Name: האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד שיטת הדמיה רב-פוטונית ברזולוציה גבוהה לתיעוד התנהגות תאי גידול במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית בעכברים. השיטה מאפשרת מעקב אחרי נדידה והתמיינות תאים ברמת תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לנקו דה Graaff ומרכז ההדמיה של הורכט לתמיכה בהדמיה ולאלן Wehrens ולהאנה ג'ונסון על הגהה ועריכה של כתב היד.

<ol><li>Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+cancer+genome+diagnostics+for+routine+clinical+use%3A+overcoming+the+roadblocks+to+personalized+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine.</a> Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).</li>
<li>van Malenstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+obtained+by+needle+biopsy+gives+additional+information+on+the+prognosis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).</li>
<li>Kretschmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+in-transit+metastases+after+sentinel+node+biopsy+in+patients+with+melanoma+%28Br+J+Surg+2004%3B+91%3A+1370-1371%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371).</a> British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+inflammation+inhibits+biopsy-mediated+changes+in+tumor+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior.</a> Scientific Reports. 7, 7529(2017).</li>
<li>Hobson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+induced+by+the+biopsy+of+mouse+mammary+tumors+promotes+the+development+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+Treatment%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis.</a> Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).</li>
<li>Weil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microtubes+convey+resistance+to+surgical+lesions+and+chemotherapy+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas.</a> Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).</li>
<li>Parsa, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+intracranial+dissemination+of+glioblastoma+multiforme+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults.</a> Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).</li>
<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31, 602-606 (2013).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4, 158ra145(2012).</li>
<li>Schreurs, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Multi-Parametric+Magnetic+Resonance+Imaging+of+Tumor+Response+to+Photodynamic+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy.</a> PLOS ONE. 11, e0165759(2016).</li>
<li>Nielsen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+tumor+neovascularization+in+a+transgenic+mouse+model+with+a+novel+64Cu-DOTA-knottin+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide.</a> Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+therapy+with+cytotoxic+mesenchymal+stromal+cells+optimized+by+bioluminescence+imaging+of+tumor+and+therapeutic+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response.</a> PLOS ONE. 7, e35148(2012).</li>
<li>Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendra2+photoswitching+through+the+Mammary+Imaging+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window.</a> Journal of Visualized Experiment. (28), e1278(2009).</li>
<li>Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoordmans%2C+HJ+%22Registration+and+analysis+of+in+vivo+multispectral+images+for+correction+of+motion+and+comparison+in+time%22">Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time</a>. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 106014(2011).</li>
<li>Kirkpatrick, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+resonant+scanning+multiphoton+microscopy%3A+An+emerging+technique+for+intravital+imaging+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment.</a> IntraVital. 1, (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מתארים שיטה ללמוד שינויים בהתנהגות תא הגידול ברמת תא בודד בתגובה ניתוחים פולשנית, כגון ביופסיה, במוחו של בעל חיים חי. השילוב של הדמיה מרובת פוטון האורך עם ההשתלה כירורגית של CIW כרונית מאפשר כימות של הגירה תא הגידול, פלישה, והתפשטות לפני ואחרי ביופסיה באותה חיה4. לעומת גישות אחרות המשמשות לניטור הגידול מרובת ימים, כגון הדמיה ביולומיל112, MRI10, או PET/CT11, שיטה זו ויזוב באופן ייחודי גידולים ברמת תא בודד, ובכך, מספק תובנה התנהגות תאית התקדמות הגידול הבסיסי.
כדי לבצע שיטה זו בהצלחה, יש לשלוט במספר פרוצדורות. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם השרשה CIW והחלפה. המורכבות הטכנולוגית של שלבים אלה מחייבת מיומנויות דיוק וכירורגי שניתן לרכוש באמצעות הדרכה קבועה. סיבוכים במהלך ניתוח CIW, כגון דימום אשר עשוי לכסות את משטח המוח, עשוי להוכיח מאתגר עבור הדמיה הבאים. חוסר של כלים סטריליים או סביבה, כמו גם את הכישלון לחלוטין חותם המוח, עלול לגרום זיהום על פני המוח (נוזל לבן מתחת coverslip), אשר יגרום הדמיה בעייתית ומאוד לסכן את התוצאה פרשנות. סוגיה נפוצה נוספת של פרוטוקול זה היא תנועת בעלי חיים במהלך הדמיה בזמן ההדמיה. בעוד שניתן לתקן כל משמרת xyz לאחר הניסוי, מומלץ לתקן את הקואורדינטות של כל תנוחה לפני כל נקודת זמן כדי למנוע אובדן של מידע. דפורמציה הרקמה היא בעיה נוספת נמצא בעת הדמיה על מיקרוסקופ הפוך. רקמת המוח סובלת מדחיסה כאשר העכבר ממוקם במצב פרקדן. בהתאם לדרגת הדפורמציה של רקמות, מעקב אחר תאי הגידול עלול להוביל לקוונפיקציה מוטעית של הזחה בתאים. כדי למנוע זאת, ניתן להשתמש בתוכנה לדפורמציה קשיחה וגמישה ב-14.
בעוד הליך זה מציע יישום רחב ללימוד שינויים בהתנהגות הגידול, יש לשקול מגבלות מסוימות. שיטה זו מאפשרת למדענים תמונה עד לעומק של 1.6 מ"מ (עם שימוש של מתנד פרמטרי אופטי); עם זאת, משמעות הדבר היא כי הדמיה מוגבלת אזורי קליפת המוח שטחיים15. כך, כמה גידולים במוח הממוקם במבנים במוח עמוק, כולל gliomas הפנימי מתפזר ממוקם באזור גזע המוח, לא ניתן ללמוד בסביבת המוח המקורית שלהם עם פרוטוקול זה. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא נפח הגידול שניתן לדימות. למרות שסריקת נפח הגידול הכולל רצוי כדי להשיג מידע מקסימאלי, לעתים קרובות, גודל הגידול ואת המהירות של תאים נודדים יכול להיות מגביל גורמים. עבור כל סוג של גידול, הזמן האופטימלי עבור הדמיה צריך להיחשב. אם מסגרת הזמן בין התמונות ארוכה מדי, ייתכן שיהיה קשה לעקוב אחר תאי הגידול. השימוש בסורק מהדהד יכול להקטין במידה רבה את זמן הסריקה, ומאפשר הדמיה של גידול גדול יותר16. לבסוף, ניתוח התמונה הידנית של פרוטוקול זה עשוי לגזול זמן רב, ולכן במקום זאת, ניתן להשתמש בתוכניות עבור מעקב אוטומטי תלת-ממדי. עם זאת, על תוצאת המעקב להיות תמיד מפוקחת באופן חזותי מאחר שאלגוריתמים למעקב אחר תאים אוטומטיים מיועדים לעתים נדירות לבצע העברה של תאי העניין בדיוק.
עיבודים קלים של הפרוטוקול המתואר כאן יכולים לאפשר מגוון רחב יותר של יישומים. במקום לבצע ביופסיות, התערבויות אחרות (כירורגי) ניתן ליישם, כגון כריתת הגידול חלקית או המסירה של וופלים כימותרפיה. התוספת של תרכובות באמצעות microtube מושתל בניתוח עשוי להיות משולב עם פרוטוקול זה כדי פרמקואוטיולוגית היעד מולקולות ספציפיות של עניין. אנו מצפים כי מודל זה יהיה שימושי במחקרים במטרה לנתח את ההשפעה של התערבות מסוימת על התנהגות תא הגידול. האפשרות לבצע פעולות חוזרות ונשנות באותה חיה לא רק מספקת נתונים מדויקים יותר על שינויים המתרחשים בגידול, אלא גם מפחית במידה ניכרת את מספר החיות הנסיוניות הדרושות לכל מחקר.

