויעילה להשגת ביטוי האופגנטי בקנה מידה גדול ב-NHP המוח העיקרי של התפקוד המוטורי וקליפת המנוע של MR-מונחה. השימוש MR-מונחה מציג יתרונות משמעותיים על שיטות מסורתיות של עירוי ויראלי במוח NHP. יתרון אחד כזה הוא היכולת להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים ובעלי חליטות פחות נדרשות. למשל, עם שיטות קונבנציונליות, זריקות מרובות של 1-2 μl של ביטוי תשואה וקטורית באזור בקוטר 2-3 מ"מ1,2,5,...

אלקטרואופטיקה היא כלי רב עוצמה המאפשר מניפולציה של פעילות עצבית וחקר חיבורי הרשת במוח. יישום טכניקה זו בפרימטים לא אנושיים (NHPs) יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את ההבנה שלנו של חישוביות עצבית בקנה מידה גדול, קוגניציה והתנהגות במוח הפרימטים. למרות אלקטרואופטיקה יושמה בהצלחה nhps בשנים האחרונות1,2,3,4,5,6,7, אתגר כי פנים החוקרים משיג רמות גבוהות של ביטוי על פני אזורי מוח גדולים בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים גישה יעילה ופשוטה כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בקופי. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשפר את המחקרים אלקטרואופטיקה הנוכחי בבעלי חיים אלה בשילוב עם הקלטת המדינה האמנות8,9 ו גירוי אופטי10 טכנולוגיות.
הסעה משופרת משלוח (למעלה) היא שיטה הוקמה של משלוח של סוכני תרופתי ומולקולות גדולות אחרות, כולל וקטורים ויראלי, למערכת העצבים המרכזית11,12,13. בעוד שיטות המסירה המקובלת כרוכות במספר חליטות של נפח נמוך מספר מפוזרים על פני אזורים קטנים במוח, משרד הרישוי יכול להשיג הפצה רחבה יותר ואפילו יותר של הסוכן עם פחות חליטות. זרימת נוזל בצובר מונחה לחץ (הסעה) במהלך האינפוזיה מאפשר התמרה נרחבת יותר ואחידה מופץ של רקמת היעד בעת אספקת וקטורים ויראלי עם לח. במחקרים שנעשו לאחרונה, הדגמנו את התמרה ואת הביטוי האופגנטי העוקב של אזורים גדולים של מנוע ראשי (M1) והסוחושי (S1) הקורמיתיים9 ו תלמוס14 באמצעות תהודה מגנטית (MR)-מונחה.
כאן, אנו מתווה את השימוש ב-, כדי להשיג ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים עם רק כמה זריקות קורטיקלית.

<table><tbody><tr><td>0.2 מ"ל צינורות IV בלחץ גבוה</td><td>Smiths Medical Inc., דבלין, אוהיו, ארה"ב</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0.32 מ"מ ID, 0.43 מ"מ OD צינורות סיליקה</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 מ"מ ID, 0.76 מ"מ OD צינורות סיליקה</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, אוניברסיטת פנסילבניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS פלסטיק</td><td>Stratasys, מינסוטה, ארה"ב</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>וילון חתך אנטי מיקרוביאלי</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban וילון</td></tr><tr><td>שיניים אקריליק</td><td>הנרי שיין, בע"מ</td><td>1013117</td><td>מעליות סוכן מליטה אקרילי</td></tr><tr><td></td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>מעלית לנגנבק,</td></tr><tr><td>תפר עדין</td> עם קצה רחב <td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, פרינסטון, ניו ג'רזי</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>לייזר לגירוי אור</td><td>Omicron-Laserage, גרמניה</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR תואם מזרק 3 סמ"ק</td><td>מכשיר הרווארד, הוליסטון, MA, ארה"ב</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>MR תוכנת הדמיה</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR תואם משאבה</td><td>מנגנון הרווארד, הוליסטון, MA, ארה"ב</td><td>הרווארד PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית תואמת MR</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>פריפיקס מהדק מחבר קטטר</td><td>בסגנון B-Braun, בית לחם, PA, ארה"</td><td>ב N/A</td><td></td></tr><tr><td>ברגי פלסטיק</td><td>פלסטיק 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>ברגי ניילון</td></tr><tr><td>ברגי טיטניום Crist</td><td>Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>ברגי עצם הקשה עצמית</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,</td> <td>מק"ט: GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE מדפסת תלת מימד</td><td>Stratasys, MN, ארה"ב</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>קפסולת ויטמין E</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין נספג סטרילי רטוב</td><td>פייזר בע"מ</td><td>AZL0009034201</td><td>Gelfoam</td></tr></tbody></table>

