Name: שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למד את פרוטוקול שחייה המושרה שיתוק (SWIP) להערכת איתות דופמין ב-Caenorhabditis elegans. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של גנים הקשורים לסינפסה הדופמינרגית וחקר השפעות עודף דופמין חוץ-תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות ד ר אוסמה Refai מהמעבדה של ד ר רנדי בלייקלי להדרכה עם ניתוח אוטומטיות של SWIP. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NIH R01 DA042156 כדי LC.

1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>הכנת מאגר M9 על ידי המסת ח'2PO4 3.0 g (22.05 מ מ), נה2HPO4 g 6.0 (42.2 מ מ), ו- g NaCl 5.0 (85.5 מ מ) ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. הוסף 1.0 מ"ל של 1 מ' MgSO4 (12 גרם באמצעי אחסון הסופי של 100 מ ל מים יונים בלוק) אחרי autoclaving. מיקס 100 מ"ל של x 10 וכתוצאה מכך M9 עם 900 מל של בלוק יונים מים כדי ליצור פתרון 1 x.</li>
	<li>כדי להפוך את הביצה מאגר, להמיס 6.896 g של NaCl (118 מ מ), g 3.578 של אשלגן כלורי (48 מ מ), 0.294 גר' CaCl2-2 H2O (2 מ מ), 0.406 גר' MgCl2-6 H2O (2 מ מ) ו- g 5.958 (25 מ מ) של HEPES ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. להתאים את ה-pH ל 7.3 באמצעות NaOH.</li>
	<li>להכין נתרן תת-כלורי טריים/NaOH פתרון על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5-6% נתרן תת-כלורי (אקונומיקה) 180 µL של 10 N NaOH 3.8 מ ל מים יונים.</li>
	<li>שוקל 60 גר' סוכרוז, להתמוסס במים יונים בלוק לאמצעי הסופי של 100 מ ל לעשות 60% סוכרוז פתרון.</li>
	<li>להמיס 0.684 גר' סוכרוז ב 10 מ"ל מים יונים בלוק לעשות 200 מ"מ סוכרוז. לבדוק ולהתאים אותה על osmolarity באמצעות osmometer. להפוך aliquots 1 מ"ל ב 1.5 mL microcentrifuge צינורות ומקפיאים ב-20 ° C.</li>
	<li>שוקל 0.184 גר' AMPH (משקל מולקולרי 184.75 g/mol), להמיס 10 מ"ל של מים יונים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ. לערבב 2 µL של הפתרון מניות ב- 400 µL של מים כדי ליצור הפתרון עובד 0.5 מ מ.</li>
	<li>
להכין צמיחה מזין לוחות מדיה (NGM)
	<ol>
<li>מערבבים דור 3 של NaCl (52.65 מ מ), 20 גרם של peptone, 25 גרם של מה נשארתי-אגר, 975 מ ל מים יונים בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. כוללים בר מערבבים מגנטי autoclave (121 מעלות צלזיוס, 15 PSI) למשך שעה באמצעות מחזור נוזלי.</li>
		<li>מגניב כדי, לשמור על הטמפרטורה כ 50 ° C על-ידי הצבת את הבקבוק על הגל תוך כדי ערבוב. להוסיף 0.5 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול), 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2 , 25 מ ל 1 מ' אשלגן פוספט מאגר, pH 7.4 (g 108.3 של ח'2PO4, 35.6 g K-2-HPO-4 יונים מים 1 ליטר).</li>
		<li>פיפטה 25 מ ל כל אחד לתוך צלחות פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ ולאפשר התקשורת לגבש. חנות את הלוחיות הפוך ב 4 ° C בקופסה עד 4 שבועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת ציר מרק (ליברות) Lysogeny
	<ol>
<li>להמיס 5 גר' LB לערבב אבקת ב 200 מ ל מים יונים הבקבוק Erlenmeyer. אוטוקלב במשך 30 דקות ניצול של עיקור נוזלי מחזור. לאפשר שהמרק להתקרר. לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שבועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לוחות חיידקי NA22
	<ol>
<li>השתמש טיפ פיפטה סטרילי או לולאה חיידקי סטרילי צובעות צלחת ליברות עם נפח קטן של חיידקים NA22 e. coli במלאי גליצרול, דגירה את הצלחת במהופך בתוך חממה 37 ° C בלילה לגדול מושבות המבודד. לבחור להציג שמושבה בודדת לתוך 200 מ ל LB מרק מוכן בשלב 1.8 ותנו לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה חזק.</li>
