Name: ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: למד שיטה מהירה ורגישה לכימות פעילות אלקליין פוספטאז בביו-סרטים של S. aureus באמצעות צלחת 96 בארות. הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של תפקיד האנזים ביצירת ביו-סרטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ויליאם רייני הארפר המכללה, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו במתקן לערוך ניסויים אלה. אנו מודים גם היסוד מקגרו היל על תמיכתם הנדיבה.

1. הכנה בינונית
<ol><li>להכנת 1 ליטר של ציר סויה Tryptic (TSB): לתוך 1 L של מים מזוקקים, להוסיף 15 גרם של הלבלב תקציר של קזאין, 5 גר' papaic תקציר של ארוחה סויה, דור 3 של נתרן כלורי, 2.5 גר' דקסטרוז ו- 2.5 גר' dipotassium פוספט. לעקר לפני השימוש.</li>
	<li>עבור Tryptic סויה אגר (TSA), להוסיף 15 גרם של אגר 1 ליטר של TSB, החיטוי. אז תן לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. בשלב הבא, יוצקים ביחס של 20 מ"ל לכל צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).</li>
	<li>Biofilm תרבות בינוני: להוסיף 10 גרם של גלוקוז 1 ליטר של TSB בלוק. לחטא על-ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 µm.</li>
</ol>2. S. aureus ביופילמים בצלחת תרביות רקמה טוב 96
הערה: Biofilm S. aureus הוא תרבותי כפי שתואר לעיל6,21.
<ol><li>לחסן המושבה בודדים אחד של S. aureus מ TSA 10 מ"ל של TSB ולגדול בן לילה ב 37 º C.</li>
	<li>לדלל את התרבות לילה לתוך 10 מ"ל של TSB/גלוקוז (10 גרם/ליטר) ביחס של 1: 100 (v/v). מערבולת בעדינות כדי לערבב על ריכוז עקבית.</li>
	<li>להעביר 200 מ של תרבות מדולל לתוך סך של 18 וולס (יותר לקבוצות ניסיוני, כאלה שאינם biofilm פקד להציע יחסים ALP פעילות6) מ 96 אחד טוב בצלחת. להשתמש שלישיות עבור כל נקודה בזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות. ראה שלב 3.2.</li>
	<li>דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה biofilm היווצרות6,21.</li>
	<li>Decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.</li>
	<li>לשטוף כל טוב עם 1 x פתרון פוספט buffered (PBS, pH 7.4), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 15,000 x g ו decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.</li>
</ol>3. מדידה של ALP פעילות ב- S. aureus Biofilm
הערה: פעילות ALP נמדדה כפי שמתואר6,18.
<ol><li>להוסיף 75 מ של מצע ALP במאגר המורכב pNPP זמינים מסחרית כדי מכל קידוח מהשלב 2.6 ולהתחיל את הזמן הקלטה. לתעד כל נקודת זמן דולר.</li>
	<li>לאחר דגירה לזמן מגוונת: 0 min (בקרה), 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות, ו- 75 דקות בהתאמה, להוסיף µL 75 של NaOH M 5 כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>Centrifuge את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 15,000 x g.</li>
	<li>העברת µL 100 של תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה טוב 96 למדידה ערכי צבע מוחלטים.</li>
	<li>למדוד את ספיגת מכל טוב-405 ננומטר באמצעות 96 ובכן צלחת הקורא. לנצל את הזמן 0 דקות הצבע בארות כדי לשלוט על רעש רקע של 405 ננומטר.</li>
	<li>חזור על הניסוי כולו בשלושה לוחות טוב 96 בודדים.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ב- assay שלנו, השתמשנו pNPP כמו המצע אלפ. זהו הפתרון עובד המיועד אליסה, דילול לא נדרש. לאחר הידרוליזה על ידי ALP, מוצר צהוב מפתחת, ניתן למדוד-405 ננומטר. בסוף התגובה אנזימטיות, אנו בקצרה centrifuged את הצלחת היטב 96, להעביר את תגובת שיקוע צלחת טריים טוב 96 כדי למדוד את ספיגת באמצעות קורא צלחת. מצאנו כי צנטריפוגה נוסף השלב זה קריטי, כיוון שהיא מגבירה את מרקם של ספיגת-405 ננומטר, כנראה על ידי ביטול כל התאים מושעה אפשרי שייגרם במהלך התגובה אנזימטי.
עבור ביופילמים, אנו משתמשים μL 200 לדילול בטחונו...

