Name: הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למד הדמיה של שלפוחיות ומסחטות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ללא סימון. שיטת ההתמצעות האלקטרוסטטית מאפשרת אפיון ביופיזיקלי מדויק של גודל וצורה בדגימות לחות ומיובשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכה הפיננסית של הקרן הלאומית למדע (מספר הפרס איגרט-0903715), אוניברסיטת יוטה (המחלקה למענק הנדסת זרעים כימית ופרס המלגות למחקר בוגר), ומכון סקולקובו למדעים וטכנולוגיה (מלגת סקולטק).

1. בידוד EVs מתוך ביולואיד
<ol><li>בידוד EVs על ידי אחת השיטות הוקמה, כגון ההבדלים הדיפרנציאלי8, משקעים, או גודל כרומטוגרפיה הדרה9.</li>
	<li>לאשר נוכחות של משטח צפוי וביואריטים בסמנים והעדר סמנים ביואריטים המצביעים על זיהום של ההכנה. מאשרים את המבנה המיורפולוגיה של החלקיקים המבודדים באמצעות אלקטרון מיקרוסקופ. הערה: בעת בידוד האקסוזומים, התפלגות הגודל ההידרודינמי הנמדד על-ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ. ת. ע) או פיזור אור דינאמי צריכים להיות בטווח הצפוי. הפרטים של EV ו אקסוחלק בידוד הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה. השיטה שנבחרה תהיה תלויה בשאלות הנסיוניות ובמטרה של המחקר10. השלבים הבאים מספקים איור בטון של ההליך להעשיר את האקסוזומים על ידי משקעים מתוך המדיום צמיחה של MCF-7 סרטן השד תאים באמצעות ערכת משקעים זמינים מסחרית (טבלת חומרים).</li>
	<li>לפני הרחבת תרבות התא, לאחסן MCF-7 סרטן השד תאים בחנקן נוזלי. הפשרת תאים לתת-תרבות.</li>
	<li>לאחר שיטות ספיגה, לבצע ציפוי תאים על 150 מ"מ לוחות. השתמש במדיום צמיחה מורכב של הנשר's בינוני חיוני מינימלי, 0.01 Mg/mL האדם רקומביננטי אינסולין, ו 10% אקסוכמה-בחינם העובר סרום.</li>
	<li>מאוורר את התרבות על ידי 95% האוויר ו 5% CO2 ו-דגירה ב 37 °C.</li>
	<li>לאחר התיישבו התאים (כ -24 שעות לאחר הציפוי), שנו את המדיה. לפצל את הצלחת ב 1:10 יחס ותרבות עשר צלחות, כל המכיל 20 מ ל של מדיה.</li>
	<li>מדיית הקציר והבריכות מתשע לוחות אלה (180 mL) בשעה~ 70-80% כאשר התאים עדיין בשלב הצמיחה.</li>
	<li>חלק את המדיה לתוך 60 mL ו 120 mL, לפצל עוד לתוך 30 מ"ל/tube, ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 15 דקות.</li>
	<li>להעביר את supernatant מכל צינור לצינור חדש סטרילי 50 mL ולבצע את אקסוקצת בידוד.</li>
	<li>בידוד אקסוזומים באמצעות משקעים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו (ראה, לדוגמה, הפניה11) או פעל לפי הוראותהיצרן אםערכת בידוד מסחרית (טבלת חומרים) משמשת. כצעד הראשון במקרה האחרון, תא צנטריפוגה בינונית ב 3,000 x g עבור 15 דקות נסיגה supernatant ולהשליך תאים ופסולת תא.</li>
	<li>הוסף את פתרון המשקעים (1:5 יחס הנפח) אל הסופרנטאנט, ערבב ומקרר בין לילה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה.</li>
	<li>ספין שנותר אקזום גלולה עבור אחר 5 דקות ב 1,500 x g. מבלי לפגוע בגלולה, הסר את פתרון המשקעים הנותר בשאיפה.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולהב 100-500 μl של מאגר מתמיסת מלח באגירה של 1x פוספט (PBS) וחלק לתוך מספר מאגרים לפי הצורך בניתוח במורד הזרם.</li>
	<li>המשיכו מיד אל פני השטח של האקסוזומים המבודדים עבור דימות AFM. במקרה הצורך, הקפא את הפחת ב-80 °C לשימוש מאוחר יותר בעת נקיטת אמצעי זהירות כדי למנוע נזק למדגם במהלך המחזור הקפאת ההפשרה.</li>
</ol>2. קיבוע פני השטח של שלפוחית המים
<ol><li>השתמש בקלטת כפולה וחזקה, אפוקסי או דבק חלופי כדי לצרף בחוזקה דיסק נציץ אל מיקרוסקופ מינהור AFM/סריקה (STM) מגנטי מדגם פלדת אל-חלד.</li>
	<li>קליב מיכה דיסק באמצעות תער חדה או סכין השירות, או על ידי הצמדת קלטת דבק למשטח העליון ולאחר מכן להוציא אותו כדי להסיר שכבה של חומר. הערה: כל אחת מהשיטות אמורה לחשוף משטח בתולי על ידי הסרת שכבה דקה של נציץ שנחשפה בעבר לסביבה. לאחר ההליך, את הקובץ המצורף של נציץ לדיסק הדגימה AFM/STM חייב להישאר יציב.</li>
	<li>בטמפרטורת החדר, לטפל במשטח העליון של נציץ עבור 10 s עם 100 μL של 10 מ"מ2 פתרון, אשר משנה את הטעינה על פני השטח משלילי לחיובי.</li>
	<li>כתמים לחסום2 פתרון עם מחיקה נטול מוך או נייר מוכתם. שטוף את משטח נציץ 3 x עם מים מוכי (DI) ויבש אותו עם זרם של חנקן יבש. הערה: מומלץ לסרוק את משטח השינוי באמצעות AFM כדי לוודא שהוא חופשי ממזהמים.</li>
	<li>הצב את הדיסק הדגימה של AFM עם נציץ משטח מחובר בצלחת פטרי.</li>
	<li>לדלל את הדגימה אקסוזום משלב 1.14 עם 1x PBS לקבל ריכוז בין 4.0 x 109 ו 4.0 x 1010 חלקיקים לכל mL של הפתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל. בעזרת נ. ב. א</li>
	<li>טופס ירידה sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון 100 μL של פתרון אקסוחלק מדולל של פיפטה.</li>
	<li>הנח את המכסה על צלחת הפטרי וחתום אותו בסרט פרפין כדי להפחית את האידוי לדוגמה. מודג את המדגםעבור 12 עד18 h ב 4 °צלזיוס. הערה: צפיפות פני השטח של האקסוזזומים יגדל עם זמן הדגירה והריכוז של EVs בנוזל. זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ אם האקסוזומים נוכחים במדגם בריכוזים נמוכים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, מאספירין80-90% של המדגם מבלי להפריע את פני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיה מכוון אלקטרוסטטי על מצע נציץ.</li>
	<li>לפני הדמיה EVs להתייבש, לשטוף את פני השטח עם 1x PBS. חזור על 3x. דאג לשמור את הדגימה להתייבש במהלך תהליך השטיפה.</li>