		<li>כדי להפיץ את הצלחות, לוותר על 200 µL של התרבות חיידקי על גבי הלוחות NGM שהוכן קודם לכן בשלב 1.7 ולהפיץ עם מקל הוקי זכוכית סטריליים. . תן את הצלחות יבש לילה או יותר תחת ברדס ולאחסן upside מטה בתיבת אטום ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להפוך את הכלי ריסים/פלטינה לאסוף תולעים, דבק ריסים עבים או של נימה פלטינה לתוך כוס פיפטה פסטר באמצעות דבק סופר. חותכים את קצה עפעף בזווית באמצעות סכין גילוח. לחלופין, ניתן להשתמש מבער בונזן להמיס את קצה פיפטה מזכוכית סביב נימה פלטינה.</li>
</ol>2. גידול C. elegans
הערה: תרבות פראי-סוג N2C. elegans עומס על צלחות NA22 Escherichia coli . השיטות תרבות מפורט שיפורטו להלן.
<ol><li>
הכנה של תרבות תולעת
	<ol>
<li>כדי להפוך את תרבות starter של תולעים, לחתוך חתיכה קטנה של אגר מצלחת המכיל חיות מוזן היטב ולהעביר אותה אל צלחת חיידקים NA22 e. coli מוכן בשלב 1.9 בעזרת מרית סטרילי. דגירה צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חזותית לאשר הנוכחות של מבוגרים gravid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מסונכרן אוכלוסיית תולעים
	<ol>
<li>לאסוף מבוגרים gravid לפחות 2 צלחות על ידי מחלק מים יונים בלוק סביב הלוח באמצעות בקבוק מים. מה עוללת בעדינות את הצלחת לסלק את התולעים ולאסוף את התולעים לתוך 15 מ"ל פוליסטירן חרוט צינור באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמיות</li>
		<li>ספין דרך צינור ומפרידה ב x 140 גרם למשך 2 דקות הצניפה התולעים, ואז וארוקן את supernatant באמצעות משאבת ואקום או עם בנה בואקום מעבדה.</li>
		<li>Resuspend ושטוף התולעים על-ידי מילוי את הצינור מים יונים בלוק, מיקס, צנטריפוגה ב 140 x גרם עבור 2 דק וארוקן את תגובת שיקוע וחזור זה יימשך צעד שני פעמים נוספות, או עד תולעים ברורים מחיידקים (מים מופיע ברור כשמערבבים. עם התולעים).</li>
		<li>הוסף 5 מ של נתרן תת-כלורי טרי/NaOH פתרון (שלב 1.3) בגדר תולעת ומערבבים במהירות באמצעות מערבולת. דגירה הצינור על כיסא נדנדה למשך כ- 4-8 דקות. תקופת הדגירה עם נתרן תת-כלורי/NaOH פתרון שנעה בין 4-8 דקות על סמך איכות הפתרון מניות נתרן תת-כלורי (אקונומיקה).</li>
		<li>לשים טיפה (2-50 µL) של לאודנום תולעים על משטח זכוכית מיקרוסקופ ולבדוק כל 2 דקות תחת המיקרוסקופ על פירוק תולעת. כאשר כ- 70% של התולעים הן lysed ביצים משתחררים, ממלאים את הצינור מאגר ביצים המבושלות שלב 1.2 ומיד צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 140 x גרם הצניפה העוברים והתולעת הגוויות.</li>
		<li>וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר 3 פעמים נוספות על-ידי מילוי את הצינור בכל פעם עם מאגר ביצה. ספין למטה ב x 140 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע בכל פעם. בגדר הופך ללבן בסוף שוטף.</li>
		<li>לאחר השטיפה הסופית להפריד את העוברים הגוויות מת ב 30% סוכרוז פתרון. הוסף 5 מ ל מים יונים בלוק בגדר, resuspend, הוסף 5 מ של 60% סוכרוז מוכן בשלב 1.4. לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 160 x גרם במשך 6 דקות.</li>
		<li>השתמש כוס פסטר פיפטה להעברת העוברים צף-מניסקוס העליון לתוך צינור חרוטי טריים 15 מ"ל. אין ליטול יותר מ- 3-4 מ"ל. כדי להסיר כל סוכרוז הנותרים, לשטוף את העוברים 3 פעמים עם מים בלוק על ידי צריך שתוציאו ב 140 x גרם במשך 3 דקות, הסרת את תגובת שיקוע, resuspending בגדר (וממלאים את הצינור) בכל פעם.</li>
		<li>חזור על שוטף עם מאגר x M9 1. לאחר השטיפה הסופית resuspend בגדר ב 10 מ"ל של M9. להשאיר את הצינורות מטרף בן לילה (לא יותר מ- 14 h) על הביצים לבקוע לזחלים L1. תולעים יישארו ב- L1 הפרפרים והעשים בשל חוסר מזון.</li>
		<li>לשטוף L1 הזחלים 3 פעמים עם מים בלוק להסיר שאפריש פרומונים שפורסמו על ידי הזחלים על ידי צריך שתוציאו ב x 140 גרם עבור 2 דק Resuspend הזחלים ב 1 מ"ל של מים. להפוך 1:10 דילול של תולעים מים, pipette טיפה 10 µL על משטח זכוכית, לשים על coverslip, לספור את מספר תולעים מתחת סטריאוסקופ. חזור על פעולה זו פעמיים, ממוצע התוצאות.</li>
		<li>פיפטה הנפח של תולעים שמתאים כאלף תולעים על גבי צלחת NA22 (שהובאו קודם לכן לטמפרטורת החדר) על-ידי הצבת קטן טיפות על הצלחת. להשאיר את הצלחת פתוח למחצה עד הטיפה מתייבש. לאחר מכן לכסות את הצלחת, דגירה במהופך בתוך חממה 20 ° C כ- 44-48 שעות או עד התולעים מגיע שלב L4 מאוחר, כמו מאושרות באופן חזותי תחת stereomicroscope. עכשיו התולעים מוכנים להיבדק על SWIP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SWIP