רמת טיפול עבור גידולים מוצקים ביותר כולל רקמת ביופסיה לאבחון, פרוגנוזה, וקביעת טיפול אישית1,2. הכולל, הליכים אלה נותנים תועלת קלינית, אבל הראיות האחרונות מצביע על כך ביופסיה ונהלים אחרים פולשנית יותר, כגון כריתת הגידול, יכול גם להשפיע לרעה על התקדמות הגידול3,4,5 , 6. בעוד הליכים אלה נשארים הכרחי טיפול בחולה והטבות שלהם להתגבר על ההשפעות השליליות שלהם, יש צורך להבין באופן מלא את המנגנונים מאחורי ההשפעות השליליות הללו על מנת למקסם את בטיחות החולים ואת ה השפעות חיוביות של הליכים אלה ולהפוך אותם אפילו יותר מועיל קלינית.
ביופסיה-מתווכת השפעות בלתי רצויות על התקדמות הגידול מופעלות על ידי שינויים מערכתית ושינוי הסביבה המיקרו של הגידול בתגובה לשיבוש רקמות4,5. לכן, יש ללמוד תהליך זה בבעלי חיים חיים. עם זאת, ההשלכות העדינות של אלה הליכים פולשנית אלה יכולים לעתים קרובות להיות מוסווה על ידי וריאציות גדולות בין אנשים. שיטות קונבנציונליות המבוססות על ניתוח הביטויים האימונוהיסטוכימיה או ההמרה עשויות להתעלם מהשפעות אלה או דורשות מספר גדול של בעלי חיים כדי לזהות אותם. יתר על כן, גישות אלה סטטי חסר את היכולת לזהות שינויים בהתנהגות תא הגידול כגון הגירה ופלישה, תהליכים דינמיים לתאם עם ממאירות הגידול. אלה תכונות תא הגידול הם בחשיבות מיוחדת עבור גידולים במוח אגרסיבי מאוד, כגון gliנובלסטומה (GBM), שם התפשטות המקומי של תאים סרטניים מגביל כריתת כירורגית ומקטין הישרדות החולה7. כדי להבין באופן מלא כיצד ביופסיות להשפיע על ההתנהגות של תאים GBM, גישה האורך המאפשר ויזואליזציה של תאים אלה בהקשר הפיזיולוגי של אורגניזמים חיים יש צורך.
הפיתוח האחרון של הדמיה ברזולוציה גבוהה intravital בשילוב עם מושתל בניתוח windows הדמיה כרונית מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות הדינמית של תאים סרטניים בעכברים חיים במשך ימים מרובים8,9. באמצעות גישה זו רבת עוצמה, אנו יכולים ללמוד כיצד תאים סרטניים ' מתרבים, נדידה, ושינויים התנהגותי התנהגות במשך מספר ימים בתגובה ביופסיה באותו עכבר. לעומת טכניקות אחרות המאפשרות ניטור מרובת ימים של גידולים בעכברים חיים, כגון הדמיה תהודה מגנטית (MRI)10, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)11, או הדמיה ביולומילאנטי12, זה גישה ייחודית מציעה את האפשרות של לימוד התנהגות תא הגידול ברמת תא בודד להתיר שינויים עדינים המתרחשים בתוך הגידול.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת כדי לבצע פציעה כמו ביופסיה ו-pre-ו פוסט ביופסיה האורך הדמיה במוח של עכברים נושאת הגידול. שיטה זו יכולה להיות מיושם כדי ללמוד התערבויות כירורגי אחרים, כגון כריתת הגידול חלקית או השרשה של וופלים כימותרפיה.