	<li>לאחר שטיפת משטח נציץ עם 1x PBS, להסיר80%-90% שלנוזל, ו פיפטה ~ 40 μl של חדש 1x pbs לכסות את המדגם.</li>
	<li>בעת הדמיה EVs מיובש, לשטוף את המצע עם מים DI. חזור על 3x. הערה: שטיפה עם מים די תמנע היווצרות גבישי מלח והפקדת מסיסות על פני השטח כמצע מתייבש.</li>
	<li>לפני הדמיה EVs, מייבשים כמו נוזל הרבה ככל האפשר מבלי לגעת במשטח ולייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש.</li>
</ol>3. AFM הדמיה
<ol><li>כדי לצלם את EVs התייבשות, בחר מזיז שנועד לסריקת באוויר בהקשה ובמצבי דימות שאינם אנשי קשר והבהר אותו על מחזיק המקדח. הערה: המאפיינים של שלוחה לדוגמה המפורטים בטבלה של חומרים (123 יקרומטר אורך, 40 יקרומטר רוחב, 7 ברדיוס ננומטר, ו 37 N/m קבוע האביב) עשוי לשמש כמדריך בעת בחירת בדיקה תואם עם מכשור afm זמין.<ol>
<li>מניחים את ההכנה משלב 2.13 בשלב AFM. הדיסק המגנטי של פלדת אל-חלד. ישתק את הדגימה על הבמה אפשר זמן להכנה ולשלב למתן שיווי משקל.</li>
		<li>השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור גדול מספיק של משטחהנציץ. לדוגמה, בחר אזור של 5 x 5 μm, ש512 שורות בקצב סריקה של ~ 1 Hz. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב כפי שהם מספקים מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם. הערה: זמן הסריקה יגדל עם אזור הדימות ומספר השורות שנבחרו ליצירת התמונה אך הפחתה בקצב הסריקה שהוגדר כמספר השורות שנסרקו לשניה. שיעורי סריקה מהירה עשויים להשפיע על איכות התמונה. לפיכך, על מהירות הטיפול לאזן את העסקת החליפין בין זמן הרכישה לבין איכות התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לתמונה שלפוחית הנוזלים, בחר שלוחה המתאימה לסריקת דגימות רכות ומהתייבשות והר הזיז אל בעל המקדח המיועד לסריקת נוזלים. הערה: בעת בחירת החללית תואם עם מכשור afm זמין, את המפרט של החללית המפורטים בטבלה של חומרים (שלוחה משולשת עם 175 יקרומטר הנומינלי אורך, 22 יקרומטר רוחב, 20 הרדיוס ננומטר, 0.07 N/m קבוע האביב, ו ממוטב לדימות עם תדירות הכונן בטווח בין 4 ל-8 kHz) עשוי לשמש כמדריך.<ol>
<li>להרטיב את קצה הזיז עם 1x PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לתוך הנוזל במהלך סריקה.</li>
		<li>מניחים את ההכנה משלב 2.11 בשלב AFM. הדיסק מגנטי פלדת אל-חלד יהיה לשתק את נציץ המצורפת המכילה EVs על פני השטח שלה.</li>
		<li>אפשר זמן להכנה ולשלב ה-AFM למתן שיווי משקל.</li>
		<li>התמונה המשטח המים הרטוב ביותר במצב הקשה. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב. הערה: איכות ההדמיה מושפעת מהמכשור, הבדיקה הנבחרת ומפרמטרי הסריקה. בעת אופטימיזציה של תנאי הסריקה, האפשרויות הבאות ניתן להשתמש כנקודת התחלה: 5 x 5 יקרומטר שטח שנסרק ב 512 שורות עם ~ 0.8-1.0 שיעור סריקה הרץ ותדירות כונן בין 4 אל 8 kHz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח תמונה
הערה: השלבים הבאים של עיבוד וניתוח נתונים מוחלים על תמונות הגובה הנרכש. הליך דומה עשוי להתאים לניתוח נתוני הפאזה. התיאור שלהלן הוא ספציפי לGwyddion12, תוכנת קוד פתוח וחופשית הזמינה תחת הרישיון הציבורי הכללי של GNU. יכולות דומות זמינות בכלי תוכנה חלופיים.
<ol><li>עבור אל תהליך הנתונים, מצבי spm, עצה ובחר עצה דגם (איור 2). בחרו בגיאומטריה ובממדי העצה המשמשים לסריקת המדגם ולחצו על הלחצן ' אשר'.</li>
	<li>תקן את הפריטים שחיקת הקצה על ידי ביצוע שחזור פני השטח. . פתח את התמונה מהתפריט, בחר תהליך נתונים, מצבי spm, עצה, ואז לבחור שחזור פני השטח ולחץ על אישור (איור 3).</li>
	<li>יישר את מישור ההדמיה כך שיתאים למישור ה-XY של המעבדה על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. כדי לבצע משימה זו, בחר תהליך נתונים, רמה ובחר רמת מישור (איור 4).</li>
	<li>יישר שורות של התמונה על-ידי בחירת תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ולאחר מכן בחר באפשרות ישר שורות. מספר אפשרויות יישור זמינות (איור 5). לדוגמה, חציון הוא אלגוריתם המוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומסיר אותו מהנתונים.</li>
	<li>עבור אל תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ובחר הסר צלקות (איור 6), אשר מסיר שגיאות סריקה נפוצות המכונה צלקות.</li>
	<li>יישר את משטח הנציץ בגובה האפס, Z = 0, על-ידי בחירה באפשרות ' שטח בסיס ברמה ' בתפריט נפתח מתהליך הנתונים (איור 7).</li>
	<li>זיהוי EVs על המשטח שנסרק באמצעות ' סימון לפי סף ' בתפריט הנפתח של גרגירים (איור 8a). אלגוריתם זה מזהה אקסוזומים משטח המשטח כמו חלקיקים בולטות מהמצע אפס פני השטח בגובה מעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר, דבר שיבטל את רוב ההפרעות ברקע. גדלי סף קטנים משמשים עם רקע נקי יותר. הערה: הסף באיור 8A הוא 1.767 ננומטר. תוצאת הזיהוי הסף של MCF-7 מופיעה באיור 8B. Gwyddion מציעה מספר חלופות לסף כאלגוריתם לזהות באופן אוטומטי שלפוחיות בתמונה, כולל סף אוטומטי (שיטת Otsu), זיהוי קצוות, ואלגוריתם פרשת הדרכים. הערה: כאשר מדובר בדימוי החלקיקים, אם קיים בתמונת AFM, עשוי להיות מוסווה ואינו נכלל בניתוח.</li>
	<li>בצע אפיון גיאומטרי ומימדי של הEVs המזוהה באמצעות אלגוריתמי ההפצות הזמינים הנגישים מתפריט דגנים . הערה: Gwyddion מספק כלים כדי להעריך את ההתפלגות של התפלגות שיטתית, בעלי ערך שיטתי, נפחי, ומאפיינים אחרים של קיבוע EVs במצב רטוב או משומנים. דוגמה למאפיין של ערכים סקלריים מוצגת באיור 9, המעניקה את התפלגות הגבהים המרביים בתוך טביעת הרגל של כל אקסומזהה.</li>
	<li>יצא את נתוני AFM מGwyddion לניתוח מיוחד של כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית.</li>
</ol>

