ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

קבוצה זו של פרוטוקולים סטנדרטיים יכולה לשמש כדי להציע תובנה חדשה לתוך סולקוס עיני מעולה, או SOS, מבנה שהתגלה לאחרונה של העין המתפתחת. פרוטוקולים אלה יאפשרו לכל ניסוי ברחבי העולם לדמיין בבירור את ה-SOS במהלך התפתחות העיניים של הזברה. התחל על ידי הצבת מפריד צמיחה הטרוזיגי גורם שש זכר ונקבה זברה בצדדים נפרדים של מחיצה במיכל של מים dechlorinated ערב לפני הזיווג שלהם.

למחרת בבוקר, להסיר את המפריד ולאפשר לדגים להתרבות במשך לא יותר מ 30 דקות. בתום תקופת הרבייה, לאסוף את העוברים לתוך מנות פטרי המכילות E3 בינוני עבור הדגירה שלהם באינקובטור 28.5 מעלות. ב 20 שעות לאחר ההפריה, להחליף את supernatant עם E3 בינוני בתוספת 0.004%1-פניל-2-thiourea כדי למנוע ייצור פיגמנט ולבחון את העוברים על ידי מיקרוסקופיה אור כדי לאשר שהם כולם בשלב ההתפתחותי המתאים.

מקם את הדגימות תחת מיקרוסקופ חיטוי. השליכו עוברים לא בוגרים התפתחותית ולהשתמש במטלפים עדין כדי לפרק בעדינות את הצ'ירונים. דמיין את ה- SOS, שעשוי להופיע ככניסה או כקו בשולי הגב של העין.

לאחר מכן, מיין את העוברים ההצגים עיכוב סגירת SOS מאלה שלא. כדי לצלם עוברים אלה באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, הכינו צלחת פטרי המכילה 1%agarose במדיום E3 ודקרו קלות את מרכז ההתעוררות כדי ליצור חור רדוד שלתוכם ניתן להציב את החלמון של העובר. לאחר מכן, מניחים עובר הרדמה באופן מאוחר על אגרוז.

כדי לדמיין את העוברים באמצעות תרכובת או מיקרוסקופ קונפוקל, להעביר עובר לתוך צלחת פטרי 35 מילימטר המכיל בולוס קטן של נקודת התכה נמוכה 1% לא מסולסלים התעורר לתוך E3 בינוני ולהשתמש בקו דיג עדין כדי למקם במהירות את העובר בתמורה הנגלית. כאשר אגרוז התקרר, יוצקים מספיק מדיום E3 לתוך המנה כדי לכסות את אגרוז ולהשתמש עדשה אובייקטיבית טבילה מים 20x כדי לדמיין את SOS. לאחר הדמיה, בעדינות למשוך את agarose מן העובר ולתקן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde או לאפשר דג הזברה להמשיך את התפתחותו.

כדי לדמיין את ה- SOS על ידי ביטוי mRNA פלואורסצנטי, השתמש במנגנוני microinjection כדי להזריק 300 פיקוגרמות של MRNA GFP-CAX משופר לעוברים בשלב התא האחד. לאחר מכן, השתמש בסטריאוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן עוברים עם ביטוי GFP משופר בהיר ולקבל תמונות של העוברים על ידי אחת משיטות ההדמיה כפי שהוכח. עבור כתם immunofluorescent כל הר של למינין זברה עוברי, dechorionate העוברים כפי שהוכח ולתקן את העוברים בצינור microcentrifuge ב 4% paraformaldehyde מוכן טרי במשך שעתיים על שייקר טמפרטורת החדר.

