אינדוקציה ואפיון של יתר לחץ דם ריאתי בעכברים באמצעות מודל Hypoxia/SU5416
3 ביוני 2020
פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה של יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים בהתבסס על החשיפה להיפותוקסיה והזרקת אנטגוניסט קולטן VEGF. בעלי החיים לפתח PH וחדר ימין (RV) היפרטרופיה 3 שבועות לאחר החניכה של הפרוטוקול. כמו כן מוצג האפיון הפונקציונלי והמורפומטרי של המודל.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי ולבצע מדידות תפקודיות של החדר הימני. מודל היפוקסיה סוגן קל ליישם והוא יכול recapitulate כמה סימני ההיכר של יתר לחץ דם ריאתי בתוך שבועיים עד שלושה שבועות של אינדוקציה. באמצעות מודל זה, אנו יכולים לזהות מסלולים חדשים המעורבים בהתפתחות המחלה.
אנחנו יכולים לזהות מטרות חדשות ולבדוק את הפוטנציאל הטיפולי שלהם. לפני תחילת הליך אינדוקציה, לאבטח מיכלי חנקן ליד התא hypoxic ולהגדיר את בקר החמצן בנקודה של 10%חמצן. לאחר מכן, לטעון פתרון SU5416 מוכן טרי לתוך מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 25 מד ידני לרסן את החיה הראשונה להיות מוזרק.
לתפוס את העור כדי ליצור אוהל במקביל עמוד השדרה הקפדה לתפוס את החלק האחורי של הראש בחוזקה, כדי למנוע פגיעה פוטנציאלית לנשוך על ידי העכבר. הכנס את המחט תת עורית מעל האגף על קפל העור רופף במקביל לעור ולספק 100 microliters של תוכן המזרק. לאחר 10 שניות, למשוך את המחט ולהחזיר את החיה לכלוב שלה.
כאשר כל החיות הוזרקו, מניחים את העכברים בתא היפוקסיה מאוורר. לחשיפה להיפוקסיה, ודאו כי התאים מצוידים בחיישן חמצן למדידת רמת החמצן ולפתיחת התאים למשך לא יותר מ-20 דקות כל שלושה ימים לניקוי והוספת מזון ומים. בדוק בעלי חיים מדי יום לסימני לחץ וחזור על הזרקת SU5416 מדי שבוע במשך שלושה שבועות רצופים.
לפני התחלת הליך מדידת הלחץ, להכין את מחבר צינור Y ולהשתמש במצב הידני כדי לבדוק את הפונקציה של מכונת ההנשמה. הגדר את הלחץ ההשראה פחות מס"מ אחד של מים כדי למנוע barotrauma ולהגדיר את קצב הנשימה ל 110 נשימות לדקה. חותכים קטטר תוך וסקולרי 20 מד כדי ליצור צינור אנדוטראצ'ל ולהדליק את יחידת בקרת עוצמת הלחץ.
ליזום את התוכנה לרכישת נתונים ולמקום את קטטר נפח הלחץ בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן כייל את הקטטר בהתאם לפרוטוקול היצרן. מניחים את העכבר על משטח חימום ומ מניחים בדיקה רקטלית לניטור טמפרטורת הגוף.
לאחר מכן, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה לגלח את הצוואר ואת אזורי החזה. לאבטח את הגפיים של העכבר עם סרט כירורגי ולעשות חתך של סנטימטר אחד בעור צוואר הרחם המדיקל. באמצעות מוליך כותנה, בבוטות להפריד את parotid ו בלוטות הרוק submandibular לחשוף את השרירים מתחת קנה הנשימה.
בזהירות לחתוך את השרירים כדי לחשוף באופן מלא את קנה הנשימה ולהשתמש מספריים לעשות חתך קטן בין הסחוסים קנה הנשימה. הכנס את צינור אנדוטראצ'ל מוכן ולהסיר את מדריך המתכת של קטטר תוך וסקולרי. לאחר מכן חבר את הקטטר למכונת ההנשמה ואמת את מיקום צינור קנה הנשימה על ידי ניפוח ידני של הריאות.
