הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר הכנה פשוטה להדמיית AFM של וקסיקים חוץ-תאיים בצורות מיובשות מיובשות, קיבוע אלקטרוסטטי, סריקת משטחים, זיהוי וריזי וניתוח נתונים ופרשנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא קיבעון אלקטרוסטטי נוח של גירויים על פני העור וניתוח הדמיה פוסט להסביר עיוות צורה הנגרמת על ידי קיבוע. תוצאות גודל וריקבלה עולים בקנה אחד עם הדמיה CryoTEM תקן זהב אשר נשאר טכניקה יקרה ומאתגרת.

אם אתה משתמש AFM חדש, להתחיל עם אפיון של דגימות יבשות לפני שתמשיך דגימות hydrated. כי ישנם גורמים רבים נוספים שיכולים להשפיע על רכישת מדגם hydrated. כדי להתחיל, לבודד דם חוץ תאי מנוזל ביולוגי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן, חבר בחוזקה דיסק נציץ לדיסק דגימת נירוסטה מגנטי. Cleave דיסק נציץ באמצעות סכין גילוח חדה כדי לחשוף שכבה חדשה של חומר. בטמפרטורת החדר, לטפל על פני השטח העליונים של נציץ במשך עשר שניות עם מאה מיקרו ליטר של פתרון כלוריד ניקל 10 מילימולאר II.

זה משנה את המטען של פני השטח מלהיות שלילי לחיובי. תמחק את תספורת הכלוריד של ניקל II עם נייר לנגב או סופג ללא מוך. לאחר מכן, לשטוף את משטח נציץ שלוש פעמים עם מים deionized ולייבש אותו עם זרם של חנקן יבש.

מניחים את דיסק הדגימה AFM עם המשטח המצורף שונה נציץ לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, לדלל את האקסוזומים עם PBS כדי להשיג ריכוז בין ארבעה לארבעים מיליארד חלקיקים למיליליטר של פתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים ננו.

טופס טיפת sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון מאה microliters של פתרון exosome מדולל מ pipette. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת פטרי ולאטום אותו עם סרט פרפן כדי להפחית את אידוי מדגם. דגירה במקרר במשך שתים עשרה שעות.

לאחר הדגירה, שאפו 80 עד 90 אחוזים מהדגימה בזהירות מבלי להפריע לפני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיו משותקים אלקטרוסטטית על מצע הנציץ. כאשר הדמיה דגימות hydrated, לשטוף את פני השטח שלוש פעמים עם PBS.

יש לדאוג לשמור על המדגם hydrated לאורך כל תהליך שטיפה. לאחר שטיפת משטח נציץ עם PBS, להסיר 80 עד 90 אחוזים של נוזל פיפטה ארבעים microliters של PBS טרי כדי לכסות את המדגם. הדגימה hydrated מוכן להדמיה.

בעת הדמיה של EV מיובש, להסיר את המלחים מפני השטח על ידי שטיפה של המצע שלוש פעמים עם מים deionized. לאחר שאף נוזלים רבים ככל האפשר, מבלי לגעת על פני השטח, לייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש. כדי לדמיין את הווסקולים החוץ-תאיים מיובשים, בחר cantilever המיועד לסריקה באוויר במצבי הקשה והדמיה ללא מגע והתקן אותו על מחזיק הבדיקה.

מקם את הדגימה על הבמה AFM. דיסק הדגימה של נירוסטה מגנטית ישתק את הדגימה על הבמה. מקם את מחזיק הגשוש לתוך AFM.

אפשר זמן ההכנה ואת הבמה כדי לצייד תרמית. השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור שהוא 5x5 מיקרון רסטר ב 512 שורות בקצב סריקה של הרץ אחד. רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה מכיוון שהן מספקות מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם.

זמן הסריקה יגדל עם אזור בתמונה ומספר השורות שנבחרו כדי ליצור את התמונה, אך יקטן עם קצב הסריקה. מכיוון שתעריפי סריקה מהירים עשויים להשפיע על איכות התמונה, מהירות הרסטר צריכה להיות איזון בין זמן הרכישה לאיכות התמונה. כדי לדמיין זרעים hydrated, בחר cantilever המתאים לסריקת דגימות רכות, hydrated ולהוות את cantilever על מחזיק בדיקה המיועד לסריקה בנוזלים.