<ol><li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li>
<li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li>
<li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li>
<li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001(2018).</li>
<li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).</li>
<li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li>
<li>Nečas, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gwyddion%3A+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Physics%22%5BJournal%5D)">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li>
<li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).</li>
<li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li>
<li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603(2015).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva%2C+using+correlative+AFM%2C+FESEM%2C+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li>
<li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+amniocytes+express+hTERT%2C+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li>
<li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circulating+Biomarkers%22%5BJournal%5D)">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li>
<li>Pastré, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions%3A+A+Theoretical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification%2C+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השתק של EVs מתוך נוזל ביולוגי, סריקת פני שטח, וניתוח תמונה הם הצעדים החיוניים של הפרוטוקול המפותח לאפיון AFM של EVs בנוזל. מספר השלפוחיות והקלה על מאזני הדמיה AFM עם שטח התמונה המשטח ואת ריכוז פני השטח של השלפוחיות על המצע. בהינתן פוטנציאל זטה שלילי של EVs ואקסוזומים18, אנו תומכים קיבעון אלקטרוסטטי של EVs מדגימות נוזל למצע afm. השתק יעיל כאשר המשטח טעון בחיוב. לפני הזמן, מטען השטח חיובי צריך להיות הנחילה למצע, כמו במקרה של נציץ-מינרל סיליקט שכבתית עם הנוסחה כללי קל2(alsi3O<su...

