להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

השיטות המוצגות כאן מאפשרות לנו לחקור את המנגנונים המולקולריים של נדידת תאי החיסון על פני מחסומי המוח באנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל של בעלי חיים ל טרשת נפוצה. על ידי חקירת חדירות מחסום הדם - מוח ופעילות מטריצה-metalloprotease באותו זמן בקורלציה מרחבית חדירת תאים חיסוניים בסעיפים רקמת המוח, אנחנו יכולים לשייך במדויק אלה אירועים neuroinflammatory לסימנים הקליניים של EAE. טיפול מקצועי בעכברים מבוגרים זקוק להכשרה מעמיקה, כמו גם לניקוד הנכון של הסימנים הקליניים של EAE.

לכן, ההדגמה החזותית מועילה. התחל הליך זה עם הרדמה של עכברי C57-Black/6 שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לתקן את העכבר הרדמה ביד אחת, ולהזריק 30 microliters של פפטיד MOG ולהשלים אמולסיה תות עורית של פרוינד לתוך כל אחד מאגפי הרגל האחורית, בסמיכות בלוטות הלימפה inguinal.

עכשיו, מניחים את העכבר על בטנו, ומזריקים 20 מיקרוליטרים של אמולסיה MOG-פפטיד לתוך רקמת השומן הרכה הן בצד שמאל והן ימין בשורש הזנב. כמו כן, להזריק טיפה קטנה של אמולסיה לתוך הצוואר של העכבר. להזריק 100 microliters של פתרון רעלן שעלת intraperitoneally לתוך העכבר.

החזק את ראש העכבר מתחת למרכז הגוף, כדי למנוע הזרקה לתוך המעי. החלף את דיאטת התחזוקה לתופת הרבייה על מנת לספק לעכברים מזון של תוכן אנרגיה גבוה יותר לפני ובמהלך המחלה הקלינית הצפויה. חזור על הזרקת רעלן שעלת 48 שעות לאחר הטיפול הראשון.

בדוק את המצב הבריאותי של עכברי EAE בכל בוקר על ידי מבט בתוך הכלובים. ציון עכברי EAE בכל אחר הצהריים. מוציאים כל עכבר בודד הכלול בניסוי EAE מחוץ לכלוב, ובדקו אם לזנב יש תריס.

הזז את הזנב כלפי מעלה עם אצבע. עכבר בריא ישמור על זנבו למעלה. אם EAE קליני החל, תריס הזנב יהיה נמוך יותר, גלוי על ידי ירידה הדרגתית של הזנב.

בסופו של דבר, העכבר לא יוכל להרים את הזנב שלו בכלל. מקם כל עכבר בודד הכלול בניסוי EAE על הספסל הנקי כדי להתבונן ולתעד את התנהגות ההליכה. עיין בטקסט עבור קריטריוני ניקוד להערכת חומרת המחלה, שהיא ציון EAE.

להעריך ולתעד את המשקל של כל עכבר הכלול בניסוי. להכנת פתרונות מלאי דקסטרן, להמיס 10 מיליגרם של שלושה קילודלטון Dextran טקסס אדום ב 500 microliters של 0.9% פתרון נתרן כלורי וחמישה מיליגרם של 10 קילודלטון דקסטרן אלקסה פלואור 488 ב 250 microliters של 0.9% פתרון נתרן כלורי. עבור פתרון העבודה dextran, ממש לפני ההזרקה, פיפטה 55 microliters של 10 קילודלטון Dextton אלכסה פלואור 488 פתרון מלאי על פיסת סרט איטום.

לאחר מכן, להוסיף 55 microliters של פתרון מניות שלושה קילודלטון Dextran טקסס אדום. מערבבים ואוסף 100 מיקרוליטר למזרק חד פעמי משובח. לאחר מכן, מניחים עכבר הרדמה במיקום בצד השני על השולחן.

להזריק דרך הווריד 100 microliters של עוקבים פלואורסצנטיים לתוך העכבר לפני העכבר מתעורר. תן למעקב להסתובב במשך 15 דקות לפני ביצוע זיבול של עכברים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ממלאים מיכל דיואר שטוח בקרח יבש כתוש, ומוסיפים 2-מתילבוטן עד שהנוזל מגיע לס"מ אחד מעל חבילת הקרח היבשה.

מכסים במכסה רופף, כגון כיסוי דלי קרח. לאחר חיתוך את ראשו של העכבר מנוון עם מספריים חדים, להסיר את העור והאוזניים באמצעות קבוצה קטנה יותר של מספריים. בזהירות לנתח את הכיפה על ידי חיתוך מן מגנום foramen לכיוון החזית בצד שמאל ובן ימין, כדי לאפשר קיפול של הכיפה מעל המוח.

לאחר מכן, בזהירות להרים את המוח שלם מבסיס הגולגולת תוך ניתוק העצבים האופטיים באמצעות מרית מתכת שטוחה. מניחים את המוח על רדיד אלומיניום. חותכים את המוח בשלושה חלקים על ידי הצבת שני חתכים coronal.

