Name: Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: חקור את השפעת מניפולציה כימוגנטית של מעגלים עצביים מקומיים על תאי גזע עצביים מבוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח התפשטות תאים ותובנות לגבי ויסות נוירוגנזה במוח הבוגר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.J.Q. היה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת התוספת גיוון R01MH111773, כמו גם מענק הכשרה T32 T32NS007431-20. פרויקט זה נתמך ממענקים הוענק ל-י. ס. י. מ-NIH (MH111773, AG058160, ו NS104530).

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132 (4), 645-660 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hippocampal+neurogenesis+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans.</a> Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).</li>
<li>Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+is+Sufficient+to+Reduce+Anxiety+and+Depression-Like+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors.</a> Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, (2009).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).</li>
<li>Anacker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+confers+stress+resilience+by+inhibiting+the+ventral+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus.</a> Nature. , 1(2018).</li>
<li>Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Phenotypic+Characterization+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Multiple+Labeling+with+Antibodies+from+the+Same+Host+Species+to+Study+Adult+Hippocampal+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-Phase+Labeling+of+Dividing+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optogenetic+Stimulation+of+the+Rodent+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+Optogenetics+in+Neural+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer Optogenetics in Neural Systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+Cells+Control+Adult+Neural+Stem+Cell+Quiescence+and+Maintenance+through+a+Dynamic+Balance+between+Direct+and+Indirect+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways.</a> Neuron. , 1-18 (2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+5-ethynyl-2+%E2%80%B2+-deoxyuridine+staining+as+a+sensitive+and+reliable+method+for+studying+cell+proliferation+in+the+adult+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system.</a> Brain Research. 1319, 21-32 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).</li>
<li>Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Thompson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadd+Agonist+21+%28C21%29+Is+an+Effective+Agonist+for+Muscarnic-Based+Dreadds+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacology+%26+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo.</a> ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך כיצד מניפולציה מעגלים עצביים ספציפיים מסדיר נוירוגנזה היפוקאמאל למבוגרים בvivo באמצעות סדרה של טכניקות אימונוהיסטוכימיה. שיטה התלויה בוויסות הפעילות של בוגרים נוירוגנזה באמצעות מעגלים עצביים ספציפיים היא טכניקה רבת ערך עם פוטנציאל רב לשינויים לחקר מגוון רחב של מעגלים עצביים. ההצלחה של סוגים אלה של ניסויים תלוי בגורמים מרובים כולל משלוח נגיפי מדויק, הבחירה הנגיפית הנכונה עבור המניפולציה הרצויה, המסירה הנכונה של אנמיטין אנלוגי, בעלי חיים גיל, היעילות חיסוני, מוצלח וכימות בלתי משוחדת של תמונו...