הרטב את קצה cantilever עם PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לנוזל במהלך הסריקה. לאחר מכן, לשתק את המדגם על הבמה AFM. לאחר הדגימה שיווי משקל תרמי, תמונה משטח נציץ hydrated במצב הקשה.

רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה. כדי לנתח את התמונות שצולמו, עבור תחילה למצבי SPM נבחרים של תהליך הנתונים, ולאחר מכן בחר עצה'בחר את תיאור הדגם'בחר את הגיאומטריה ואת מידות הקצה המשמשות לסריקת הדגימה ולחץ על אישור'תקן את ממצאי שחיקת הקצה על-ידי ביצוע שחזור פני השטח. פתח את התמונה.

מהתפריט, בחר תהליך נתונים'לאחר מכן בחר מצבי SPM ואחריו עצה'לאחר מכן בחר שחזור משטח'ולחץ על אישור'הבא, בחר תהליך נתונים ואחריו Level'ובחר Level'כדי ליישר את מישור ההדמיה ולתאים למישור המעבדה XY על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. ישר שורות בתמונה על-ידי בחירה באפשרות תהליך נתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ולאחר מכן בחר 'ישר שורות'מספר אפשרויות יישור זמינות כולל חציון שהוא אלגוריתם שמוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומחסיר אותו מהנתונים. לאחר מכן, עבור אל תהליך הנתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ובחר הסר צלקות'פעולה זו תסיר שגיאות סריקה נפוצות הידועות בשם צלקות'כדי ליישר את משטח הנציה בגובה אפס, עבור לתפריט תהליך נתונים ובחר שיטוח בסיס'בתפריט הנפתח Level'.

זהה את הווסקים התאיים הנוספים על פני השטח הסרוקים על ידי מעבר לתפריט הגרגרים ושימוש ב-Mark by Threshold'This אלגוריתם מזהה אקסוזומים משותקים על פני השטח כחלקיקים הבולטים ממצע פני האפס בגובה שמעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר. זה יחסל את רוב ההפרעה לקרקע האחורית.

לבסוף, בצעו אפיון גיאומטרי ומימדי של הווסיקים המזוהים באמצעות אלגוריתמי ההפצה הזמינים הנגישים מתפריט הגרגרים. יצא את נתוני AFM מ- Gwyddion לניתוח מיוחד על-ידי כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית. שינוי פני השטח של ניקל כלוריד גורם לשתק של ורידים תאיים נוספים התלויים בזמן.

ריכוז פני השטח של הווסיקים משותקים הוא צפוף מדי לאחר 24 שעות של דגירה ואילו הדגירה 12 שעות מוביל פחות exosomes ונתונים סריקה כי קל יותר לנתח במדויק. תמונת AFM זו מציגה אקסוזומים MCF7 hydrated משותקים אלקטרוסטטית על משטח נציץ שונה. תמונת שלב AFM המתאימה מאשרת כי הגרגרים בתדמית הגובה הם חלקיקי ננו רכים כפי שניתן לצפות עבור וריגרם קרום.

נתוני הגובה של שלושה ורייקים לאורך אותו קו מוצגים כאן. פרופילים אלה ממחישים צורה שטוחה הנגרמת על ידי המשיכה האלקטרוסטטית של אקסוזומים למשטח המטען החיובי של הנציה ששונתה. עיוות הצורה ניכר בתצוגה מוגדלת של הווסיל משותק וחתך רוחב שלו.

כדי להעריך את הגודל הכדורי של האקסוזומים בתסרון, על יכול להתאים את אמצעי האחסון מוקף משטח משותק מעטפות קרום כדורי. התפלגות הגודל של וריקולים כדוריים בפתרון נקבעה מנתוני AFM של 561 וריקולים משותקים. גדלי הווסיל בתמונות CryoTEM תואמים לתוצאות AFM.

לפני הדמיה exosomes מזמורים, חשוב לזכור לשטוף ביסודיות את פני השטח עם PBS. פעולה זו תסיר אקסוזומים נכנסים ותמנע את ההחזקה שלהם לקצה AFM. כאשר מדמיינים את האקסוזומים היבשים, הקפד להשתמש במים DI לעלות המצע.

לשטוף DI ימנע היווצרות של גבישי מלח על פני השטח כמו המצע מתייבש. אם קיים, גבישי מלח יהפוך את עיבוד התמונה למשימה קשה.