<table><tbody><tr><td>25 גרם x 16 מ"מ מחטים היפודרמיות</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10uL SYR W/O מחט</td><td>המילטון</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>ספוג ג'לטין נספג</td><td>פייזר</td><td>ג'לקצף</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים עגולים 6 מ"מ</td><td>VWR בינלאומי</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>Pattex Pattex</td><td>אולטרה ג'ל</td><td></td></tr><tr><td>שיניים צמנט</td><td>Vertex Dental</td><td>Vertex מקדחה לריפוי</td><td></td>עצמי</tr><tr><td></td><td>Dremel Dremel</td><td>3000 (מקדחה דנטלית עשויה להיות נוחה יותר) + 105 חותך</td><td></td>חריטה</tr><tr><td>פינצטה מעוקלת עדינה</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm (פנטניל ציטראט 0,315 מ"ג/מ"ל+ פלואניסון 10 מ"ג/מ"ל)</td><td></td></tr> <tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td>Midazolam Actavis 5mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>משחה אופטלמית</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td> <td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>שמן סיליקון</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>Stoelting</td><td>Lab סטריאוטקסי סטנדרטי, חולדה ועכבר</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו כירורגי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (0.3 מ"ג/מ"ל)</td> <td>BD Pharmaceuticals</td><td>283732</td><td></td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; מספריים קפיציים bingen</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>קסילוקאין (לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000) הרדמה מקומית</td><td>אסטרזנקה</td><td>קסילוקאין (לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000)</td><td></td></tr></tbody></table>