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות mri מקוונות

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

בפרימטים שאינם אנושיים (NHP) אלקטרואופטיקה, הדבקת אזורים קורטיקליים גדולים עם וקטורים ויראליות היא לעתים קרובות משימה קשה זמן רב. כאן, אנו מדגימים את השימוש של תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופר משלוח (למעלה) של אלקטרואופטיקה וקטורים ויראלי לתוך המגע הראשוני (S1) ו מנוע (M1) ממדקים של קופי לקבל יעיל, ביטוי קליפת המין הנרחב של ערוצי יונים רגישים לאור. Adeno-הקשורים ויראלי (aav) וקטורים קידוד האדום העביר אופסין C1V1 התמזגו חלבון פלורסנט צהוב (eyfp) הוזרקו לתוך קליפת התוכי רזוס ques תחת MR-מונחה על. שלושה חודשים פוסט אינפוזיה, הדמיה אפיפלורנטית אישר אזורים גדולים של ביטוי אלקטרואופטיקה (> 130 מ"מ2) ב M1 ו S1 בשני מקופי. יתר על כן, הצלחנו להקליט אמין אור מעורר התגובות האלקטרופיזיולוגיה מאזורי הביטוי באמצעות מיקרו-electrocorticographic מערכים. ניתוח היסטולוגית מאוחר יותר וכנגד העיתונאי חשף ביטוי אופגנטי נרחב וצפוף ב-M1 ו-S1 המתאימים להפצה המצוינת על ידי הדמיה אפיפלורנטית. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בתוך תקופה קצרה יותר של זמן עם נזק מינימלי לעומת טכניקות מסורתיות והוא יכול להיות גישה אופטימלית עבור אלקטרואופטיקה משלוח נגיפי בעלי חיים גדולים כגון NHPs. גישה זו ממחישה פוטנציאל רב לתפעול ברמת הרשת של מעגלים עצביים עם ספציפיות לסוג התא במודלים של בעלי חיים הקרובים ביותר לבני אדם.

הסעה משופרת משלוח (לח) תחת הדרכה MRI
התפשטות של וקטור ויראלי היה מפוקח במהלך עירוי מתחת להדרכה של תמונות MR באינטרנט (איור 3A). במחקר זה, S1 ו M1 של שני קופים היו ממוקדות (איור 3B). אמצעי ההפצה התלת-ממדיים הוערכנו בניתוח שלאחר-הוק של תמונות MR (איור 3C) כפי שמתואר על ידי yazdan-שאהמוראד ואח '. 20169,...

כאן, אנו מדגימים תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופרת משלוח (משופר) של וקטורים ויראלי לתוך קליפת המוח כגישה יעילה ומפושטת להשגת ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים במוחו של מקוק.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