שלפוחיות (EVs) קיימות בכל נוזלי הגוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב ונוזל השפיר. אקסוזומים טופס מחלקה מחוז של EVs הבדיל מתוך EVs אחרים על ידי ביוגנזה אנדוזומבית, סמנים של השביל האנדוזומבית, ואת הגודל הקטן ביותר בין כל EVs. הגודל של האקסוזומים מדווח לעתים קרובות עם שינויים ניכרים בין הלימודים. תוצאות שינוי גודל נמצאו להיות תלויים שיטה, המשקף את ההבדל בעקרונות פיזיים המועסקים על ידי טכניקות אנליטיות שונות כדי להעריך EV גדלים1,2. לדוגמה, ניתוח המעקב הננו-חלקיק (נ. ת. ע)-טכניקת האפיון בגודל הנפוץ ביותר-מעריך את הגודל של EVs כקטרים ההידרודינמיים שלהם, המאפיינים את ההתנגדות לניידות הבראונית של EVs בפתרון. קוטר הידרודינמי גדול יותר של שלפוחית מרמזת על הניידות הנמוכה שלה בנוזל. השכבה הקורלית סביב שלפוחיות, המורכב של חלבונים פני השטח ומולקולות אחרות מעוגן או נספחת אל פני הקרום, מאוד מעכבת את הניידות ומגבירה את הגודל ההידרודינמי של EVs. במונחים יחסיים, גידול זה גדול במיוחד עבור האקסוזומים3, כפי שמודגם באיור 1.
שידור הקריוגני (המיקרוסקופיה) הוא טכניקה מוחלטת באפיון גדלים ומורפולוגיה במדינות ההתייבשות. עם זאת, את העלות הגבוהה של המכשור ואת המומחיות המקצועית הדרושים כדי להשתמש בו נכון להמריץ את החקירה של טכניקות חלופיות שיכול לEVs נוזלים. מספר קטן יחסית של EVs שנצפו או מאופיין בתמונות הקריו-TEM הנרכשים, הוא חיסרון בולט נוסף של טכניקה זו.
מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) לדמיין את הטופוגרפיה תלת מימדי של רטוב או מיובש EVs4,5,6 על ידי סריקת בדיקה על פני המצע כדי לסרוק את התמונה של החלקיקים על פני השטח. הצעדים החיוניים של הפרוטוקול לאפיון EVs על ידי AFM מתוארים במחקר זה. לפני הדמיה של שלפוחיות בנוזל, הם חייבים להיות מקיבוע על מצע על ידי הקשירה למשטח פונקציונליזציה, השמנה במסנן, או על ידי משיכה אלקטרוסטטית7. הקיבעון האלקטרוסטטי על מצע טעונה באופן חיובי הוא אופציה נוחה במיוחד עבור השתק של אקזומים הידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי. עם זאת, את אותם כוחות אלקטרוסטטית ששתק את שלפוחיות החילוץ על פני השטח גם לעוות את צורתם, מה שהופך ניתוח נתונים לאחר הדמיה חיוני. אנו להרחיב נקודה זו על ידי תיאור האלגוריתם המתאר את הגודל של כדורי שלפוחיות בפתרון מבוסס על נתוני AFM על הצורה מעוותת של האקסוזומים מקיבוע על פני השטח.
בפרוטוקול המפותח מוצג הנוהל של הטיפול הסטטי של השלפוחיות ולאחריו השלבים הדרושים לביצוע הדמיה של כוח אטומי במצבי היובש או ההתייבשות. הגורמים המשפיעים על הריכוז של פני השטח של השלפוחית הקיבוע מזוהים. ההדרכה ניתנת על איך לבצע את השתק אלקטרוסטטי עבור דגימות עם ריכוזים שונים של EVs בפתרון. הבחירה של התנאים הניסיוניים המתיר הערכה של הפצות ההסתברות האמפירית של מאפיינים ביופיזיים שונים המבוססים על מספר גדול מספיק של קיבוע ושלפוחיות הוא נדון. דוגמאות לניתוח לאחר הדמיה של נתוני AFM ניתנים. באופן ספציפי, אלגוריתם מתואר לקביעת גודל ושלפוחיות בתמיסה המבוססת על אפיון AFM של קיבוע EVs. תוצאות הנציג להראות את העקביות של שלפוחית האחיזה על ידי AFM עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM.