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

ביופסיות הם סטנדרטים של טיפול בסרטן ומועילים קלינית כפי שהם מאפשרים אבחנה מוצק הגידול, פרוגנוזה, וקביעת טיפול אישית. עם זאת, הפרה של ארכיטקטורת הגידול על ידי ביופסיה ופרוצדורות פולשני אחרים שויך השפעות בלתי רצויות על התקדמות הגידול, אשר צריך ללמוד בעומק כדי לשפר עוד יותר את התועלת הקלינית של הליכים אלה. גישות סטטיות קונבנציונאלי, אשר רק לספק תמונה של הגידול, מוגבלים ביכולתם לחשוף את ההשפעה של ביופסיה על התנהגות תא הגידול כגון הגירה, תהליך קשור היטב ממאירות הגידול. בפרט, הגירה תא הגידול הוא המפתח בגידולים במוח אגרסיבי מאוד, שבו הפצת הגידול המקומי עושה הריתת הגידול הכולל כמעט בלתי אפשרי. התפתחות הדמיה רב-פוטון וחלונות דימות כרוניים מאפשרים למדענים ללמוד את התהליך הדינמי הזה בחיות החיים לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה עבור הדמיה האורך ברזולוציה גבוהה של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי ביופסיה באותו בהמה חיה. גישה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של הליך זה על התנהגות תא הגידול (הגירה, פלישה, והתפשטות). יתר על כן, אנו דנים את היתרונות והמגבלות של טכניקה זו, כמו גם את היכולת של מתודולוגיה זו כדי ללמוד שינויים תא התנהגות הסרטן עבור התערבויות כירורגי אחרים, כולל הניתוח הגידול או ההשתלה של כימותרפיה ופלים.