משלוח משופר הסעה, או CED, של וקטורים ויראליים אופטוגנטיים אצל פרימטים שאינם אנושיים יאפשר לחוקרים לתפעל פעילות עצבית בקנה מידה גדול כדי להבין חישובים עצביים מורכבים והתנהגויות. עם CED אנו יכולים להשיג ביטוי אופטוגנטי גבוה על פני אזורים גדולים של המוח הפרימט עם רק כמה זריקות בזמן קצר לעומת שיטות מסורתיות. תהודה מגנטית או השתלת תא תואמת MR מבוצעת באמצעות תרגול סטנדרטי בניתוחי פרימטים שאינם אנושיים, ההליך מתואר בפירוט בפרוטוקול הטקסט ומתואר בקצרה בסרטון זה.לאחר הרדמה, מיקום וחתך ראשוני של בעלי חיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, צור גולגולת מעגלית כדי לכסות את המסלולים התצורתיים מראש לזריקות באמצעות טרפין. צור חריץ במרכז הגולגולת המתוכננת עמוק מספיק בגולגולת כדי לעגן את הטרפין באמצעות נקודת מרכוזה מתכווננת של הטרפין. לאחר המרכז נעשה, להוריד את trephine על הגולגולת ולסובב את trephine בכיוון השעון נגד כיוון השעון תוך הפעלת לחץ כלפי מטה עד מכסה העצם ניתן להסיר עם מלקחים.לאחר הרמת דורה כמפורט בפרוטוקול הטקסט, חותכים את הדורא מהמרכז לקצה הגולגולת וממשיכים לאורך הקצה עם מספריים עיניים עדין. הר את מותאם אישית גלילי עשה הסעה משופרת משלוח MR תא תואם לגולגולת על גבי craniotomy כדי לספק תמיכה קנולה במהלך עירוי, כך העקמומיות של אוגן התא מתיישר היטב עם העקמומיות של הגולגולת. אבטחו את השתלים לגולגולת באמצעות ברגים מפלסטיק ואקריליק דנטלי או כמה ברגים של טיטניום.זמן קצר לאחר השתלת התא תואם MR והכנסת רשת הזרקת cannula לתוך התא, למלא את הרשת עם 0.9% מלוחים להדמיית מיקומי ההזרקה באמצעות תמונות אנטומיות MR. גם למלא את חללי התא עם קצף ג'ל סטרילי רטוב לספוג כדי לשמור על הלחות של המוח. מכסים את העור ואת הצילינדר עם וילון חרוט מיקרוביאלי סטרילי כדי לשמור על סטריליות של הצילינדרים במהלך הובלה וחליטות MR.מניחים כמוסה ויטמין E כדי לסמן את החלק העליון של רשת ההזרקה לזיהוי חיובי. בעוד החיה נשארת צנרר, לנתק את הצינור האנדוטראצ'י ממעגל ההרדמה ולצרף אותו מחדש למכונת isoflurane תואמת MR ניידת. להעביר את החיה לסורק MRI.לרכוש תמונות T1 כדי לחשב את המרחק מהחלק העליון של רשת ההזרקה ואת פני השטח קליפת המוח. כמוסת ויטמין E נראית בבירור בתמונות T1 ויש להשתמש בה כסמן לראש רשת ההזרקה. לרכוש תמונות T2 כדי לקבוע את המדריכים cannula אופטימלית עבור כל אתר מבוסס על האתר הממוקד של עירוי.רשת ה Cannula מלאה מלוחים אשר נראה הכי טוב בתמונות T2. באמצעות תוכנת ההדמיה MR, גללו במישורי קורונדל וסגיטל כדי למצוא את מיקום היעד של העירוי. לאחר הפשרת וקטור ויראלי במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, מערבבים את הווקטור ויראלי עם סוכן ניגוד MR gadoteridol על ידי פיפלט או ערבוב מערבולת.לטעון את הנגיף המעורב לתוך צינורות IV בלחץ גבוה 0.2 מיליליטר. באמצעות צינורות IV בלחץ גבוה, לחבר קו הארכה ארוך למזרק MR תואם שלושה מיליליטר וראש עם מלוחים. חבר את הקצה השני של צינורות הארכה ארוכה צינורות 0.2 מיליליטר IV טעון עם הנגיף.לאחר מכן חבר את ה cannula עמיד ריפלוקס עם קצה צעד מיליליטר אחד לקצה הדיסטלי של הרכבה זו עם מחבר קטטר בסגנון מהדק. לבסוף להגדיר את המזרק במשאבה תואמת MR. באמצעות תמונות MR אנטומיות בסיסיות שהושגו, בחר את מיקום רשת הזרקת הקנולה ואת עומק ההכנסה הדרושים כדי להגיע לאתר עירוי היעד.סמן את עומק הכניסה על ה Cannula באמצעות סרט סטרילי. התחל את עירוי בקצב של microliter אחד לדקה חזותית לאמת את זרימת הנוזל בקו עירוי על ידי התבוננות פליטת נוזל מן קצה cannula. הכנס את cannula באופן ידני דרך רשת ההזרקה לעומק היעד תוך שמירה על זרימה בקו עירוי כמו זה ימנע את הרקמה חדרה סתימת cannula במהלך הכניסה.עכשיו לרכוש פלאש מהיר T1 משוקלל תמונות לניטור מקוון של עירוי וקטור ויראלי. לאחר החדרת כ 10 microliters של הווקטור כך וירוס מספיק הוא חדורים כדי לזהות בסורק MR, להשיג תמונות MR כדי לאמת את מיקום cannula הנכון כפי שניתן לראות על ידי התפשטות שנצפו של הנגיף. אם עומק ה cannula שנוסף שגוי, להתאים את העומק בהתאם או לאט להסיר את cannula מחדש את הכניסה.לפקח על עירוי באמצעות הדרכה של תמונות MR באינטרנט. הגדל את קצב העירוי לחמישה מיקרוליטרים לדקה במיקרוליטר אחד לדקה כל כמה דקות. חשוב להגדיל את קצב העירוי לאט ולא יעלה על חמישה microliters לדקה כמו שיעורי עירוי גבוהים עלולים לגרום נזק לרקמות.לאחר החדרת כ 40 microliters של וקטור ויראלי, להתחיל להפחית את קצב העירוי על ידי מיקרוליטר אחד לדקה צעדים. לעצור את עירוי לאחר כ 50 microliters מוזרק. השאירו את ה Cannula במקום במשך עשר דקות.מוציאים לאט את ה cannula מהמוח וע עוברים למקום הבא. מכסים את הצילינדר עם וילון סטרילי בסוף הזריקות לפני הובלת בעלי חיים, ואז להעביר את החיה בחזרה לחדר הניתוח. ניתוחים היסטולוגיים על קטעי קורונדל סדרתיים חושפים ביטוי אופטוגנטי בקנה מידה גדול סביב אתרי העירוי.מוצגת כאן תמונת MR קורונטל בסיסית והתפשטות סוכן הניגוד לאחר העירוי לאותה פרוסת MR coronal. קטע רקמת קורל מוצג בערך מאותו הדבר. כתמי פרוקסידאז משקפים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב או כתב EYFP.יישור טוב נצפתה בין האזור של ביטוי EYFP, נמדד עם epifluorescense פני השטח עם כתמים היסטולוגיים. אלה כוללים את האזור של התפשטות וקטור מוערך מתמונות MR. נקודות לבנות מציינות אתרי הזרקה וכל האזור השחור מייצג את האזור שנחשף על ידי הגולגולת.מוצגת כאן תמונת הגדלה נמוכה של חלקי coronal מוכתמים בנוגדן אנטי GFP המציג את ההיבט הרוחבי המדיאלי של ביטוי YFP בקליפת המוח הסומטוסנסית. ראש החץ השחור מציין את מיקום מסלול הקנה. הרקמה הסמוכה מוצגת בהגדלה גדולה יותר כדי להראות התפלגות למינארית של התאים החיוביים של YFP.אזורים מאוכלסים בצפיפות של תאים חיוביים YFP ממוקמים בעיקר בשכבות 2 עד 3 ו 5 עד 6. הגדלה נוספת חושפת תאים פירמידליים טיפוסיים בשכבות 2 עד 3, שכבה 5 ושכבה 6. חשוב להשאיר את ה Cannula במקום במשך 10 דקות לאחר הזרימה נעצרה.זה יבטיח כי הנגיף חלחל לתוך הרקמה העצבית הממוקדת שמסביב. CED היא גישה יעילה להשגת רמות ביטוי גבוהות באופן אחיד על פני אזורי מוח גדולים ביונקים. יש לו פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של מעגלים עצביים וקישוריות.לאחר התמרה ויראלית על ידי CED, ניסויי גירוי אופטוגנטיים הבאים ניתן לזווג עם הקלטה חשמלית ומסות התנהגותיות כדי לחשוף את הדינמיקה מעגל מורכב בתוך המוח. טכניקה זו הועסקה בעבר על ידי יזדן-Shahmorad ועמיתיו בשנת 2018 שבו אפנון עצבי אופטוגנטי שימש כדי לגרום לשינויים קישוריות רחבה ברשת בקליפת המוח המוטורית החושית.