<table><tbody><tr><td>בקר AFM/STM&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Multimode Nanoscope V</td><td>בקר AFM זה תומך בהדמיה של דגימות ביולוגיות בנוזל ובאוויר.</td></tr><tr><td>דיסקי דגימת מתכת AFM/STM (10 מ"מ)</td><td>TedPella</td><td>16207</td><td>דיסק דגימת מתכת שעליו מחובר דיסק נציץ באמצעות סרט דו צדדי או באמצעים אחרים.</td></tr><tr><td>דיסקי נציץ AFM/STM (10 מ"מ)</td><td>TedPella</td><td>50</td><td>נציץ V1 באיכות הגבוהה ביותר, עובי 0.21 מ"מ (0.0085 אינץ'). שזורים, באריזות של 10. ניתן להרכבה על דיסקי AFM/STM. זמין בארבעה קטרים</td></tr><tr><td>בדיקת AFM להדמיה באוויר</td><td>Bruker</td><td>TESP-V2</td><td>בדיקות סיליקון חרוטות באיכות גבוהה למצב הקשה ומצב ללא מגע לסריקה באוויר.</td></tr><tr><td>בדיקת AFM להדמיית דגימה רכה בנוזל</td><td>Bruker</td><td>MLCT</td><td>רך סיליקון ניטריד עם קצות סיליקון ניטריד, המתאימים היטב להפעלה נוזלית. טווח קבועי הכוח מאפשר למשתמשים לדמות דגימות רכות במיוחד במצב מגע כמו גם ספקטרוסקופיה של עומס גבוה לעומת מרחק.</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>ספקטרום</td><td>360-77705</td><td>משמש לקיבוע דיסק הנציץ על דיסק דגימת המתכת.</td></tr><tr><td>ExoQuick-TC</td><td>System Biosciences</td><td>EXOTC50A-1</td><td>ExoQuick-TC היא ערכה קניינית מבוססת פולימר המיועדת לבידוד אקסוזומים ממצע תרבית רקמות.</td></tr><tr><td>מחזיק AFM בדיקה מזכוכית להדמיה בנוזל</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; MTFML-V2</td><td>מחזיק בדיקה מזכוכית זה מיועד לסריקה בנוזל עם MultiMode AFM.&nbsp; ניתן להשתמש במחזיק במצב הקשה בכוח שיא, מצב מגע, מצב הקשה ואפנון כוח.&nbsp; הגשושית מונעת אקוסטית על ידי מתנד פייזו נפרד לאפנון משרעת גדולה יותר.&nbsp; המחזיק מסופק עם שתי יציאות, אביזרים נדרשים וערכת אביזרים להוספה והסרה של נוזלים.</td></tr><tr><td>המכון הצ'כי למטרולוגיה</td> <td>גווידיון</td>.<td>גרסה 2.52</td><td>תוכנת קוד פתוח להדמיה וניתוח של שדות נתונים המתקבלים על ידי טכניקות מיקרוסקופיה של בדיקה.</td></tr><tr><td>נייר ספיגה נטול מוך</td><td>GE Healthcare Whatman&nbsp;</td><td>נייר ספיגה GB003 בדרגה</td><td>השתמש בנייר ספיגה זה כדי להסיר NiCl2 לאחר שינוי המצע של הנציץ.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מגבונים לחדר נקי ללא מוך</td><td>Texwipe</td><td>AlphaWipe TX1004</td><td>השתמש במגבוני פוליאסטר אלה לניקוי משטחים.&nbsp;</td></tr><tr><td>ניקל (II) כלוריד (NiCl2)</td><td>אבקת סיגמא-אולדריץ'</td><td>339350</td><td>המשמשת לייצור 10 מ"מ NiCl2 במי DI</td></tr><tr><td>מי מלח פוספט בופר (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