כדי להעריך את ההשפעה של ביופסיה על התנהגות תא הגידול במוח, ביצעת את ההליך המתואר בפרוטוקול זה. Glioma – GL261 תאים — ביטוי חלבון פלורסנט גרעיני (H2B-Dendra2) הוזרק במוחו של C57BL/6 עכברים, ו CIW כרונית הושתל. הדמיה בזמן ההדמיה בוצעה על אותה החיה לפני ואחרי ביופסיה כמו הפגיעה בגידול (איור 1A, ב). הגירה של תאים סרטניים בודדים נקבע על ידי מעקב אחר נתיב ההגירה לאורך זמן במישורים שונים של מחסנית z(איור 1c) והתווה כאחוז של תאים נודדים טרום ביופסיה ( איור 1c). שיעור ההתפשטות של תא הגידול היה ככמת מבוסס על H2B-מתויג Dendra2 עיבוי על מיטוזיס (איור 1D) ו התווה כאחוז חלוקת התאים לפני ופוסט ביופסיה (איור 1d). השוונו את ההתפלגות של מהירות הגירה לפני ואחרי ביופסיה באותו גידול ומצא כי מספר תאים נודדים (מהירות &gt; 4 μm/h) גדל לאחר ההתערבות, עם ירידה משויכת במספר תאים איטיים/לא נודדים ( מהירות &lt; 4 μm/h) (איור 2a). בממוצע לכל גידול, הבחנו 1.75 (SD = 0.16)-להגדיל את העלייה באחוז של תאים נודדים כאשר ביופסיה כמו פציעה בוצעה, לעומת עכברים שליטה שלא היה ביופסיה (איור 2B). אנו פיקוח על התנהגות תא הגידול במשך שבוע נוסף ומצא כי, למרות האחוז של תאים סרטניים הנדידה בסופו של דבר ירד הן בשליטה ואת העכברים ביופסיה, העכברים ביופסיה עדיין הציגו קיבולת נדידה גבוהה יותר מאשר עכברים בקרה ( איור 2C). ניתוח של התנהגות שהתרבות של תא הגידול לאורך זמן הראה 1.52 (SD = 0.26)-מקפלים להגדיל את מספר האירועים mitotic על ביופסיה, ביחס לעכברים שליטה לא ביופסיה (איור 2D).
כדי לבדוק אם ההשפעות נצפתה של ביופסיה על תא הגידול שהתרבות התנהגות הנדידה היה חפץ עקב ניתוח החלפת CIW (נדרש לבצע פציעה כמו ביופסיה), אנו פיקוח על התנהגות תא הגידול בקבוצה של עכברים שעברו CIW תחליף ללא ביופסיה. בקבוצה זו, לא התבוננו כל אינדוקציה של הגירה או התפשטות של תאים סרטניים, המציין כי דחיפה בהפצה של תאים סרטניים ושיעורי הגירה הופעלות במיוחד על ידי פציעה כמו ביופסיה (איור 3 א, ב).
יציבה צילום-מרה של חלבון פלורסנט Dendra2 מאפשר ללמוד חדירת תאים הגידול במשך מספר ימים. עם חשיפה לאור אולטרה סגול/כחול, Dendra2 הוא החליף בלתי הפיך מירוק לאדום. באמצעות מאפיין זה, אזור מרובע של הגידול היה מואר ~ 200 Dendra2-ביטוי תאים סרטניים היו מסומנים תמונה לפני ביופסיה (איור 4). יום אחד לאחר הביופסיה, אנו מחדש את האזור החלפת תמונות ומדד את הנפח של תאים סרטניים שחדרו לתוך רקמת הגידול שמסביב. מצאנו כי האזור הסתננות היה 1.72 (SD = 0.41) פעמים גדול יותר בגידולים לאחר פציעה כמו ביופסיה לעומת גידולים שליטה לא ביופסית (איור 4). למרות גישה זו רק מספק מידע על התנהגות של תאים סרטניים בצובר, לא על רמת תא בודד, זה פחות זמן רב יותר מאשר הגישה הדמיה הזמן והוא יכול להיות שיטת הבחירה עבור שאלות מחקר התמקדו באופן בלעדי על . ללמוד התנהגות מונעת
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg"> איור 1: התקנה ניסויית עבור הדמיה האורך האורכי של אפקט הביופסיה על התנהגות תא הגידול. (א) דיאגרמה המציגה את עיצוב הטבעת והמחזיק המגנטי. (ב) ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. תאים סרטניים מוזרק לתוך המוח של עכברים ו CIW הוא הוקם. על פיתוח הגידול, הראשון (prebiopsy יופסיה) הזמן לפקיעה הדמיה מתבצעת. למחרת היום, הביופסיה והחלפת CIW מיושמים. היום לאחר הדמיה (ביופסיה), הפעם השנייה לשגות הדמיה מבוצעת. עבור השפעות ארוכות-טווח, ניתן לבצע הפעלות הדמיה עוקבות. (ג) תמונות להראות תמונות הנציג של סרט זמן פקיעה שבו GL261 H2B-Dendra2 תאים סרטניים אותרו. קווים אדומים מתארים מסלולים בודדים של תאי הגידול. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ד) נציג בתמונות זמן-פקיעה vivo הצגת תאים מפרידים GL261 H2B-Dendra2 גידולים. בשלבים שונים של מיטוזה מצוינים: prophase (P), prometaphase (Pm), מטא-שלב (M), אנאפא (א), ו-telophase ו-טלוה (T). סרגל קנה המידה = 50 μm. גרפים מציינים את אחוזי הנדידה (E) הנודדים (F) ומחלקים את התאים לפני וביופסיה. כל נקודה מציינת את אחוז התאים הנודדים בכל המיקומים הנמדדים בבעל חיים יחיד. הנתונים מוצגים כממוצע ± S.E.M. של שישה עכברים (* *P &lt; 0.01, לזווג t-test). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg"> איור 2: תוצאות הנציג מראה את ההשפעה של ביופסיה על הגירה תאים סרטניים ושיעורי התפשטות. (א) מגרשי מפל המראים את השינוי בהפצת מהירות התאים ביחס להגירה הבזאלית בעכברים בודדים. הנתונים מוצגים כממוצע ± S.E.M. של חמישה עכברים. (ב) מספר התאים הנודדים בשליטה (כחול) ו ביופסיה (אדום) בעלי חיים מנורמל למספר של תאים נודדים התערבות (n = 6 עכברים, * * *P &lt; 0.0001, הסטודנט של מבחן t). (ג) התנהגות תא הגידול הייתה מעקב במשך מספר ימים. מוצגים הם המספר המנורמל (יחסית להתערבות מראש) של תאים נודדים בעכברים בודדים לאורך זמן (n &gt; 4 עכברים לכל מצב, * * *P &lt; 0.0001, ANOVA דו-כיוון). (ד) המספר המנורמל של חלוקת תאים בשליטה (כחול) וביופסיה (אדום) בעלי חיים. לבעלי חיים נפרדים, ההתערבות בערכים היתה מנורמלת לערכים מראש (n = 5 עכברים, * *P &lt; 0.01, מבחן tשל הסטודנט). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg"> איור 3: החלפת CIW אין השפעה על התנהגות תא הגידול. הדמיה האורך האורכי מראה כי ההחלפה של CIW ללא ביופסיה אין השפעה על שיעורי הגירה והתפשטות. (א) הגידול במספר תאי נדידה עבור התנאים המצוינים. כל סמל מייצג את הממוצע של עכבר בודד, ו- n≥ 4 עכברים. (ב) הגידול במספר התאים התרבים עבור התנאים המצוינים. כל סמל מייצג את הממוצע של עכבר בודד (n≥ 4 עכברים, * *P &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001, ns = לא משמעותי, בכיוון אחד ANOVA עם בדיקה לאחר ניומן-keuls אד הוק). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg"> איור 4: דיאגרמה המציגה את ההתקנה הניסיונית ואת תוצאות הנציגים שהושגו עם Dendra2-החלפת תמונות. כדי לפקח על חדירת תאים סרטניים על ביופסיה, Dendra2-ביטוי תאים סרטניים הם צילום ממותג באזור מרובע על ידי תאורה UV/כחול אור והתמונה, 1 יום לפני ביופסיה. יום אחד לאחר הביופסיה, האזור החלפת התמונות מותאם מחדש ומחדש את התמונה. המוצג הם נציג Dendra2 תמונות של חדירת תאים סרטניים, תוקן באמצעות החיסור ערוץ. הקו הלבן המנוקד מייצג את אזור החדירה. סרגל קנה המידה = 50 μm. הגרף מראה את השטח המוגדל בצילום מוגבר לעכברים (אדום) ובקרה (כחול). כל נקודה מייצגת את הערך הממוצע של עכבר בודד (n≥ 5 עכברים, *P &lt; 0.05, מבחן tשל הסטודנט). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מתארים שיטה עבור ברזולוציה גבוהה בזמן הדמיה multiphoton של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית (למשל, ביופסיה) בתוך חיה חיה אותו. שיטה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של אלה הליכים כירורגי פולשנית על תאים סרטניים ' נדידה, פולשנית, והתנהגות מתרבים ברמת תא בודד.