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך ביולוגי שדרכו הנוירונים החדשים נולדים במבוגר ומשולבים לתוך הרשתות העצביות הקיימות1. בבני אדם, תהליך זה מתרחש בפיתול הדנאט (DG) של ההיפוקמפוס, שם כ-1,400 תאים חדשים נולדים כל יום2. תאים אלה נמצאים בחלק הפנימי של ה-DG, אשר הנמלים נישה נוירוגניים, כינה את האזור התת בגרגרים (SGZ). כאן, תאי גזע עצביים מבוגרים (NSCs) עוברים תהליך התפתחותי מורכב כדי להפוך נוירונים תפקודית לחלוטין כי לתרום לוויסות של פונקציות המוח ספציפיים, כולל למידה וזיכרון, רגולציה מצב הרוח, ואת תגובת הלחץ3 ,4,5,6. כדי להשפיע על התנהגויות, מבוגר NSCs מוסדר ביותר על ידי גירויים חיצוניים שונים באופן התלוי בפעילות על ידי תגובה למערך של רמזים מקומיים וכימיים. הסימנים הכימיים הללו כוללים נוירוטרנסמיטורים ונוירומודולטורים ופועלים באופן מעגלי מאזורי מוח שונים. חשוב מכך, התכנסות מעגל רחב של רמזים כימיים אלה על NSCs מאפשר רגולציה ייחודית ומדויקת של הפעלת תא גזע, בידול, והחלטות הגורל.
אחת הדרכים האפקטיביות ביותר לחקור את הרגולציה בוויסות של NSCs למבוגרים בvivo היא על ידי שיוך ניתוח מערכתית של מניפולציות במעגל רחב. Immunofluorescence ניתוח של למבוגרים NSCs היא טכניקה מנוצל בדרך כלל, שבו נוגדנים נגד סמנים מולקולריים ספציפיים משמשים כדי לציין את השלב ההתפתחותי של למבוגרים NSCs. סמנים אלה כוללים: nestin כמו תא הרדיאלי של גליה וסמן קדמון מוקדם של העצב, Tbr2 כסמן מחולל קדמון ביניים, ו dcx כמו הסמן הישן והלא בוגר תא מטרה7. בנוסף, על-ידי ניהול האנלוגיות של תימידין כגון brdu, cidu, idu, ו-Edu, אוכלוסיות תאים שעברו שלב S יכול להיות מתויג בנפרד ודמיינו8,9,10. על-ידי שילוב שתי הגישות הללו, ניתן לחקור מגוון רחב של שאלות החל מאופן ההפצה המוסדר בשלבים התפתחותיים ספציפיים, לגבי האופן שבו סימנים שונים משפיעים על בידול המועצה לבטחון לאומי ועל נוירוגנזה.
מספר אפשרויות קיימות כדי לטפל ביעילות במעגלים עצביים כולל גירוי חשמלי, אלקטרואופטיקה, וכימוסגנטיקה, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם. גירוי חשמלי כרוך בניתוח נרחב שבו אלקטרודות מושתלים לאזור המוח מסוים אשר משמשים מאוחר יותר כדי לשדר אותות חשמליים לווסת את אזור המוח המיועד. עם זאת, גישה זו חסרה גם הסלולר וגם המעגלים. אלקטרואופטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים לקודד קולטן המופעל אור כי הוא מגורה על ידי לייזר הנפלט באמצעות סיבים אופטיים מושתל, אבל דורש מניפולציות נרחבות, עלות גדולה, ניתוחים מורכבים11. כימוקוטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים המקודדים קולטן מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים או ראסטות, אשר מופעלים לאחר מכן על ידי מסוים ומבחינה ביולוגית המכונה קלוזאפין N-תחמוצת (cno)12 . היתרון של ניצול ראסטות לתמרן מעגלים עצביים מקומיים המסדירים למבוגרים NSCs שקרים בקלות ומסלולים שונים של הממשל CNO. זה מאפשר גישה פחות זמן רב עם טיפול בעלי חיים מופחתת, אשר ניתנת להתאמה בקלות למחקרים ארוכי טווח לווסת את המעגלים העצביים.
הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא אוסף מקיף של פרוטוקולים שונים הנדרשים לחקור בהצלחה את הרגולציה של היפוקמאל נוירוגנזה למבוגרים המשלבת הן שיטות immunofluorescence ומניפולציות מעגלים באמצעות כימוטיקה. השיטה המתוארת בפרוטוקול הבא מתאימה לעירור או לעיכוב של מעגלים אחד או מספר בו בvivo כדי לקבוע את התפקוד הרגולטורי שלהם על נוירוגנזה מבוגרת. גישה זו משמשת במידה הטובה ביותר אם השאלה אינה זקוקה לרזולוציה גבוהה של הזמן. שאלות הדורשות שליטה טמפורלית מדויקת של גירוי/עיכוב בתדר מסוים, יכולה להיות ממוענת טוב יותר באמצעות אלקטרואופטיקה13,14. הגישה המתוארת כאן מותאמת בקלות למחקרים ארוכי טווח עם טיפול בבעלי חיים מינימלי במיוחד כאשר המתח הוא דאגה עיקרית.