אקסוזומים ושלפוחיות אחרות (EVs) הם מתחמי מולקולריים המורכב של קרום שומנים ושלפוחית, עיטור פני השטח שלה על ידי חלבונים ממברנות ומולקולות אחרות, ותוכן מגוון לומיאל בירושה מתא הורה, הכולל RNAs, חלבונים ו-DNAs. האפיון של גדלים הידרודינמיים של EVs, אשר תלוי בגודל של שלפוחית ואת השכבה הקורולית שלה נוצר על ידי קישוטי פני השטח, הפך שגרתי. עבור האקסוזומים, הקטן ביותר של EVs, ההבדל היחסי בין ההידרודינמיקה והשלפוחיות הוא משמעותי. אפיון של גדלים ושלפוחיות על-ידי מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הקריוגני (הקפאה-TEM), טכניקת הזהב בתקן, נשאר אתגר בשל עלות המכשיר, המומחיות הנדרשת לבצע את ההכנה לדוגמה, הדמיה ו ניתוח נתונים, ומספר קטן של חלקיקים שנצפו לעתים קרובות בתמונות. חלופה רחבה ונגישה לשימוש היא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), אשר יכול לייצר נתונים מגוונים על גאומטריה תלת ממדית, גודל, ומאפיינים אחרים ביופיזיים של שלפוחיות. הפרוטוקול המפותח מדריך את המשתמשים באמצעות כלי אנליטי זה ומתווה את זרימת העבודה לניתוח של EVs על ידי AFM, הכולל את ההכנה לדוגמא לדימות EVs בצורה מהתייבשות או מיובש, השתק אלקטרוסטטי של שלפוחיות על מצע, רכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. תוצאות הנציג להפגין כי קיבעון של EVs על משטח נציץ שונה צפוי, להתאמה אישית, ומאפשר למשתמש להשיג תוצאות לשינוי גודל עבור מספר רב של שלפוחיות. שינוי הגודל המבוסס על נתוני AFM נמצא להיות עקבי עם הדמיה הקפאה-TEM.

קיבוע פני השטח של EVs הוא צעד קריטי ברצף ההדמיה. משטח אלקטרוסטטי של אקסוזומים, ידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי, יהיה מכבש להתרחש לאחר המצע של נציץ הוא שונה כדי לקבל טעינה חיובית משטח. ללא הטיפול עם NiCl2 להקנות שינויים משטח חיובי, השתק של EVs על המצע נמצאה לא יעילה. התמונה גובה באיור 10A, רכשה באוויר לאחר מדגם mcf-7 אקסוזום המכיל 2.59 x 1010 ושלפוחיות לכל mL של PBS היה מודח עבור 12 h על משטח שאינו משנה של נציץ טרי, מראה מעט מאוד שלפוחיות שנותרו ב פני השטח לאחר ני...

הליך צעד-אחר-צעד מתואר עבור השתק ללא תווית של אקסוזומים ושלפוחיות מעיים מדגימות נוזל והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). התמונות AFM משמשות כדי להעריך את הגודל של השלפוחיות בפתרון ולאפיין מאפיינים ביופיזיים אחרים.