אבטח את המיקום עם קלטת. למדידת לחץ החדר הימני, בצע חתך עור של סנטימטר אחד מעל תהליך xiphoid והבטן העליונה ומתחיל בקו האמצעי דיסטלי כדי xiphoid בזהירות נעה באופן צדדי משני הצדדים, להפריד את העור על החזה ואת דופן הבטן. פותחים את חלל הבטן, חותכים את הסרעפת בזהירות, דואגים לא לפגוע בלב הפועם או בריאות.
ולהשתמש במוליך כותנה הטה להסיר בעדינות את pericardium. הביאו את קטטר הלחץ ליד העכבר ולהשתמש במוליך כותנה עם קצה מצויד במחט כדי להפוך פצע דקירה בחלק הדיסטלי הלא טיפוסי של החדר הימני. בזהירות להחליף את המחט עם קטטר לחץ, החדרת קטטר הלחץ במקביל לכיוון החדר הימני עם הקצה מול עורק הריאה.
צפה מעקב גל הלחץ כדי להבטיח מיקום נכון של הקטטר. לאחר שאות הלחץ התייצב, השהה את הנשימה והשג לפחות שלוש מדידות. כאשר כל המדידות נרשמו, בזהירות להחזיר את הקטטר לצינור צנטריפוגה מלא PBS באמבט המים.
כאן מוצגים עקומות לחץ ייצוגיות וניתוח כמותי של הלחץ בחדר הימני בסוף תקופת התצפית. ניתוח היסטולוגי של עורקי ריאה משופץ לאחר היפוקסיה בתוספת טיפול SU5416 מגלה עלייה בעובי הקיר המדילי בהשוואה לבעלי חיים נורמוקסיים. נבט חיטה agglutinin כתמים כדי להעריך היפרטרופיה cardiomyocyte מציין כי היפוקסיה בתוספת SU5416 חשיפה תוצאות עלייה ניכרת בגודל cardiomyocyte והיפרטרופיה חדרית ימין.
יתר על כן, הערכה מורפומטרית של היפרטרופיה חדרית נכונה על ידי מדידת מדד פולטון מאשרת עלייה בהיפרטרופיה חדרית נכונה בבעלי החיים היפוקסיים. ביצוע המדידות הפונקציונליות חשוב כדי למנוע דימום כי זה יכול להשפיע לרעה על תוצאות המחקר. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי בחולדות עם שינויים קלים בלבד.
יש לציין, רק זריקת סוגן אחת בחולדות מספיקה כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
הפרוטוקול הזה מתאר את השראת יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים באמצעות חשיפה להיפוקסיה והזרקת אנטגוניסט של קולטן VEGF. המודל מאפשר אפיון פונקציונלי ומורפומטרי של PH והיפרטרופיה של החדר הימני תוך שלושה שבועות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- פתופיזיולוגיה
רקע
- יתר לחץ דם ריאתי הוא מצב חמור המשפיע על מערכת הלב וכלי הדם.
- הבנת המנגנונים שמאחורי PH יכולה להוביל למטרות טיפוליות חדשות.
- מודל ההיפוקסיה Sugen הוא שיטה נפוצה לחקר PH בעכברים.
- אנטגוניסטים של קולטן VEGF משחקים תפקיד בהתפתחות PH.
מטרת המחקר
- להשראת יתר לחץ דם ריאתי במודל עכבר מבוקר.
- לבצע מדידות פונקציונליות של החדר הימני.
- לזהות מסלולים חדשים ומטרות טיפוליות ל-PH.
שיטות ששימשו
- השראת היפוקסיה על ידי הגדרת רמות חמצן ל-10%.
- הזרקת SU5416 לחסימת קולטני VEGF.
- מעקב אחר תפקוד ומורפולוגיה של החדר הימני.
- אפיון של המודל על פני תקופה של שלושה שבועות.
תוצאות עיקריות
- התפתחות יתר לחץ דם ריאתי והיפרטרופיה של החדר הימני.
- מדידות פונקציונליות מצביעות על שינויים משמעותיים בביצועים של החדר הימני.
- שינויים מורפולוגיים העולים בקנה אחד עם יתר לחץ דם ריאתי שנצפו.
- זיהוי מטרות טיפוליות חדשות אפשריות לטיפול.
מסקנות
- מודל ההיפוקסיה Sugen מדמה ביעילות יתר לחץ דם ריאתי.
- ניתן להשתמש במודל זה לחקר מסלולים חדשים המעורבים ב-PH.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מודל זה לבדיקות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