הערה: אנו מתארים את השיטה הידנית של הערכת SWIP בעיר וורמס פראי-סוג שטופלו AMPH. נדון בקצרה גם את המעקב אחר תולעים, ניתוח נוסף של תולעת קינטיקה באמצעות גשש תולעת אוטומטיים ותוכנות מעקב אשר שתוארו קודם לכן על-ידי הארדוויי ואח '10.
<ol><li>
שיטה ידנית כדי לבדוק את SWIP
	<ol>
<li>µL 40 aliquot של mOsm/L 200 סוכרוז פתרון עם או בלי 0.5 מ מ AMPH לתוך צלחת זכוכית ספוט. תחת סטריאוסקופ, לבחור בשלב מאוחר-L4 8-10 תולעים עם עפעף או פלטינה לבחור ויציפו האיסוף בצלחת המכילה את הפתרון עד תולעים תרדו האיסוף ולשחות אל הפתרון. הערה מספר תולעים בחרה לתוך הבאר, להתחיל את הטיימר, לצפות ולהקליט את המספר של תולעים המציגות SWIP כל סימן דקה.</li>
		<li>העתק את הנתונים הגולמיים לתוך גיליון אלקטרוני לחשב את האחוזים של תולעים משותק על ידי חלוקת מספר תולעים משותק בכל רגע על ידי המספר הכולל של תולעים נבדק ברחבי וזמינותו, להכפיל ב- 100. להעתיק את ערכי אחוזים כל יצירת גרפים ועצב תוכנה סטטיסטית, מגרש הנתונים עם ערכי אחוז על ציר Y זמן על ציר שימוש בגרף XY X.</li>
		<li>לבצע ANOVA דו-כיווני שלאחריה יבוא ניתוח פוסט-הוק (למשל, Bonferroni פוסט-מבחן) כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית בין שליטה, קבוצות AMPH וזמן הטיפול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח אוטומטיות של SWIP
	<ol>
<li>לבצע ניתוח אוטומטיות על תולעת אחת בכל פעם. פרוטוקול כדי להגדיר את המצלמה, תוכנת המעקב התולעת ואת script להפעלת תוכנת מעקב ניתוח מתוארים בפירוט הארדוויי et al.16.</li>
		<li>בקצרה, מקום אנדרוגינוס הבמה L4 מאוחר יחיד לתוך צלחת זכוכית ספוט ניצול מכוש עפעף, כפי שמתואר השיטה הידנית בסעיף 3.1.2. להקליט קטעי וידאו שחיה של תולעת אחת בזמן ולהשתמש את תוכנת המעקב תולעת כדי לחשב את התדירות של הגוף מתכופף.</li>
		<li>בצע את קובץ ה-script מסופק עם תוכנת מעקב כדי להשיג את תדירות בהלקאה תולעת וכדי ליצור מפות חום מתוך נתוני בהלקאה תולעת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li>
<li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Transporter%2FSyntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).</li>
<li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li>
<li>Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRefai%2C+O+%22Neurochemistry+International%22">Neurochemistry International</a>. , (2018).</li>
<li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13%2FERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li>
<li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li>
<li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).</li>
<li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li>
<li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li>
<li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li>
<li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+%2F+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li>
<li>Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li>
<li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+%28TSP-17%29+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).</li>
<li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבצע וזמינותו התנהגותית, SWIP, ב- C. elegans. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר עם לא צבעוני טכנית ביצוע assay משתמש מאוד ידידותי. למרות זאת, ישנם כמה היבטים קריטיים זה צריכים לקחת בחשבון על מנת לבצע ביעילות וזמינותו.
צריך לקחת כדי להבטיח כי התולעים המשמש וזמינותו לשובע, מאז ההגבלה תזונה משפיעה על SWIP17. עדין טיפול של תולעים בזמן לקטוף, כמו טיפול מתוזמן היטב כמו נתרן תת-כלורי/NaOH במהלך פירוק הם שלבים קריטיים, טראומה במהלך ...