שלושת החלקים מייצגים את המוח הקדמי, המוח האמצעי והמוח הקטן עם גזע המוח. מלאו קריומאולד לרבעון הראשון במטריצת חיתוך אופטימלית בטמפרטורה. לאחר מכן, מניחים את פרוסות המוח לתוך Cryomold, עם הצד הקדמי של כל חתיכת המוח פונה כלפי מטה.

לכסות את הרקמה לחלוטין עם מטריצה. מניחים את Cryomold עם הרקמה בכיוון אופקי לתוך האמבטיה 2-מתילבוטן. ודא כי הרקמה קופא מלמטה למעלה בתוך דקה אחת על ידי הימנעות טבילת בלוק הרקמה כולו לתוך האמבטיה.

מעבירים את הרקמה הקפואה למינוס 80 מעלות לאחסון. ראה את פרוטוקול הטקסט להכנת מקטעי הרקמה הקפואה. אחזר שישה מיקרון, חלקי רקמת מוח לא קבועים שהוכנו מעכברי EAE.

במכסה המנוע אדים, להפשיר את החלקים בתוך תיבת ההקפאה פלסטיק המכיל ג'ל סיליקה במכסה, כדי למנוע החזקת מים ברקמה. הפרד שני מקטעי רקמה במגלשה אחת על-ידי ציור קווים באמצעות עט דוחה מים. פתרונות תגובת צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 13, 300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר, ו מראש חם עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.

לאחר מכן, rehydrate את חלקי הרקמה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות חיץ תגובה 1X. לאחר חמש דקות, יוצקים את מאגר התגובה 1X. מוסיפים פתרון תגובה על חלקי הרקמה, ו דגירה במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, לשטוף את המגלשות חמש פעמים במים מזוקקים כפולים. עכשיו, לתקן את החלקים במשך חמש דקות עם מתנול קר כקרח במינוס 20 מעלות צלזיוס לפני לשטוף אותם פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 1%BSA ב-PBS למדור, והם דוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השלך את המאגר מהמקטע על-ידי היפוך השקופית על רקמה. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים העיקרי למדור, ודורגים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת החלקים פעמיים עם PBS, מוסיפים קוקטייל נוגדנים משני, ו דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לשטוף את החלקים פעמיים עם PBS, ולהסתן את השקופיות עם פתרון הטבעה. לאחר מתן החלקים המותקנים להתייבש לילה בטמפרטורת החדר, לנתח מקטעי רקמה מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חומרת מחלת EAE עולה עד לשיא המחלה, אשר ניתן לצפות בין ימים 16 ו 20 לאחר אינדוקציה EAE.

בשיאו של EAE קליני, עכברים הראו גם את משקל הגוף הנמוך ביותר, אשר מגביר את המתאם amelioration של EAE בשלב ההפוגה של המחלה. מוצגת כאן תמונה מייצגת של מקלעת choroid ואת parenchyma המוח הסמוך של עכבר C57-שחור / 6 סובל EAE. העכבר הוזרק דרך הווריד 15 דקות לפני ההקרבה.

Tracers בקלות להתפזר על פני microvessels fenestrated לתוך הסטומה של מקלעת choroid, בעוד מחסום הדם - מוח אינו מאפשר דיפוזיה של עוקבים במחזור לתוך parenchyma המוח, אשר ולכן הוא נטול כל אות פלואורסצנטי. תמונות אלה מראות כלי דם דולפים נציג במוח הקטן של עכבר C57-שחור /6 סובל EAE. ראשי חץ מצביעים על עקבות מפוזרים על פני מיקרו-אווסלים במוח לתוך הפרנצ'ימה של מערכת העצבים המרכזית, מה שמרמז על כך שתפקוד מחסום הדם - מוח נפגע בכלי הדם האלה.

בפרנצ'ימה של קו ה-CNS, אות פלואורסצנטי ירוק ואדום נראה מחוץ לקירות כלי הדם. מיקום תת עורי נכון של אמולסיה MOG-CFA חיוני כדי לעלות על התגובה החיסונית המתאימה המובילה EAE. יש להימנע מהזרקה תוך-עינית ואינטרמוסקולרית.

הכן CFA מתחת למכסה המנוע אדים, כדי למנוע שאיפה של Mycobacterium שהושחת. כמו כן, הימנע הזרקה עצמית של אחד עם אמולסיה MOG-CFA, כמו זה עלול לגרום condyloma או אפילו להוביל EAE אצל אנשים כי הם נטייה גנטית. תאים חיסוניים חודרים למוח יכולים להיות מבודדים מ- CNS של עכברים הסובלים מ- EAE לכמת תת-קבוצות של תאים חיסוניים חודרים במהלך נוירו-אינפלציה על ידי ציטומטריית זרימה.

הערכת השלמות של ה אנדותל ומחסומי המוח גליה ניתן לתרגם לניתוח של מודלים עכבר מהונדסים גנטית או למודלים של הפרעות נוירולוגיות אחרות.