אלקליין פוספטאז (ALP) מתבטא ubiquitously בשני תאי האיקריוטים prokaryotic ו-1. זה יכול לעודד את הידרוליזה של monophosphate של מולקולות שונות כגון נוקלאוטידים, חלבונים, אלקלואידים, אסטרים פוספט ו- anhydrides של חומצה זרחתית. בבני אדם, ALP האיקריוטים קיים ברקמות רבות, כולל הכבד, עצם, המעי ו השליה2. זה משחק תפקידים חשובים זירחון חלבונים, צמיחת תאים, אפופטוזיס, תהליכים בתאי גזע, כמו גם מינרליזציה השלד נורמלי. ALP האיקריוטים הוא גם מחוון מפתח נסיוב לנוכחות של מחלות עצם, כבד, ובאיברים אחרים רקמות/כאשר מוגבה3,4.
Prokaryotic ALP זוהתה במגוון של תאים חיידקיים, כולל e. coli5,6, S. aureus7 וכמה חיידקים שכיחים של כרס מעלי גרה קרקעות8. פעילות ALP חיידקי שימשה ביוסנסור זיהוי חומרי הדברה, מתכות כבדות9 ו זיהום בקטריאלי10. הביטוי המכונן של ALP שימש כדי לזהות Staphylococci11 וכדי להבדיל בסרישיה Enterobacter12. בהמשך הוא הציע כי ייצור ALP המכונן הוא מתואם עם פתוגניות staphylococci13. למרות ALP נחקרה הגדרות שונות3,4, עדיין מעט הוא דיווח על הפעילות שלה פונקציה בתרבויות biofilms.
ממבנה biofilm תועד חיים חיידקי מתפקדת באופן שונה לעומת שלו עמיתו של תא החיידק אל-אווירני עצמאי14. ב- S. aureus, היווצרות biofilm זוהתה במגוון תנאים קליניים וחשבונות עמידות לאנטיביוטיקה, דלקת כרונית15,16. דווח כי הרבה מולקולות להימצא במטריצה biofilm כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, אך המנגנון של ביופילמים אינו מובן במלואו14. כדי להבין את התפקיד של ALP ב ביופילמים, אנו תרבותי S. aureus biofilms ב 96 תרביות רקמה טוב צלחות, מדדו את הפעילות ALP באמצעות פארא-nitrophenylphosphate (pNPP).
כבר בשימוש נרחב כדי למדוד ALP פעילות6,17,18, והיא מצע מוכן לשימוש עבור ALP pNPP המולקולה. זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים המבוסס על ההמרה של פוספט פארא-nitrophenyl (pNPP) כדי פארא-nitrophenol וכתוצאה מכך מוצר צבעוניים-405 ננומטר. לעומת אחרים assay ALP קונבנציונליים, כגון agarose ג'ל אלקטרופורזה19, משקעים agglutinin (WGA) נבט חיטה, WGA-HPLC20, וזמינותו הזה הוא מאוד ספציפי, רגיש, קל, והם הכי חשוב, מאפשר גבוהה תפוקה.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>גלוז</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>כדורי NaOH</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>פרה-ניטרופנילפוספט (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>ריכוזים אופייניים של מצעים נוזליים pNPP, המשמשים לעתים קרובות במבחני חיסון מקושרים לאנזים (ELISA), נעים בין 10 ל-50 מ"מ. בדומה לרוב המצעים הנוזליים המוכנים לשימוש של pNPP כמו זה המשמש כאן, ריכוז ה-pNPP המדויק אינו נחשף בשל אופיו הקנייני.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Biotek</td><td>EL808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>אגר סויה טריפטי &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 גרם/ליטר TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי :&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; גרם/ליטר עיכול לבלב של קזאין............ 15.0 עיכול פפאי של קמח סויה......... 5.00<> נתרן כלורי.............................. 3.00< > דקסטרוז........................................ &nbsp; 2.50<> דיפוטסיום פוספט.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תרבית רקמות</td><td>באר BD</td><td>6902D09</td><td>תחתית בצורת U</td></tr></tbody></table>

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- s. aureus biofilm

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

אלקליין פוספטאז (ALP) הוא אנזים נפוצות הביע בתאים prokaryotic והן האיקריוטים. זה ה מזרז הידרוליזה של פוספט monoesters של מולקולות רבות ב- pH בסיסי והוא ממלא תפקיד חיוני בחילוף החומרים פוספט. בבני אדם, ALP האיקריוטים הוא אחד האותות אנזימטי שנמצאות בשימוש תכוף ביותר באבחון מחלות שונות, כגון לחסימת מרה תוך כבדית, רככת. ב- S. aureus, ALP מזוהה באופן בלעדי על קרום התא; זה מתבטא גם כטופס הפרשה גם כן. ובכל זאת, מעט מאוד ידוע על תפקודו של ביופילמים.
מטרתו של כתב יד זה היא לפתח וזמינותו מהיר ואמין למדידת פעילות ALP biofilm S. aureus שאינה דורשת בידוד חלבון. באמצעות פוספט p-nitrophenyl (pNPP) כמו מצע, מדדנו פעילות ALP biofilm S. aureus שהוקמה בשנת 96-ובכן תרביות רקמה צלחות. הפעילות מבוססת על היווצרות של המוצר מסיסים התגובה נמדד על ידי ספיגת 405 ננומטר. מהות השיטה צלחת 96 תרביות רקמה טוב תפוקה גבוהה מספק שיטה לשחזור והרגיש ALP פעילות מבחני. ניתן להאריך אותו הדבר הניסיונית להגדיר גם למדוד סמנים מולקולריים חוץ-תאית אחרים הקשורים ביופילמים.

איור 1 מציג תוצאה נציג של ALP פעילות מתרבויות biofilm של S. aureus 96 צלחות טוב תרביות רקמה. 75 μL של פתרון זמין מסחרית pNPP נוספה כל טוב, מודגרות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה לזמנים שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות, בהתאמה) μL 75 של 5 M NaOH נוספה כדי לעצור את התגובה. המוצר ואז נמדד קורא צלחת טוב 96-405 ננומטר. כל נקודת זמן חזר על עצמו בשלישיות של לוח אחד טוב 96 ולאחר הניסוי כולו חזר על עצמו ב- 3 לוחות טוב 96 בודדים.
...

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

פרוטוקול זה הציג שיטה קלה ואמינה למדידת פעילות פוספטזה אלקלים בתרבות הביופילם של S.aureus. זה יעזור לנו להבין את הפונקציה של ALP בהיווצרות ביופילם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תפוקה גבוהה.זה מאוד רגיש וקל לביצוע. הפגנת ההליך תהיה קווין דניקובסקי, סטודנט לשעבר ממג' הארפר. כדי להכין TSB, להוסיף תקציר הלבלב של קזין, עיכול פפאי של ארוחת סויה, נתרן כלורי, דקסטרוז, דיפוטאסיום פוספט לתוך מים מזוקקים.מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום ומכניסים אותו לתקלה אוטומטית כדי לעקר לפני השימוש. כדי להכין TSA, להוסיף אגר TSB ולשים אותו autoclave עבור עיקור. ואז לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי ביחס של 20 מיליליטר למנה. כדי להכין מדיום תרבות ביופילם, להוסיף גלוקוז TSB autoclaved כדי להשיג את הריכוז של 10 גרם לליטר. בעזרת ערכת סינון ואקום, מסננים את הפתרון באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.כדי לחסן, להשתמש בלולאת חיסון מעוקרת כדי לבחור מושבה בודדת אחת של Aureus Staph מצלחת פטרי ולמקם אותו בצינור התרבות מלא 10 מיליליטר של TSB. שים את הצינור באינקובטור לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עם micropipette, לצייר 100 microliters של תרבות הלילה ולהעביר אותו צינור תרבות מלא 10 מיליליטר של TSB עם גלוקוז עבור דילול יחס נפח 1:100.מערבולת בעדינות לערבב לריכוז עקבי. השתמש micropipette להעביר 200 microliters של תרבות מדוללת לתוך סך של 18 בארות מצלחת אחת 96 באר. דגירה צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עבור היווצרות ביופילם.עבור היווצרות biofilm הטוב ביותר של S.aureus, עדיף לבחור שטוח או עגול התחתון 96 צלחת היטב. לאחר מכן, להטות מעט את הצלחת כדי decant supernatant על ידי שאיפה מקצה כל באר. לשטוף כל באר עם 1X PBS.שים את הצלחת בצנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 8, 000 מהפכות לדקה ולפענח את העל טבעי על ידי שאיפה. הוסף 75 מיקרוליטרים של מצע ALP במאגר המורכב PNPP זמין מסחרית לכל באר ולהשתמש טיימר כדי להקליט כל נקודת זמן ב- triplicate. לאחר כל נקודת זמן דגירה, להוסיף 75 microliters של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לכל אחת משלוש בארות כדי לעצור את התגובה.צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 800 מהפכות לדקה. השתמש פיפטה להעביר 100 microliters של על טבעי לתוך צלחת באר 96 חדש למדידה קלורימטרית. השתמש בקורא 96 צלחות היטב כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר.השתמשו בארות נקודת הזמן של 30 דקות כדי לשלוט ברעשי רקע. חזור על הניסוי כולו בשלוש 96 צלחות באר. פרוטוקול זה מפתחת תדהמה מהירה ואמינה למדידת פעילות ALP בביופילם S.aureus שאינו דורש בידוד חלבונים.התוצאה הייצוגית של פעילות ALP מראה מגמה מוגברת של עד 75 דקות. לאחר 75 דקות, לא נצפתה עלייה בפעילות ALP. חשוב מאוד להקים תרבות ביופילם טובה וזה עלול לקחת לא מעט ניסויים כדי לשלוט.אתה יכול לאשר היווצרות ביופילם על ידי ביצוע בדיקת קריסטל סגול כפי שדווח בעבר על ידינו ואחרים או שאתה יכול מראש לטפל בצלחת עם פלזמה אנושית כדי להקל על היווצרות ביופילם. לאחר התפתחותו, אתה יכול לסנן מעכבי ALP פוטנציאליים שעלולים להפריע היווצרות biofilm. התוצאה תספק מידע חשוב לניהול ביופילם בתחום הרפואי.חמישה נתרן הידרוקסיד דיוח עלול להיות מסוכן במקרה של מגע. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול.

colorimetric-analysis-alkaline-phosphatase-activity-s-aureus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Biofilms נוצר על משטחי השן הם מורכבים מאוד חשוף מתמיד אתגרים סביבתיים מולד אקסוגניים, אשר לווסת את הארכיטקטורה שלהם, פיזיולוגיה transcriptome. פיתחנו ארגז הכלים לבחון את הרכב, ארגון מבניים ביטוי גנים של biofilms דרך הפה, אשר ניתן להתאים בתחומים אחרים של מחקר biofilm.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

מקור: Vidilaseris, K., et al. הקרנה למעכבי פירופוספאטאז הקשורים לממברנה של Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית לסינון מעכבים של פירופוספאטאז הקשור לממברנה חיידקית (mPPase) על ידי כימות שחרור אורתופוספט. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות המעכבות mPPase מ-Thermotoga maritima, מטרה פוטנציאלית לתרופה אנטי-מיקרוביאלית.

סינון מעכבים של פירופוסטאז הקשור לממברנה חיידקית באמצעות בדיקה קולורימטרית 

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לחקר אינטראקציה בין נויטרופילים לביופילם. החיידקים הפתוגניים המשובצים בביופילם ובנויטרופילים המבודדים סומנו באמצעות תוויות פלואורסצנטיות, והתגובה החיסונית של הנויטרופילים והתחמקות התגובה החיסונית על ידי החיידקים הוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת מבחנה לחקר האינטראקציה בין נויטרופילים וביופילם

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

רוב הזיהומים החיידקיים מייצרים ביופילם. מתוקף הסביבה שלהם, חיידקים הקשורים לביופילם הם לעתים קרובות עמידים לתרופות פנוטיפיות. מולקולות אנטיבקטריאליות חדשות שהורגות חיידקים בביופילמים נמצאות אפוא בעדיפות גבוהה. אנו מקימים בדיקה לסינון מהיר של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות היעילות בהדברת ביופילמים.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה מיקרוביאלית של 5-aminolevulinic חומצה בתיווך טיפול פוטודינמי (ALA-PDT) על ממבנה biofilm Staphylococcus aureus . פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד לטיפול biofilms חיידקי עם PDT בעתיד.

מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למדידת איזולבוגלנדינים ברקמות על ידי אימונופלואורסנציה באמצעות נוגדן ScFv D11 מצומד אלקליין פוספטאז. מודלים של יתר לחץ דם הן בעכברים והן בבני אדם משמשים כדי להסביר את ההליכים שלב אחר שלב ואת עקרונות היסוד הקשורים למדידת איזולבוגלנדין בדגימות רקמות.

זיהוי ישיר של איזולבוגלנדינים ברקמות באמצעות חלבון היתוך D11 scFv-אלקליין פוספטאז ואימונופלואורסנציה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של אינטראקציות נויטרופיל-ביופילם. ביופילמים של Staphylococcus aureus מבוססים במבחנה ודוגרים עם נויטרופילים אנושיים שמקורם בדם היקפי. תגובת פרץ החמצון של נויטרופילים ניתנת לכימות, ולוקליזציה של הנויטרופילים בתוך הביופילם נקבעת על ידי מיקרוסקופיה.

בדיקות סטנדרטיות במבחנה כדי להמחיש ולכמת אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין סטפילוקוקוס אאורוס ביופילמים

למד שיטה מהירה ורגישה לכימות פעילות אלקליין פוספטאז בביו-סרטים של S. aureus באמצעות צלחת 96 בארות. הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של תפקיד האנזים ביצירת ביו-סרטים.

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

גלה סרטונים נוספים