חיות לבצע מגוון רחב של התנהגויות מולדת ומורכבים מתווכת על ידי נוירוטרנסמיטרים שונים מתואמת על ידי תהליכים מסובכים איתות. הנוירוטרנסמיטר דופמין (DA) שמתווכת התנהגויות שנשמרת מאוד על פני מינים, כולל למידה, המוטורית ועיבוד גמול.
נמטודות קרקע C. elegans, עם מערכת עצבים פשוטה יחסית וממופים היטב המורכב הנוירונים רק 302, מראה התנהגויות מורכבות בצורה ניכרת, כולל רבים שמווסתים על-ידי DA כגון ההזדווגות, למידה, שיחור מזון, גפיים, הנחת הביצה 1. בין תכונות אחרות, מחזור חיים קצר, קלות הטיפול ושימור של מולקולות איתות, להדגיש יתרונות השימוש C. elegans כמודל ללימוד הבסיס העצבי של התנהגויות ההכפלה.
ההרמפרודיט C. elegans מכיל נוירונים דופאמין שמונה; בנוסף לכך, הזכר מכיל שישה זוגות נוספים להזדווגות למטרות. כמו יונקים, הנוירונים הללו לסנתז DA ולבטא את המשגר DA (DAT-1), חלבון ממברנה נמצאו אך ורק בנוירונים דופאמין, אשר מסיע DA שפורסם החריץ הסינפטית בחזרה לתוך הנוירונים דופאמין. יתר על כן, רוב החלבונים המעורבים בכל שלב של סינתזה, אריזה ועל שחרור דא מאוד נשמרים בין תולעים ובני ו, כמו אצל יונקים, DA ממיקרו התנהגויות האכלה ובאופן C. elegans2.
C. elegans זוחל על משטחים מוצקים, שוחה עם התנהגות אופיינית בהלקאה במים. מעניין, מוטציות חסר הבעה של DAT-1 (dat-1) לזחול בדרך כלל על משטח מוצק אבל להיכשל לקיים את השחייה כאשר הושקע במים. התנהגות זו היה כינה שחייה המושרה שיתוק או SWIP. ניסויים קודמים הראו כי SWIP, בין השאר, נגרמת על ידי עודף של DA בתוך החריץ סינפטית זה בסופו של דבר מהתזונה קולטני postsynaptic כמו D2 (DOP-3). אמנם במקור שזוהתה dat-1 ההסתרה חיות3, SWIP הוא ציין גם אצל בעלי חיים פראי-סוג לטפל בתרופות שמונעים הפעילות של DAT (כגון imipramine4) ו/או לגרום שחרור דא (למשל, אמפטמין5). מצד שני, למנוע מניפולציות תרופתי או מחלה גנטית הסב סינתזה ושחרור של DA וחסימת פונקציה קולטן DOP-3 SWIP6. יחדיו, אלה נתונים שפורסמו כבר הקמנו SWIP בתור כלי אמין כדי לחקור את ההשפעות התנהגותית נגרם על ידי מוטציה חלבונים בתוך וכולינרגיים הסינפסות3,4,7 וכדי להיות מועסק העברה של מסכי גנטי לצורך זיהוי הרומן משעולים רגולטוריות מעורב DA איתות7,8,9,10,11,12. בנוסף, על ידי מתן של הבדיקה לכימות בקלות של שיכרון התנהגות בבעלי חיים, SWIP מאפשרת הבהרה של מנגנוני הפעולה של תרופות כמו אמפטמין (AMPH), azaperone-דופאמין synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
פרוטוקולים עבור ביצוע מבחני SWIP את תוארו לפני16. כאן נתאר בפירוט את המתודולוגיה ואת ההתקנה כדי לבצע את הבדיקה עם המטרה של מתן כמדריך חזותי עבור הקהילה C. elegans לבצע ביעילות SWIP.