בסוף הקיבעון, לשטוף את העוברים ארבע פעמים PBS בתוספת Tween, או PBST, במשך חמש דקות לשטוף ואחריו permeabilization ב 10 מיקרוגרם למיליליטר או Proteinase K בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לשטוף את העוברים permeabilized ארבע פעמים PBST כפי שהודגם ולחסום את העוברים בסרום עזים 5% ושני מיליגרם למיליליטר של אלבומין סרום בשר ב PBST במשך שעה עד שעתיים על שייקר טמפרטורת החדר. בסוף הדגירה החוסמת, דגירה העוברים בנוגדן העיקרי נגד למינין של עניין בארבע מעלות צלזיוס לילה על שייקר.

למחרת בבוקר, לשטוף את העוברים חמש פעמים PBST במשך 15 דקות לכל לשטוף ולתייג את הרקמות עם נוגדן משני מתאים לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את העוברים ארבע פעמים PBST במשך 15 דקות לכל לשטוף ולמקום את העוברים בצלחת פטרי קטנה המכילה PBST טרי. באמצעות מלקחיים עדין, בעדינות לשבש את החלמונים ולהסיר את תאי החלמון באמצעות גירוד קל של החלמון.

מעבירים את העוברים deyolked לתוך טרי מוכן 30% גליצרול ב PBS, הקפדה למקם את העוברים על גבי הפתרון והעברת מעט של הפתרון הקודם ככל האפשר ולחכות העוברים לשקוע לתחתית הצינור. כאשר העוברים הגיעו לתחתית המיכל, מעבירים אותם ל-50% ו-70% גליצרול רציפים בפתרונות PBS, כפי שהודגם זה בלבד. לאחר שהעוברים שקעו לתחתית מיכל ה-70%גליצרול, מעבירים את הדגימות לצלחת פלסטיק קטנה לניתוחים ומנתקים את העוברים האחוריים אל הישבנים.

באמצעות כלי ניתוח עדין, להעביר ראש אחד לשקופית זכוכית עם גליצרול קטן ככל האפשר בעדינות להכניס סיכת minutien בסדר לתוך החדר הקדם מן הפנים, דוחף כלפי מטה כדי להפריד את החצי הימני והשמאלי של הראש אחד מהשני. כאשר הראש כבר פילה לחלוטין לאורך קו האמצע, הר כל צד של קו האמצע של הראש למטה, צד העין למעלה. ה- SOS ניתן לצפייה דרך המיקרוסקופ הניתוח בשעה 20 עד 23 שעות לאחר ההפריה ובאמצעות הדמיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית כקו דק בעין הגבית המפריד בין חצאי האף והקצב של הרשתית המתפתחת.

בנוסף, כניסה עדינה עשויה להיות גלויה בגבול הגבי של העין. בעקבות הכתם immunofluorescent של למינין, הקו הדק יכול להיות מאושר כמו קרום המרתף. כאשר סגירת SOS מתעכבת, נוכחותה הממושכת ניתן לראות שסוע בולט בצד הגבי של העין תחת מיקרוסקופ ניתוח.

כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ מורכב באמצעות דימות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, תכונה זו בולטת עוד יותר עם הצדדים האף והקצבי של העין מופרדים על ידי SOS, אשר נראה בבירור כקו בעין הגבית. על ידי 28 שעות לאחר ההפריה של דגי זברה בר, כתמי למין מדגים בבירור כי SOS סגור לחלוטין, מה שהופך את זה השלב האידיאלי לניטור עיכובים בסדק סגירה. הזרקת MRNA GFP-CAX משופרת מאפשרת הדמיה של קרום התא של עובר חי או קבוע למעקב אחר שינויים במורפולוגיה של התאים שמובילים לסגירת SOS.

הדמיה של ה- SOS יכולה להיות קשה, מכיוון שהיא צרה וחולף. עם זאת, הכרחי שתשמור על שיטת ניקוד עקבית בעת הערכת עיכובים בסגירה בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקות אלה ניתן לשלב עם מניפולציות ניסיוניות לזיהוי גורמים גנטיים או סוכנים תרופתיים המשפיעים על היווצרות SOS נכונה וסגירה.