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

פרוטוקול זה מתאר הכנה פשוטה להדמיית AFM של וקסיקים חוץ-תאיים בצורות מיובשות מיובשות, קיבוע אלקטרוסטטי, סריקת משטחים, זיהוי וריזי וניתוח נתונים ופרשנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא קיבעון אלקטרוסטטי נוח של גירויים על פני העור וניתוח הדמיה פוסט להסביר עיוות צורה הנגרמת על ידי קיבוע. תוצאות גודל וריקבלה עולים בקנה אחד עם הדמיה CryoTEM תקן זהב אשר נשאר טכניקה יקרה ומאתגרת.אם אתה משתמש AFM חדש, להתחיל עם אפיון של דגימות יבשות לפני שתמשיך דגימות hydrated. כי ישנם גורמים רבים נוספים שיכולים להשפיע על רכישת מדגם hydrated. כדי להתחיל, לבודד דם חוץ תאי מנוזל ביולוגי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, חבר בחוזקה דיסק נציץ לדיסק דגימת נירוסטה מגנטי. Cleave דיסק נציץ באמצעות סכין גילוח חדה כדי לחשוף שכבה חדשה של חומר. בטמפרטורת החדר, לטפל על פני השטח העליונים של נציץ במשך עשר שניות עם מאה מיקרו ליטר של פתרון כלוריד ניקל 10 מילימולאר II.זה משנה את המטען של פני השטח מלהיות שלילי לחיובי. תמחק את תספורת הכלוריד של ניקל II עם נייר לנגב או סופג ללא מוך. לאחר מכן, לשטוף את משטח נציץ שלוש פעמים עם מים deionized ולייבש אותו עם זרם של חנקן יבש.מניחים את דיסק הדגימה AFM עם המשטח המצורף שונה נציץ לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, לדלל את האקסוזומים עם PBS כדי להשיג ריכוז בין ארבעה לארבעים מיליארד חלקיקים למיליליטר של פתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים ננו.טופס טיפת sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון מאה microliters של פתרון exosome מדולל מ pipette. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת פטרי ולאטום אותו עם סרט פרפן כדי להפחית את אידוי מדגם. דגירה במקרר במשך שתים עשרה שעות.לאחר הדגירה, שאפו 80 עד 90 אחוזים מהדגימה בזהירות מבלי להפריע לפני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיו משותקים אלקטרוסטטית על מצע הנציץ. כאשר הדמיה דגימות hydrated, לשטוף את פני השטח שלוש פעמים עם PBS.יש לדאוג לשמור על המדגם hydrated לאורך כל תהליך שטיפה. לאחר שטיפת משטח נציץ עם PBS, להסיר 80 עד 90 אחוזים של נוזל פיפטה ארבעים microliters של PBS טרי כדי לכסות את המדגם. הדגימה hydrated מוכן להדמיה.בעת הדמיה של EV מיובש, להסיר את המלחים מפני השטח על ידי שטיפה של המצע שלוש פעמים עם מים deionized. לאחר שאף נוזלים רבים ככל האפשר, מבלי לגעת על פני השטח, לייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש. כדי לדמיין את הווסקולים החוץ-תאיים מיובשים, בחר cantilever המיועד לסריקה באוויר במצבי הקשה והדמיה ללא מגע והתקן אותו על מחזיק הבדיקה.מקם את הדגימה על הבמה AFM. דיסק הדגימה של נירוסטה מגנטית ישתק את הדגימה על הבמה. מקם את מחזיק הגשוש לתוך AFM.אפשר זמן ההכנה ואת הבמה כדי לצייד תרמית. השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור שהוא 5x5 מיקרון רסטר ב 512 שורות בקצב סריקה של הרץ אחד. רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה מכיוון שהן מספקות מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם.זמן הסריקה יגדל עם אזור בתמונה ומספר השורות שנבחרו כדי ליצור את התמונה, אך יקטן עם קצב הסריקה. מכיוון שתעריפי סריקה מהירים עשויים להשפיע על איכות התמונה, מהירות הרסטר צריכה להיות איזון בין זמן הרכישה לאיכות התמונה. כדי לדמיין זרעים hydrated, בחר cantilever המתאים לסריקת דגימות רכות, hydrated ולהוות את cantilever על מחזיק בדיקה המיועד לסריקה בנוזלים.הרטב את קצה cantilever עם PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לנוזל במהלך הסריקה. לאחר מכן, לשתק את המדגם על הבמה AFM. לאחר הדגימה שיווי משקל תרמי, תמונה משטח נציץ hydrated במצב הקשה.רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה. כדי לנתח את התמונות שצולמו, עבור תחילה למצבי SPM נבחרים של תהליך הנתונים, ולאחר מכן בחר עצה'בחר את תיאור הדגם'בחר את הגיאומטריה ואת מידות הקצה המשמשות לסריקת הדגימה ולחץ על אישור'תקן את ממצאי שחיקת הקצה על-ידי ביצוע שחזור פני השטח. פתח את התמונה.מהתפריט, בחר תהליך נתונים'לאחר מכן בחר מצבי SPM ואחריו עצה'לאחר מכן בחר שחזור משטח'ולחץ על אישור'הבא, בחר תהליך נתונים ואחריו Level'ובחר Level'כדי ליישר את מישור ההדמיה ולתאים למישור המעבדה XY על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. ישר שורות בתמונה על-ידי בחירה באפשרות תהליך נתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ולאחר מכן בחר 'ישר שורות'מספר אפשרויות יישור זמינות כולל חציון שהוא אלגוריתם שמוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומחסיר אותו מהנתונים. לאחר מכן, עבור אל תהליך הנתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ובחר הסר צלקות'פעולה זו תסיר שגיאות סריקה נפוצות הידועות בשם צלקות'כדי ליישר את משטח הנציה בגובה אפס, עבור לתפריט תהליך נתונים ובחר שיטוח בסיס'בתפריט הנפתח Level'.זהה את הווסקים התאיים הנוספים על פני השטח הסרוקים על ידי מעבר לתפריט הגרגרים ושימוש ב-Mark by Threshold'This אלגוריתם מזהה אקסוזומים משותקים על פני השטח כחלקיקים הבולטים ממצע פני האפס בגובה שמעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר. זה יחסל את רוב ההפרעה לקרקע האחורית.לבסוף, בצעו אפיון גיאומטרי ומימדי של הווסיקים המזוהים באמצעות אלגוריתמי ההפצה הזמינים הנגישים מתפריט הגרגרים. יצא את נתוני AFM מ- Gwyddion לניתוח מיוחד על-ידי כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית. שינוי פני השטח של ניקל כלוריד גורם לשתק של ורידים תאיים נוספים התלויים בזמן.ריכוז פני השטח של הווסיקים משותקים הוא צפוף מדי לאחר 24 שעות של דגירה ואילו הדגירה 12 שעות מוביל פחות exosomes ונתונים סריקה כי קל יותר לנתח במדויק. תמונת AFM זו מציגה אקסוזומים MCF7 hydrated משותקים אלקטרוסטטית על משטח נציץ שונה. תמונת שלב AFM המתאימה מאשרת כי הגרגרים בתדמית הגובה הם חלקיקי ננו רכים כפי שניתן לצפות עבור וריגרם קרום.נתוני הגובה של שלושה ורייקים לאורך אותו קו מוצגים כאן. פרופילים אלה ממחישים צורה שטוחה הנגרמת על ידי המשיכה האלקטרוסטטית של אקסוזומים למשטח המטען החיובי של הנציה ששונתה. עיוות הצורה ניכר בתצוגה מוגדלת של הווסיל משותק וחתך רוחב שלו.כדי להעריך את הגודל הכדורי של האקסוזומים בתסרון, על יכול להתאים את אמצעי האחסון מוקף משטח משותק מעטפות קרום כדורי. התפלגות הגודל של וריקולים כדוריים בפתרון נקבעה מנתוני AFM של 561 וריקולים משותקים. גדלי הווסיל בתמונות CryoTEM תואמים לתוצאות AFM.לפני הדמיה exosomes מזמורים, חשוב לזכור לשטוף ביסודיות את פני השטח עם PBS. פעולה זו תסיר אקסוזומים נכנסים ותמנע את ההחזקה שלהם לקצה AFM. כאשר מדמיינים את האקסוזומים היבשים, הקפד להשתמש במים DI לעלות המצע.לשטוף DI ימנע היווצרות של גבישי מלח על פני השטח כמו המצע מתייבש. אם קיים, גבישי מלח יהפוך את עיבוד התמונה למשימה קשה.