<table><tbody><tr><td>נייר אלומיניום</td><td>ריינולדס עוטף</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>אמפטמין</td><td>סיגמא</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת חיידקים</td> חיטוי <td>ניו ברונסוויק מדעית</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>כיתה בקטריולוגית, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) פפטון</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (דיהידרט)</td><td>מצלמת Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>צנטריפוגה <td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>דיכאון צלחת ספוט זכוכית</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק Erlenmeyer</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>ריסים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת גרפים וסטטיסטיקה</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>היפוכלוריט</td><td>הוקינס</td><td>נתרן היפוכלוריט 4-6%, USP" מרק 1 גל</td><td></td></tr><tr><td>LB, מילר</td><td>פישר</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (הקסהידרט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>RB=M0250</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (הפטהידרט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>מוט ערבוב מגנטי</td><td>פישרברנד</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 חיידקים</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר</td><td>מכשירים מתקדמים, בע"מ</td><td>דגם 3320</td><td></td></tr><tr><td>פסטר פיפטס</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>פלקון</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>אוריון VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים פוליסטרין</td><td>פלקון</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט - DIBASIC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט - MONOBASIC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>VWR</td><td>10 מ"ל = 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td>אמין מדעי</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט</td><td>פישר</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>גיליון אלקטרוני</td><td>MS office</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו מיקרוסקופ</td><td>זייס</td><td>דגם tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה סטריליות</td><td>שונות</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>סופר-דבק</td><td>לוקטיט</td><td>1647358.14 אונקיות.</td><td></td></tr><tr><td>SwimR sofware</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>תוכנת הקלטת וידאו</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