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לחקור את ההשפעה של הליכים כירורגיים פולשניים המשמשים במרפאה על התנהגויות תאים סרטניים, כגון הגירה, פלישה והתפשטות. שיטה זו מאפשרת באופן ייחודי הדמיה של אותו גידול לפני ואחרי הליך פולשני, ומספקת תובנה שניתן לפספס בגישה לא אורך. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן בעכבר בוגר הרדמה, הרם את העכבר על מסגרת סטראוטקטית ואבטח את הראש עם מהדק אף ושני פסי אוזניים.השתמשו במנורת חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף, והחלת משחה על עיני החיה. באמצעות מספריים חדים, לגלח את הפרווה על הגולגולת מהעיניים לבסיס הגולגולת, ולהשתמש 70% אתנול כדי לעקר את העור החשוף. חותכים את העור בצורה מעגלית, ולהשתמש ספוגית כותנה כדי לגרד את periosteum חשוף.לטפל באזור הניתוח עם ירידה של 1% לידוקאין, ו 1:100, 000 ריכוז של אפינפרין במשך חמש דקות לפני הסרת הפתרון עודף עם ספוגית כותנה. השתמש בדבק cyanoacrylate כדי לדבוק בשולי העור לגולגולת, ולמקם את המסגרת הסטריאוטקית תחת מיקרוסקופ סטריאו תפקוד עם הגדלה 4x. לאחר מכן, קדחו בזהירות קוטר שטחי של חמישה מילימטרים, חריץ עגול מעל עצם קודקודית ימנית.ולהחיל טיפה של חיץ קליפת המוח על החריץ. השתמש במטחנים דקים כדי להרים את דש העצם כדי לדמיין את פני השטח של המוח, ולהשתמש מטלפסי נקודה מעוגלים, מחודדים, עדין מאוד כדי להסיר את מאטר דורה. במקרה של דימום, יש להשתמש בספוג ג'לטין נספג כדי להשיג דימום.להזרקת תאים סרטניים, לטעון כשלושה microliters של התאים לתוך מזרק גז חמישה מיקרוליטר הדוק מצויד במחט סגנון נקודה שתי. תקן את המחט על זרוע המניפולטור הסטריאוטקסית, והסר את מאגר קליפת המוח מהרקמות החשופות. מניחים את קצה המזרק באמצע הגולגולת ומכניסים את המחט בעומק של 0.5 מילימטר מפני השטח של הגולגולת.לאחר מכן, להוסיף טיפה של חיץ קליפת המוח craniotomy, ולהשתמש מזרק משאבת microsyringe כדי לספק את התאים בקצב של 250 עד 400 ננוליטר לדקה. כדי להכין את חלון הדמיה גולגולתית, להחליף את חיץ קליפת המוח עם טיפה של שמן סיליקון לאתר craniotomy, כדי למנוע בועות אוויר מתחת לחלון. לאטום את המוח החשוף עם כיסוי שישה מילימטר, ולהחיל דבק cyanoacrylate בין כיסוי הגולגולת.לאחר מכן השתמש פינצטה עדין כדי ללחוץ בעדינות את כיסוי נגד הגולגולת. בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה בתיבת הדמיה, והגדר את מטרת המים 25x למיקום z הנמוך ביותר. מוסיפים טיפת מים גדולה למטרה, ומעבירים את תיבת ההדמיה לתא האקלים הכהה של המיקרוסקופ ב-37 מעלות צלזיוס.הביאו את המטרה לחלון ההדמיה הגולגולתי עד שטיפת המים נוגעת בכיסוי. ובשימוש במצב epifluorescence, לבחון את הגידול דרך העין כדי להביא את התאים לפוקוס. כוונן את הלייזר לאורך הגל הנכון ובחר מצב חי.לאחר בחירת מספר עמדות עניין להדמיה, רשום את הקואורדינטות שלהם בתוכנה. הגדר ערימת z עבור כל עמדה כדי לרכוש את הנפח המקסימלי של תאים סרטניים מבלי להתפשר על רזולוציית תא הגידול, עם גודל הצעד בין התמונות מוגדר לשלושה מיקרומטרים. לאחר מכן, לרכוש תמונות של נפח הגידול בעמדות שונות כל 20 דקות במשך שעתיים, הוספת מים למטרה לפני כל רכישת תמונה.לאחר התמונה האחרונה נרכשת, להעביר את העכבר משטח חימום עם ניטור עד התאוששות מלאה. יום אחד לאחר סשן ההדמיה הראשון, אבטחו את העכבר הרדמה במסגרת הסטריאוטוקסית כפי שהוכח, ולהשתמש במטלית כותנה ספוגה באצטון כדי לנגב את קצות הכיסוי עד שהדבק מתרכך. החלק מחט 25 מד מתחת למכסה ולהשתמש מדפים נקודה דקה כדי להרים אותו, לחות את craniotomy עם חיץ קליפת המוח טרי.לנקב את הגידול לעומק של מילימטר אחד עם מחט 25 מד, לעצור כל דימום עם ספוג ג'לטין סטרילי, ולאטום את פני השטח של המוח עם שמן סיליקון טרי. ואז להדביק כיסוי חדש של שישה מילימטרים על הפצע. לניתוח תמונה, פתחו את קובץ LIF לשגות בזמן בתוכנת המיקרוסקופ ובחרו בכרטיסיה 'תהליך', 'כלי תהליך' ו'מיזוג'.בחרו בתמונה הראשונה של רצף הזמן ולחצו ראשונים. בחרו בתמונה השניה של רצף הזמן ולחצו על התמונה השניה. בתיבה מזג ממדים, בחר t עבור זמן ולאחר מכן לחץ על החל.קובץ חדש עם שתי נקודות זמן ייווצר. לאחר מעקב אחר כל סידרת איבוד זמן במשך שלוש ערימות z רצופות בנפרד, גרור את התיקיה המכילה את התמונות לשגות בזמן ל- ImageJ. בחר את הכרטיסיה תוספים, מעקב ו- MtrackJ.כדי לעקוב אחר כל תא בודד, בחר הוסף ולחץ על כל תא בכל נקודת זמן. לאחר מכן לחצו על 'מידה' ושמור את הקובץ כדי לחלץ את מידת הרצועות. הנדידה של תאים סרטניים בודדים יכולה להיקבע על ידי מעקב אחר נתיב הנדידה לאורך זמן במישורים xy שונים של מחסנית z ועלה כאחוז של תאים נודדים לפני ופוסט ביופסיה.ניתן לכמת את שיעור התפשטות תאי הגידול בהתבסס על עיבוי Dendra2 מתויג H2B על מיטוזה ועלה כאחוז מהתאים המפרידים לפני הביופסיה שלאחריה. השוואת התפלגות מהירות הנדידה לפני ואחרי הביופסיה באותו גידול, מגלה כי מספר התאים הנודדים עולה לאחר ההתערבות, עם ירידה קשורה במספר התאים האיטיים ללא מהגרים. בממוצע לכל גידול, עלייה של פי 1.75 באחוז התאים הנודדים נצפית כאשר מבוצעת פגיעה דמוית ביופסיה, בהשוואה לעכברים שאינם בעלי שליטה.למרות שאחוז תאי הגידול הנודדים יורד בסופו של דבר הן בעכברים בקרה והן בעכברים ביופסיים, עכברים ביופסיים עדיין מפגינים יכולת הגירה גבוהה יותר מאשר עכברי בקרה בסך הכל. התנהגות שגשוג תא הגידול גם מדגים עלייה של פי 1.52 במספר האירועים המיטוטיים על ביופסיה לאורך זמן, יחסית לעכברי בקרה שאינם עכברי בקרה. שימו לב, אין אינדוקציה של נדידת תאים סרטניים או התפשטות נצפתה לאחר החלפת חלון הדמיה גולגולתית ללא ביופסיה, המציין כי דחיפה התפשטות תאים סרטניים שיעורי ההגירה מופעלת במיוחד על ידי פגיעה דמוית ביופסיה.חשוב לעבוד בדיוק גבוה ובמיומנות כירורגית במהלך שלבי ההדמיה, ההשתלה וההחלפה של הגולגולת. ייתכן שיהיה צורך בפועל נרחב.

longitudinal-intravital-imaging-brain-tumor-cell-behavior-response-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בלוציפראז, שונה אדם xenografts גידול במוח ניתן לקבוע intracranially בעכברים athymic, עם ניטור הבאים של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור. בשילוב עם ניתוח הישרדות, ניטור פליטת אור הוא כלי מחקר הכרחי לצורך בדיקות טרום קליניים של טיפולים נשקלת לטיפול בגידולים במוח.

הקמת גידול תוך גולגולתי xenografts המוח עם ניתוח בדיעבד של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור

ההשתלה תוך גולגולתי של תאים לתוך GL261 C57BL / 6 עכברים מייצרת gliomas ממאיר לשחזר רבים מסימני ההיכר של multiforme glioblastoma האדם. השתמשנו GL261 התאים ביציבות להביע בלוציפראז כדי לאפשר לנו...

השרשה תוך גולגולתי עם 3D לאחר In vivo Bioluminescent הדמיה של gliomas Murine

אנו מתארים שיטה משולבת להשתלה המדויקת, stereotactic של תאי multiforme glioblastoma אדם לתוך המוח של עכברים בעירום וסידורי...

השרשה ותוך גולגולת Stereotactic<em&gt; בחי</em&gt; הדמית bioluminescent של xenografts גידול במערכת מודל עכבר של multiforme glioblastoma

סרטון זה מציג הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי במודל עכבר לגישה אופטית יציבה לאזורים שונים במוח.

השתלת חלון הדמיה גולגולתי במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת כיסויים מבוססי זכוכית לגישה אופטית יציבה לאזורים במוח מורין

בסרטון זה אנו מבצעים הדמיה תוך-חיונית של תאי סרטן שהוזרקו מראש במודל עכבר דרך חלון גולגולת מושתל. טכניקת הדמיה זו ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן מאפשרת לחקור התנהגות דינמית של תאים סרטניים בעכבר החי.

הדמיה תוך-חיונית מבוססת חלון גולגולת במודל עכבר: טכניקת הדמיה לחקר ההתנהגות של תאי סרטן שהוזרקו מראש במוח של מודל מורין

מקור: Ciraku, L., et. al. מודל פרוסת מוח ex vivo לחקר ומיקוד צמיחת גידול גרורתי במוח של סרטן השד. J. Vis. exp. (2021). סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי גידול המבטאים לוציפראז בפרוסת מוח של עכבר אורגנוטיפי. לוציפרין מתווסף למדיום, והצלחת ממוקמת בתוך החדר של מערכת ההדמיה in vivo. פרמטרים ללכידת תמונה מותאמים, וצורת הגידול וגודלו מוגדרים. לאחר מכן נרשמים האותות הביולוגיים הנפלטים מתאי הגידול.

הדמיית ביולומינסנציה להערכת צמיחת גידול בפרוסת מוח אורגנוטיפית של עכבר

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.

מיקרוסקופיה תוך-חיונית דו-פוטונית של גליובלסטומה במודל מורין

למד שיטת הדמיה רב-פוטונית ברזולוציה גבוהה לתיעוד התנהגות תאי גידול במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית בעכברים. השיטה מאפשרת מעקב אחרי נדידה והתמיינות תאים ברמת תא בודד.

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

גלה סרטונים נוספים