<table><tbody><tr><td>24 צלחת</td><td>באר תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48 צלחת</td><td>באר דנוויל סיינטיפיק</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (אדו)</td><td>קרבוסינת'</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול 70% איזופרופיל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Chicken Nestin</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>נגד עזים DCX</td><td>סנטה קרוז</td><td>חתול# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Tbr2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: תמיסת</td> בטדין AB_11042577 <td></td></tr><tr><td>(פובידון-יוד)</td><td></td>מלאי חומצה ציטירית אמזון <td></td><td></td></tr><tr><td>[0.1M] חומצת לימון (21 גרם/ליטר חומצת לימון)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>קלוזפין N- תחמוצת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה קונפוקלית (Zen Black)</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (שחור)</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט Pentahydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>עדין משימה לנגב Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה 0.5 מ"מ</td><td>Fine Science</td><td>Tools 19007-05</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>מחט המילטון 2 אינץ'</td><td>חברת Hmailton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון 5 &mu; L דגם 75 RN</td><td>Hmailton מספר חברה</td><td>: 87931</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה במהירות גבוהה</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>משאבת עירוי</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח להזרקה</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>BD מזרקי</td><td></td><td></td>אינסולין עדינים במיוחד</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax לבעלי חיים קטנים</td><td>מכשירי KOPF</td><td>דגם 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (מוצר להסרת שיער)</td> <td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>פלוס טעון שקופיות</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מאגר פוספט (PBS)</td> <td>תרמו פישר מדעי</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube וטרינר משחה</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתלה שקופיות 20 יחידת שקופיות</td> אלקטרונים <td>מיקרוסקופיה מדע</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מתלה שקופיות</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום לבעלי חיים קטנים</td><td>K& </td><td></td><td></td>H</tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen 4 מ"מ קצה</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>אזמל כירורגי</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Solution (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>טרי-סודיום ציטראט מלאי [0.1 M] טרי-נתרן ציטראט (29.4 גרם/ליטר טרי-נתרן ציטראט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td> דבק רקמות <td>אמזון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>וטרינר בונד</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך דינמי שבו הופעל לאחרונה תאי גזע עצביים (NSCs) באזור תת-החוליות (sgz) של פיתול כישור מבית (DG) ליצור נוירונים חדשים, אשר משתלבים לתוך המעגל העצבי הקיים ולתרום פונקציות היפוקאמאל ספציפיים . חשוב מכך, נוירוגנזה מבוגרת היא רגישה מאוד לגירויים סביבתיים, המאפשרת רגולציה תלוית הפעילות של פונקציות קוגניטיביות שונות. מגוון רחב של מעגלים עצביים מאזורי מוח שונים מתזמרים פונקציות קוגניטיביות מורכבות אלה. לכן חשוב להבין כיצד מעגלים עצביים ספציפיים לווסת נוירוגנזה למבוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתמרן פעילות המעגל העצבי באמצעות קולטן מעצב מופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) טכנולוגיה המסדיר NSCs ו צאצאי היילוד במכרסמים. פרוטוקול מקיף זה כולל הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים, גירוי גנטי כימוע של מעגלים עצביים ספציפיים, מינהל אנלוגי של תימידין, עיבוד רקמות, מimmunofluorescence תיוג, הדמיה מיקוד, והדמיה ניתוח של בשלבים שונים של תאים מקודמי העצבי. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על טכניקות אחזור אנטיגן המשמש להמחיש NSCs וצאצהם ומתאר פשוט, דרך יעילה עדיין לווסת את מעגלי המוח באמצעות קלוזאפין N-תחמוצת (cno) או cno-המכיל מי שתייה ו וירוסים בהבעת הדרדים. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולת הסתגלות שלה ללמוד מגוון רחב של מעגלים עצביים המשפיעים על נוירוגנזה מבוגרת נגזר מ NSCs.

בעקבות ההליכים הניסיוניים שתוארו לעיל (איור 1A,B), הצלחנו לקבוע את ההשפעות של עירור התחזיות תא מוסי הצלעות על הנישה הנוירוגניים בתוך ההיפוקמפוס. על-ידי ניצול של היצורים התלויים ביצור-מצמידים וירוס המגרה בשילוב עם מכשיר הקשר של תא מוסי 5-HT2A-קו, היינו מסוגלים באופן סלקטיבי הפעלה של התחזיות הגירוי מתאי מוסי על ה-DG הצלעות וקבע כי תא מוסי חזק גירוי תא גזע הקודם השקט (איור 1C). אנו מאומתים משלוח נגיפי מדויק לפני ניתוח רקמות (אי...