וזמינותו שחייה שמתואר פרוטוקול זה הוא כלי תקף כדי לזהות חלבונים ויסות של דופאמין synapses. בדומה יונקים, דופמין (DA) קובע מספר פונקציות ב- C. elegans כולל למידה ופעילות מוטורית. תנאי זה לעורר שחרור דא (למשל, אמפטמין (AMPH) טיפולים) או זה למנוע DA סיווג (למשל, חיות חסר המשגר DA (dat-1) אשר אינם מסוגלים reaccumulating DA לתוך הנוירונים) ליצור עודף של DA חוץ-תאית בסופו של דבר וכתוצאה מכך ומכניקה עכבות. תופעה זו בולטת במיוחד כאשר בעלי החיים לשחות במים. למעשה, בעוד חיות פראי-סוג להמשיך לשחות לתקופה ממושכת, מוטציות null dat-1 ופראי-סוג שטופלו AMPH או מעכבים של המשגר DA לשקוע לתחתית הבאר ואל תזוז. תופעה זו נקראת "שחייה המושרה שיתוק" (SWIP). למרות וזמינותו SWIP וותיקה, תיאור מפורט של השיטה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע SWIP. כדי לבצע את הבדיקה, מאחר חיות הבמה-4 דרגות זחל מוצבים צלחת זכוכית ספוט המכיל סוכרוז פתרון בקרת עם או בלי AMPH. בעלי חיים הם הבקיע עבור התנהגותם שחייה באופן ידני על-ידי ויזואליזציה תחת סטריאוסקופ או באופן אוטומטי על ידי הקלטה עם מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. קטעי וידאו הם מכן נותחו באמצעות תוכנת מעקב, אשר מניב ייצוג חזותי של תדירות בהלקאה ושיתוק בצורה של מפות חום. שתי המערכות ידניים ואוטומטיים מבטיח של הבדיקה לכימות בקלות של יכולת שחייה החיה, ובכך להקל על הקרנה עבור חיות הנושאת מוטציות בתוך מערכת וכולינרגיים או גנים עזר. בנוסף, ניתן להשתמש SWIP כדי להבהיר את מנגנון הפעולה של תרופות של התעללות כגון AMPH.