imaging-of-extracellular-vesicles-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מקור: Biller, S. J., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הכנת השלפוחיות החוץ-תאיות של ציאנובקטריאליות למיקרוסקופ אלקטרונים על ידי צביעה שלילית, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה, גודל וטוהר השלפוחית לניתוחים מבניים והשוואתיים.

הדמיה של שלפוחיות ציאנובקטריאליות חוץ-תאיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה כדי לדמיין ולכמת את הספיגה התאית של שלפוחיות חוץ-תאיות או EVs. בדיקה זו עושה שימוש בהדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומאפשרת להבחין בין כלי רכב חשמליים מופנמים לבין רכבים חשמליים המודבקים לפני השטח של התא.

בדיקת ספיגת שלפוחית חוץ-תאית: שיטה לדמיין ולכמת ספיגה תאית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות טכניקת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית

סרטון זה מדגים את הלכידה החיסונית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות צימודים של ננו-חלקיקים מגנטיים עם תווית פלואורסצנטית. התהליך כולל היווצרות מורכבת, צביעה בנוגדני זיהוי מסומנים פלואורסצנטית, הפרדה מגנטית וניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון אנטיגני.

לכידה חיסונית וציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לאפיון אנטיגני

Source: Lunelli, L., et. al. הצצה בפוליזומים במוח עם כוח אטומי מיקרוסקופיה. J. Vis. Exp.(2016).סרטון זה מדגים הדמיה של פוליזומים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. יריעת נציץ מצופה יוני ניקל מעגנת RNA עם ריבוזומים מחוברים. הדגימה נשטפת, מיובשת ומותקנת על במת המיקרוסקופ. קצה השלוחה סורק את פני הדגימה, רושם סטיות לייזר כדי למפות את הטופולוגיה. תוכנה משמשת לתיקון עיוותים ולהמחשת מבני פוליזום ברזולוציה גבוהה.

 הדמיית פוליזומים שבודדו ממוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות שונות הדרושות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים כולל צביעת שלילי, חלוקתה ודק במיוחד עבור מבנה נתונים היסטוריים, חיסונית-זהב labelling כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים ב- exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ולשבירת הקפאה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בתאי אורותל סרטניים. טכניקת ההקפאה-שבר חשפה את הקוטר והצורה של כלי הרכב החשמליים וכמאפיין ייחודי - את הארגון הפנימי של ממברנות ה-EV. אלה הם בעלי חשיבות עצומה בהבנת האופן שבו כלי רכב חשמליים מתקשרים עם הממברנות המקבלות.

מיקרוסקופיית אלקטרונים של שברים קפואים לניתוח שלפוחית חוץ-תאית

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

למד הדמיה של שלפוחיות ומסחטות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ללא סימון. שיטת ההתמצעות האלקטרוסטטית מאפשרת אפיון ביופיזיקלי מדויק של גודל וצורה בדגימות לחות ומיובשות.

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים