ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm
12 באפריל 2019
כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן
פרוטוקול זה הציג שיטה קלה ואמינה למדידת פעילות פוספטזה אלקלים בתרבות הביופילם של S.aureus. זה יעזור לנו להבין את הפונקציה של ALP בהיווצרות ביופילם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תפוקה גבוהה.
זה מאוד רגיש וקל לביצוע. הפגנת ההליך תהיה קווין דניקובסקי, סטודנט לשעבר ממג' הארפר. כדי להכין TSB, להוסיף תקציר הלבלב של קזין, עיכול פפאי של ארוחת סויה, נתרן כלורי, דקסטרוז, דיפוטאסיום פוספט לתוך מים מזוקקים.
מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום ומכניסים אותו לתקלה אוטומטית כדי לעקר לפני השימוש. כדי להכין TSA, להוסיף אגר TSB ולשים אותו autoclave עבור עיקור. ואז לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי ביחס של 20 מיליליטר למנה. כדי להכין מדיום תרבות ביופילם, להוסיף גלוקוז TSB autoclaved כדי להשיג את הריכוז של 10 גרם לליטר. בעזרת ערכת סינון ואקום, מסננים את הפתרון באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.
כדי לחסן, להשתמש בלולאת חיסון מעוקרת כדי לבחור מושבה בודדת אחת של Aureus Staph מצלחת פטרי ולמקם אותו בצינור התרבות מלא 10 מיליליטר של TSB. שים את הצינור באינקובטור לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עם micropipette, לצייר 100 microliters של תרבות הלילה ולהעביר אותו צינור תרבות מלא 10 מיליליטר של TSB עם גלוקוז עבור דילול יחס נפח 1:100.
מערבולת בעדינות לערבב לריכוז עקבי. השתמש micropipette להעביר 200 microliters של תרבות מדוללת לתוך סך של 18 בארות מצלחת אחת 96 באר. דגירה צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עבור היווצרות ביופילם.
עבור היווצרות biofilm הטוב ביותר של S.aureus, עדיף לבחור שטוח או עגול התחתון 96 צלחת היטב. לאחר מכן, להטות מעט את הצלחת כדי decant supernatant על ידי שאיפה מקצה כל באר. לשטוף כל באר עם 1X PBS.
שים את הצלחת בצנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 8, 000 מהפכות לדקה ולפענח את העל טבעי על ידי שאיפה. הוסף 75 מיקרוליטרים של מצע ALP במאגר המורכב PNPP זמין מסחרית לכל באר ולהשתמש טיימר כדי להקליט כל נקודת זמן ב- triplicate. לאחר כל נקודת זמן דגירה, להוסיף 75 microliters של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לכל אחת משלוש בארות כדי לעצור את התגובה.
צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 800 מהפכות לדקה. השתמש פיפטה להעביר 100 microliters של על טבעי לתוך צלחת באר 96 חדש למדידה קלורימטרית. השתמש בקורא 96 צלחות היטב כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר.
השתמשו בארות נקודת הזמן של 30 דקות כדי לשלוט ברעשי רקע. חזור על הניסוי כולו בשלוש 96 צלחות באר. פרוטוקול זה מפתחת תדהמה מהירה ואמינה למדידת פעילות ALP בביופילם S.aureus שאינו דורש בידוד חלבונים.
התוצאה הייצוגית של פעילות ALP מראה מגמה מוגברת של עד 75 דקות. לאחר 75 דקות, לא נצפתה עלייה בפעילות ALP. חשוב מאוד להקים תרבות ביופילם טובה וזה עלול לקחת לא מעט ניסויים כדי לשלוט.
אתה יכול לאשר היווצרות ביופילם על ידי ביצוע בדיקת קריסטל סגול כפי שדווח בעבר על ידינו ואחרים או שאתה יכול מראש לטפל בצלחת עם פלזמה אנושית כדי להקל על היווצרות ביופילם. לאחר התפתחותו, אתה יכול לסנן מעכבי ALP פוטנציאליים שעלולים להפריע היווצרות biofilm. התוצאה תספק מידע חשוב לניהול ביופילם בתחום הרפואי.
חמישה נתרן הידרוקסיד דיוח עלול להיות מסוכן במקרה של מגע. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה לכימות פעילות של alkaline phosphatase בתרביות biofilm של S. aureus, תוך שימוש בלוח תרביות רקמה בעל 96 בארות. השיטה תוכננה להיות רגישה וקלה לביצוע, ובכך היא מקלה על המחקר בנוגע לתפקידה של alkaline phosphatase בהיווצרות biofilm.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- חקר ביופילמים
- אנזימולוגיה
רקע
- פוספטאז אלקלי (ALP) הוא אנזים המעורב בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת תפקידו של ALP ביצירת ביופילם היא קריטית למחקרים מיקרוביולוגיים.
- שיטות בעלות תפוקה גבוהה חיוניות לאיסוף נתונים יעיל במחקר.
- ביופילמים הם קהילות מורכבות של מיקרואורגניזמים שיכולות להשפיע על הבריאות ועל התעשייה.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה מהימנה למדידת פעילות ALP בביופילמים.
- להעמיק את ההבנה לגבי תפקידו של ALP בהיווצרות ביופילמים.
- לספק פרוטוקול שניתן לאמץ בקלות על ידי חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת TSB באמצעות עיכול לבלב של קזאין, עיכול פפאין של קמח סויה, נתרן כלוריד, דקסטרוז ודיפוטסיום פוספט.
- שימוש בלוח תרבית רקמה בעל 96 בארות לניתוח בסביליות גבוהה.
- מדידת פעילות של alkaline phosphatase בתרביות ביופילם של S. aureus.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי קווין דניקובסקי, סטודנט לשעבר מהמכללה להארפר (Harper College).
תוצאות עיקריות
- השיטה מכמתת בהצלחה את פעילות ה-ALP בתרבויות ביופילם.
- רגישות גבוהה של הטכניקה מאפשרת מדידות מדויקות.
- הפרוטוקול פשוט וניתן ליישום קל במעבדות שונות.
- תובנות שנרכשו ממחקר זה עשויות להנחות מחקרי ביופילם עתידיים.
מסקנות
- השיטה המבוססת יעילה לחקר ALP בביופלמים.
- מחקר זה תורם להבנת הדינמיקה של ביופלמים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לבחון היבטים אחרים של ביולוגיה של ביופלמים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ובעל תפוקה גבוהה של פעילות פוספטאז השמיים (alkaline phosphatase) בביופילם של S. aureus ללא בידוד חלבונים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות אנטימיקרוביאליות. על ידי אספקת קריאה רגישה וניתנת לשחזור של פעילות אנזימטית חוץ-תאית, היא מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותיות טיפוליות הקשורות לביופילם. התאימות של הבדיקה לפורמט של פלטות בעלות 96 בארות מאפשרת שילוב חלק במערכי סריקה לזיהוי מועמדים תרופתיים (leads) ולבניית ביטחון חיזוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההיפותזה הטיפולית לפיה פוספטאז שמי (alkaline phosphatase) תורם להיווצרות ולהישרדות של ביופילם.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרה באמצעות מדידה כמותית של פעילות אנזימטית במערכות ביופילם שלמות.
- ערך חזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור בין מודולציה של ALP לבין פנוטיפים של עיכוב ביופילם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת פורמט סטנדרטי בעוצמה גבוהה להערכת השפעות של תרכובות על סממנים אנזימטיים חוץ-תאיים.
- פלט כמותי: יצירת מדידות המבוססות על בליעה באורך גל של 405 nm המאפשרות ניתוח תגובה למספר (dose-response) ואישור פגיעות (hit confirmation).
- מדרגיות: שימוש בפורמט של פלטת 96 בארות לתמיכה בסינון בעוצמה בינונית של ספריות מעכבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין פעילות ALP לבין ביופילם של S. aureus, גורם virulent מרכזי בזיהומים כרוניים ובזיהומים הקשורים להשתלות מכשירים.
- המשכיות תרגומית: מספק קריאה המותאמת לסמן ביולוגי (biomarker), המגשרת בין שלב הגילוי לבדיקות יעילות פרה-קליניות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריונים של קבלת החלטות (go/no-go) בהתבסס על מעורבות המטרה והשפעה פנוטיפית במודלים של ביופילם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומאפשרת תיקוף של מטרה כדי לסייע בזיהוי מובילים ובהערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות אנטי-ביופילם.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מדידת ALP כתוצר תפקודי של מטבוליזם של ביופילם.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור ומתאימות לסריקת ספריות תרכובות בלוחות מיקרוטיטר.
- אנליטיקה: מספק מדידות קינטיות ומדידות של נקודת סיום המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאי טיפול לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם פיתוח סממנים ביולוגיים על ידי קישור פעילות אנזימטית להיווצרות ביופילם ולהתערבות טיפולית פוטנציאלית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לחקר אנזימים חוץ-תאיים בביופילמים מיקרוביאליים במספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב תפקידו של ALP בביופילם.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, רגישות ושחזוריות באמצעות קריאה קולורימטרית פשוטה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לסריקה מהירה של מודולטורים של ALP עם קשרים פנוטיפיים ברורים לביופילם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור מודולציה של המטרה ליעילות אנטי-ביופילמית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית במיקרוביולוגיה לצורך תרבית ביופילם סטרילית וטיפול ב-S. aureus.
- תלוי בגישה לקורא לוחיות של 96 בארות המסוגל למדוד בליע (absorbance) באורך גל של 405 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי היווצרות הביופילם בין בארות ולוחיות לצורך השוואות מהימנות.
- כולל שיקולי אופטימיזציה כאשר מרחיבים את הבדיקה למינים חיידקיים אחרים או למסמנים חוץ-תאיים.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך לשלוט בבליעת הרקע ולהבטיח השבתה (quenching) נכונה של התגובה באמצעות NaOH.