נציג דוגמה SWIP assay המושרה על ידי טיפול AMPH. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של ההתקנה assay כמתואר לעיל. עבור assay ידנית, בערך בגיל 8-10 מסונכרן תולעים בשלב מאוחר של L4 נאספים עם עפעף או פלטינה לבחור להציב לתוך צלחת ספוט זכוכית מלאים µL 40 של 200 סוכרוז mOsm/L (פתרון שליטה) או סוכרוז עם 0.5 מ מ AMPH ונבדק SWIP.
כאשר בעלי חיים מפסיקים לשחות (קרי: SWIP), תערוכה הם שוקעים לתחתית הבאר ואל תזוז מהר. לכן, הא...

שחייה המושרה assay התנהגותית ומבוססת חקר המנגנונים המשמשת כבסיס של דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא שיתוק (SWIP). עם זאת, שיטה מפורטת כדי לבצע את הבדיקה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור SWIP.

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שחייה-Induced שיתוק או SWIP, הערכה התנהגותית כדי להעריך דופמין איתות C.elegans. SWIP מאפשר זיהוי מהיר של גנים בתוך או קשור סינפסת דופאמין. שיטה זו מאפשרת את חקירת ההשפעות המיוצרות על ידי עודף של דופמין חוץ תאית הנגרמת למשל על ידי תרופות או על ידי מוטציות על טרנספורטר דופמין.כדי להבטיח שכל התולעים שנבדקו במהלך המבחן ישחו במשך אותה כמות זמן, יש להעביר את בעלי החיים במהירות לפתרון. הדגימה של ההליך תהיה סירישה קודומאלה ושלווה סוסי. שניהם עובדים במעבדה שלי.כדי להקים תרבויות סטרטר תולעת, להשתמש מרית סטרילית לחתוך חתיכות קטנות של אגר מצלחת המכילה C.elegans מוזן היטב ולהעביר את חתיכות אגר לתוך צלחות NA22 E.coli בודדים. לאחר הדגירה של הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, חזותית לאשר את נוכחותם של מבוגרים gravid תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי להשיג אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים, להשפריץ מים על צלחת מלאה מבוגרים gravid.בעדינות מערבל את הצלחת כדי לנתק את התולעים ולהשתמש פיפטה סילוק להעביר את התולעים לתוך צינור חרוט פוליסטירן 15 מיליליטר. לאחר משיכת התולעים מצלחת שנייה לתוך הצינור, לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה במשך שלוש שטיפות ב 15 מיליליטר של מים autoclaved לכל לשטוף. המים צריכים להיראות צלולים לאחר הכביסה האחרונה.לאחר הצנטריפוגה האחרונה, מוסיפים

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.

פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

כאן, אנו מציגים בדיקה למדידת SWIP, פנוטיפ התנהגותי של C. elegans המתרחש במהלך תנועה נמרצת כמו שחייה. הפרוטוקול לדוגמה דן הן בגישות ניתוח ידניות והן בגישות ניתוח אוטומטיות.

בדיקת שיתוק המושרה בשחייה (SWIP): שיטה לכימות תנועה בתיווך דופמין ב- C. elegans

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת תנועה רדיאלית כדי להעריך תפקוד לקוי של מוטוריקה ב-C. elegans המבטא חלבון TDP-43 אנושי מסוג פרא או מוטנטי ALS. תולעים עם רמות שונות של ביטוי TDP-43 מסוג בר או מוטנטי מורשות לזחול, ותנועתן נמדדת על ידי המרחק הרדיאלי שעובר מהנקודה המרכזית על לוחית הבדיקה. הבדיקה מבחינה בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים על סמך המרחק שעברו הזנים השונים C. elegans.

הערכת ליקוי מוטורי במודלים של C. elegans באמצעות בדיקת תנועה רדיאלית

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

מתודולוגיה יעילה ופשוט לניתוח במחשב מבוסס התנהגות שחי נמטודות בנוזל מתוארת. השיטה מחייבת לא מעט על מנת השקעה למעבדות C. elegans. החומרה בשימוש הוא רגיל, ואת תוכנת מחשב עבור ניתוח התנהגותי (CeleST) הוא קוד פתוח אחד.

ניתוח אוטומטי של<em&gt; C. elegans</em&gt; התנהגות שח שימוש CeleST תוכנה

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקה לקביעת התגובה ללבמיזול, אגוניסט פרמקולוגי של סוג אחד של קולטני אצטילכולין Caenorhabditis elegans . במבחן השחייה הנוזלי הזה, החוקרים מתבוננים באופן חזותי ומכמתים את השיתוק תלוי הזמן של בעלי חיים המעובדים בצלחות של 24 בארות.

מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

פרוטוקול זה מפרט בדיקת הצואה הכמותית ב-Caenorhabditis elegans צעירים מ-RAC1/CED-10, ומספק מודל פשוט לחקר שלבי מחלת פרקינסון פרודרומליים. היא מתגברת על מגבלות של מודלים בעלי חיים אחרים ומקלה על בדיקות אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בפתולוגיה פרקינסונית מוקדמת.

הערכת תנועתיות מערכת העיכול במוטנטים CAENORHABDITIS elegans RAC1/CED-10 ככלי לחקר מחלת פרקינסון מוקדמת

למד את פרוטוקול שחייה המושרה שיתוק (SWIP) להערכת איתות דופמין ב-Caenorhabditis elegans. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של גנים הקשורים לסינפסה הדופמינרגית וחקר השפעות עודף דופמין חוץ-תאי.

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים