Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

פרוטוקול זה מסייע לנו לקבוע כיצד שינויים בביומכניקה מקומית, ארכיטקטורת רקמות, סביבות פרקטריניות ואינטראקציות בין-ספקטרינות משפיעים על פנוטיפ תאי. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור פרדיגמות קלאסיות ועוברים ניסיוניים מבלי לגרום לעלבונות רקמות בקנה מידה גדול המתעוררים בדרך כלל בניסויי גרפים מסורתיים. כדי למצוא את הלחץ הנכון להזרקה, זה מועיל להתחיל בלחץ הזרקה נמוך יותר ולהגדיל בהדרגה עד זרימה קבועה של תאים מושגת.

הדמיה של טכניקה זו מסייעת בהשגת הבנה ישירה של האופן שבו ציוד ההזרקה צריך להיות ממוקם ביחס לרקמת היעד. הדגמת ההליך תהיה שני חברים במעבדה שלי, טרבור הנלי וקנדס תומאס. 24 שעות לפני ההשתלה, למשוך נימי זכוכית על מושך micropipette על פי פרוטוקולים סטנדרטיים לטבול את נימים בסוכן סיליקון כדי לצפות את המשטחים החיצוניים של המחטים.

לאחר מכן, לטעון 5 עד 10 microliters של סוכן סיליקון לתוך קצה פיפטה microinjection ולמקום את הקצה בקצה הרחב של נימי זכוכית אחד מצופה חיצונית משך. מקם את קצה פיפטה קרוב לקצה מחט זכוכית ככל האפשר ולפלט את סוכן סיליקון תוך נסיגה איטית פיפטה טעינה כדי למזער בועות אוויר בתוך המחט. השאירו את סוכן הסיליקון במחט הזכוכית למשך 10 דקות לפני השימוש בפיפטת טעינה חדשה כדי לשאף את הפתרון.

ואז לייבש את המחטים במכסה המנוע אדים לילה. להכנת עובר מארח, חגירה ביצי עוף פוריות בכיוון אופקי באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולהשתמש מלקחים זוויתיים לעשות ניקוב בקוטר של יותר ממילימטר בתחתית הקצה השטוח של כל ביצה לאורך קו המשווה ביצה. הכנס מחט מד 18 מחובר מזרק 10 מיליליטר לתוך הדקירה כדי להסיר על חמישה מיליליטר של אלבומן.

ולהחיל סרט שקוף על החלק העליון של קליפת הביצה. ציון האזור המודבק לאורך החלק העליון של הביצה עם ממטרים זוויתיים ולהשתמש מספריים tenotomy מעוקל לחתוך חלון כ 2.5 ס"מ בחלק המודבק של הביצה. לבדוק ולביים את העובר על סמך הקריטריונים שנקבעו על ידי המבורגר והמילטון ולהשתמש מזרק מילימטר אחד מצויד מחט 32 מד להזריק כ 200 microliters של אחד עד חמישה דילול של הודו דיו HBSS מתחת לעובר.

לאחר מכן לאטום את הניקוב עם סרט שקוף ולהוסיף מיליליטר אחד של HBSS טיפה חכם על הדיסק העוברי לפני איטום הקליפה חלון עם סרט פרפין למיקום הביצה בחזרה לתוך החממה לחה. כאשר העוברים מגיעים להמבורגר והמילטון שלב 19, שוטפים את נימי הזכוכית מצופים הסיליקון במים מיונים ומאפשרים נימים להתייבש במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להעביר עובר מביצה אחת לתוך צלחת פטרי 100 על ידי 15 מילימטר המכיל טמפרטורת החדר סטרילי HBSS ולה מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו.

באמצעות מדפים, מספריים tenotomy ומיקרו מרית, לבודד את הלב העוברי כולו מן העובר ולבודד את האטריה מהלב. מניחים את הרקמה פרוזדרית בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של HBSS על קרח. כאשר כל רקמת התורם נאספה, גלולה את הרקמות על ידי צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה זוויתית קבועה.

לעיכול רקמת התורם, להשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של EDTA 05%trypsin מחומם מראש עבור דגירה 15 דקות בבלוק חום רועד ב 300 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, פיפטה פתרון העיכול מספר פעמים כדי לשבור את כל הרקמה הנותרת גלולה ליאזט הלב על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של פתרון נטרול טריפסין עבור צנטריפוגה אחרת ואחריו השעיה מחדש ב 400 microliters של פתרון צבע פלואורסצנטי אדום.

לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה עבור אחד עד שלושה שטיפות במיליליטר אחד של HBSS לכל לשטוף. ואז להשעות מחדש את התאים המסווים בחמש פעמים עשר לתאים הרביעיים לכל ריכוז microliter ב HBSS טרי. עבור הזרקת vivo של התאים התורמים, לטעון בחזרה את ההשעיה התא לתוך יבש, סיליקון שטופלו פיפטה נימי זכוכית כפי שהודגם ולהוות את פיפטה לתוך מנגנון microinjector לחץ.

מעבירים כל עובר מארח להזרקה מהאינקובטור הלח למחזיק ביצים תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו פלואורסצנטי. ולהשתמש במטליות דק סטריליות כדי לפתוח את קרום הויטליין. בצע חתך 5 עד 1 מילימטר ב pericardium ולמקם את microinjecter כך קצה מחט microinjection חודר רקמת היעד.

הגדר את microinjector להחיל פולסים בודדים של 5 שניות משך נע בין 100 ל 400 hectopascals בלחץ. ולהזריק את התאים בלחץ. זה קריטי כדי לאמת השתלת תא מוצלחת על ידי הדמיה אות פלואורסצנטי לפני כריתה מחדש של הביצה.

ניתן גם לצלם את העובר כדי לתעד הליך זה. כאשר כל התאים הוזרקו, לסגת מנגנון microinjector ולהסיר את הביצה מהמחזיק. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של HBSS חם טיפה חכם על העובר.

לאטום את הביצה עם סרט אריזה שקוף ולהחזיר את הביצה לחה החממה במשך 24 שעות לאחר ההשתלה. כאן, הלב ואת הרקמה שמסביב של לב עוברי מארח לאחר השתלת מיוציט פרוזדור התורם מוצג. בניסוי מייצג זה, התאים התורמים היו microinjected לתוך הפרופיקרדיום של עובר מארח של שלב דומה.

חתך אופטי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי גילה כי התאים החיוביים היחידים של סמן שריר הלב בתוך הפרופיקרדיום היו התאים החיוביים האדומים הפלורסנטיים המושתלים. יש לדאוג לא יתר על כן לתפעל את העובר המטופל כמו קרעים בלב וסקולטורה מקומית הנגרמת על ידי מחט ההזרקה יכול לגרום הכדאיות מופחתת. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מגוון של בדיקות במורד הזרם, כולל אימונוהיסטוכימיה, בהכלאה באתרו ומיון תאים.

סוכן הסיליקון הוא דליק מאוד ורעיל מאוד. זה תמיד צריך להיות מטופל עם טיפול וציוד מגן אישי נאות בתוך מכסה המנוע אדים.