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

פרוטוקול זה יכול לענות על האופן שבו מעגלים שונים במוח מווסתים נוירוגנזה למבוגרים ובמיוחד כיצד מעגלים עצביים מגרה או מעכבים משפיעים על התפשטות תאי גזע עצביים בוגרים. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מסוגלת למקד באופן ספציפי את המעגלים העצביים הרצויים, כמו גם להפחית את כמות הלחץ שהוכנס לבעלי החיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה כיצד מעגלי מוח שונים לווסת נוירוגנזה למבוגרים, בפרט, כיצד סוגי תאים ספציפיים המשחררים נוירוטרנסמיטורים מסוימים לווסת את התפשטות תאי גזע עצביים למבוגרים.כדי להתחיל בהליך זה, מקם את מקטעי הרקמה ב- PBS והתלה חמישה עד שמונה חלקים על שקופית טעונה באופן חיובי בסדר סידורי מהחלקה הראשונה לחלק האחורי. תן את חלקי הרקמה להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד חמש דקות לחלוטין לדבוק שקופיות. לאחר מכן, הכן מאגר ציטראט בגורם מכיל.מחממים את חיץ ציטראט במיקרוגל במשך חמש דקות עד שהתסכול רותח. בינתיים, מניחים את החלקים המותקנים במחזיק מגלשת זכוכית. לאחר חמש דקות, מקם בזהירות את מחזיק השקופיות עם המקטעים לתוך תיבת פיפטה.הגדר את כוח תנור המיקרוגל ל-50% ואת זמן הבישול לשבע דקות. הפעל שעון זמן למשך שבע דקות ונטר את הפתרון. עוצרים את מיקרוגל כאשר הפתרון מתחיל לרתיחה, וממשיכים את המיקרוגל לאחר עצירות רותחים.עצור לאחר טיימר נגמר, גם אם זמן הבישול על המיקרוגל לא סיים. מטרת צעד זה היא לשמור על המים

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בתאי גזע עצביים הוכנו מן ההיפוקמפוס של מבוגרים שאינם חורף סנאים בן שנה הארקטי הקרקע (AGS). תאים אלה גזע עצביים ניתן להרחיב באמצעות מעברים רבים, להיבדל ומתוך רצון להישמר כמו נוירון 50:50 כמעט לתרבות גליה.

גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמת תאי גזע עצביים חדשים במקטעי רקמת מוח באמצעות שילוב EdU, ואחריו immunofluorescence כדי לדמיין חלבונים ספציפיים, שיפור ההבנה של דינמיקה התא והתפשטות.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים, קבוצה מובחנת של סמנים גנטיים מתבטאת כאשר תא גזע עצבי שקט מתקדם ברצף ומתפתח לנוירון משולב תפקודית במעגל. באמצעות אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום, סוגי תאי אב שאחרת קשה לזהות מזוהים עם יעילות משופרת.

אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המספק כלי לבחינת מנגנוני ויסות של גנים ספציפיים במהלך התפתחות ההיפוקמפוס. שימוש באלקטרופורציה מחוץ לרחם ותרבית פרוסות אורגנוטיפית מאפשר ויסות למעלה ולמטה של ביטוי הגנים המעניינים בתאים בודדים ולעקוב אחר גורלם במהלך ההתפתחות.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

אנו מדווחים על שיטה מבוססת מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) לבידוד תאי גזע עצביים (NSCs) וצאצאיהם מהאזור התת-חדרי (SVZ) של מוח העכבר הבוגר. מיושם על עכברים טרנסגניים של אינדיקטור מחזור תא פלואורסצנטי (FUCCI), הוא מאפשר לחקור את התקדמות מחזור התא על ידי הדמיה חיה.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

המוח הכלבי הוא מודל ערך שבו ללמוד neurogenesis למבוגרים. מתפרסמים כאן פרוטוקולים לבידוד והרחבת תאים עצביים מבשרים כלבי מבוגרים בהיפוקמפוס מרקמות המוח עיקריות.

בידוד הרחבת מבשרי עצבית בהיפוקמפוס כלב מבוגר

קריו-סעיף-ניתוח מאפשר הכנה טרייה, קפואה של הנישה הנוירוגנית הגדולה ביותר במוח מורין לניתוח פרוטאום כמותי עמוק. השיטה מדויקת, יעילה וגורמת להפרעה מינימלית לרקמות. לכן, הוא מתאים באופן אידיאלי לחקר המיקרו-סביבה המולקולרית של נישה זו, כמו גם איברים, אזורים ומינים אחרים.

ניתוח החלק ההקפאה של האזור התת-כספי למבוגרים לניתוח פרוטאום כמותי מדויק ועמוק

מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.

מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

חקור את השפעת מניפולציה כימוגנטית של מעגלים עצביים מקומיים על תאי גזע עצביים מבוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח התפשטות תאים ותובנות לגבי ויסות נוירוגנזה במוח הבוגר.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

גלה סרטונים נוספים