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

פרוטוקול זה מתאר את השלבים וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI). ofMRI היא טכניקה חדשה המשלבת קריאת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי, ומאפשרת מיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים פונקציונליים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי.

MRI פונקציונלי optogenetic

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

כפי שמיושם כיום, אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים דורשת הזרקה של וקטורים נגיפיים למוח. שיטת הזרקה אופטימלית צריכה להיות אמינה, ועבור יישומים רבים, מסוגלת להתמקד באתרים בודדים בעלי עומק שרירותי המזוהים בקלות ובאופן חד משמעי בהיסטולוגיה שלאחר המוות. שיטת הזרקה עם תכונות אלה מוצגת.

זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

מתוארת טכניקה חדשה להעברה נרחבת של נגיף הקשור לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוס תת-עכבישי. שיטה זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים בשכבות שטחיות, אלא גם מביאה לביטוי סלקטיבי של הטרנסגן בנוירונים פירמידליים בשכבה חמש, גם כאשר משתמשים במקדם לא סלקטיבי.

התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2

פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.

שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

למדו שיטת הסעה משופרת מונחית MRI להזרקת וקטורים ויראליים אופטוגנטיים למוח מקוק רזוס. שיטה זו מאפשרת ביטוי אופטוגנטי נרחב באזורים קורטיקליים גדולים לחקר פעילות עצבית במכרסמים.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

גלה סרטונים נוספים