Name: בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: למד מחקר תגובות כלי דם מוחיים באמצעות הזרקת ATP מקומית ומיקרוסקופיית שני פוטונים תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימים וחקירת פעילות נוירוגלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן לוננבק, קרן נובו-נורדיסק, המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הרפואה ומלגת קרן נורDEA למרכז להזדקנות בריאה.

כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הלאומית הדנית לפי ההנחיות שנקבעו באמנת המועצה האירופית להגנת בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות. היו בהתאם להנחיות הגעה. זהו נוהל מסוף עם העכברים להיות מורדמים לפני התאוששות הרדמה.
1. הכנה טרום כירורגי
<ol><li>נקו את שולחן הניתוחים ואת כל האזור שמסביב עם 70% אתנול. לנקות ולייבש ביסודיות את כלי הניתוח לפני הניתוח.</li>
	<li>הNG2DsRed עכבר (Tg (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; שניהם מינים; 4-8 חודשים בן) על ידי הזרקת הצפק של קטמין + xylazine (60 mg/ק"ג + 10 מ"ג/ק"ג) הומס מים מעוקר, pH 7.4. ניהול מינונים משלימים של קטמין (30 מ"ג/ק"ג) כל 25 דקות עד השלמת ההליך הכירורגי. בדוק הזנב ואת הרפלקסים צביטה באופן קבוע כדי לוודא את עומק ההרדמה.</li>
	<li>הכנס מלוחים תת-עורי בארבעה מיקומים שונים בגב העכבר עבור נפח כולל של 1 mL כדי למנוע התייבשות במהלך הניסוי. כדי להגן על העיניים מפני ייבוש, להחיל סיכה העין. לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° צ' באמצעות בדיקה טמפרטורה רקטלית ושמיכה חימום.</li>
</ol>2. הליך כירורגי
<ol><li>פיום קנה
	<ol>
<li>הניחו את העכבר על גבו. הכנס 0.04 mL של 0.5% לידוקאין תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות. לעשות חתך 10 מ"מ ארוך מעל עצם החזה (נובריום). הפרד את בלוטות הלסת התחתונה ואת השרירים הסטרתירואיד, ואז לחשוף את קנה הנשימה.</li>
		<li>מבצע הקנה הנשימה בין שתי טבעות קנה הנשימה עם מספריים. הכנס צינור מתכת קטן עם אורך של 16.2 מ"מ קוטר של 1 מ"מ לתוך קנה הנשימה. חבר את הצינור למכונת ההנשמה והקפינוגרף כדי לפקח על הקצההשני (איור 1א).</li>
	</ol></li>
	<li>צנתר החדרת
	<ol>
<li>הכנס 0.5% לידוקאין (0.04 mL) תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות.</li>
		<li>שימוש בעזרת מלקחיים דקים. מפריד בעדינות את העורק מהווריד הפסיקו את זרימת הדם במעלה הזרם בעזרת מהדק מיקרוכלי-דם. מחבר את זרימת הדם במורד הזרם עם תפר ניילון 10-0 ליגגאת שני כלי הדם.</li>
		<li>השתמש במספריים לניתוח מיקרו כדי ליצור חתך קטן בעורק ובווריד. הכנס קטטרים פלסטיק לתוך כלי הדם. לאבטח את הקטטרים על ידי הידוק התפרים (8-0 או 10-0 התפרים ניילון תלויים בגודל הכלי) מבלי להתפשר על קטטר לומן. הסר את המלחציים מיקרוכלי דם וסגור את העור.</li>
		<li>מוניטור לחץ דם דרך קטטר העורקים. רמות מדידה של גזים בדם בדגימות דם עורקי (50 μL) לפני ואחרי כל ניסוי (ערכים נורמליים: pO2, 90-120 Mmhg; pco2, 35-40 mmhg; pH, 7.25-7.45) באמצעות מנתח גז דם. השתמש בצנתר הווריד לעירוי. של פלואורואסעין והרדמה</li>
	</ol></li>
	<li>פתיחת גולגולת
	<ol>
<li>לגלח את הפרווה מהראש של העכבר בין האוזניים. הכנס 0.04 mL של 0.5% לידוקאין תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות.</li>
		<li>לנגב את הגולגולת באמצעות 10% ברזל כלוריד פתרון כדי להסיר את קרום המוח. לשטוף את הגולגולת ביסודיות עם תמיסת מלח. הדבק בר מתכת ראש לגולגולת עם דבק ציאנואקרילי וactivator (איור 1א). הערה: בר המתכת בראש הוא 75 מ"מ ורוחבו 13.5 מ"מ, עם חור עגול בקוטר 5 מ"מ במרכז.</li>
		<li>קדוח בפתיחת גולגולת בקוטר 4 מ"מ, ממורכזת ב-0.5 מ"מ ושלושה מ"מ מימין לברגמה מעל קליפת החבית החושית הנכונה. הסירו את השכבה. בעזרת כלי קיבול משובח</li>
		<li>כסו את קליפת המוח החשופה עם 0.75% agarose ג'ל, מומס בנוזל מלאכותי שדרתי (aCSF; pH = 7.4) ומקורר ל 35 ° c. כיסוי 80-90% של פתיחת הגולגולת עם שמיכות זכוכית בזווית של 10-15 ° לראש מתכת בר (איור 1B) המאפשר החדרת ומיקום של זכוכית מיקרו-פיפטה.</li>
		<li>כדי למזער את המוח, הדבק את שתי הפינות של שמיכות הזכוכית על הראש מתכת בר עם דבק ציאנואקרילט ו activator. החילו את הactivator בקפידה כדי למנוע ממנו לעלות על המוח החשוף. לשטוף את שמיכות זכוכית מודבק ביסודיות עם תמיסת מלח לאחר מכן.</li>
	</ol></li>
	<li>לבצע הוספה של הבדיקה גירוי משטח הקצקר. הוספת קבוצה של אלקטרודות דו קוטבית מותאמות אישית (8 מ"מ אורך ועובי 0.25 מ"מ) percutaneously לתוך הצד השמאלי של הפנים כדי לעורר את התשתיות הרמוס של הממברנה העצבית הפרעה לפתיחת הגולגולת. הציבו את הקתודה בקרבת המלון, והכניסו את האנדה לשרירי המסטיקטרי7. בצע את הגירוי עם מחזק חשמלי בעוצמה של 1.5 mA עבור 1 ms ברכבות של 20 ב 2 Hz.</li>
	<li>עם השלמת הניתוח, לנהל את המנת של 0.05 mL fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, משקל מולקולרי [MW] 50,000) לתוך וריד הירך כדי לתייג את פלזמה בדם. הפסק את הקטמין והעבר את ההרדמה לעירוי מתמשך של α-כלוראלז (17% w/v, ריכוז סופי) מעורבב עם FITC-dextran (2% w/v, ריכוז סופי) ב 0.02 mL/10 g/h. המתן כחצי שעה לייצוב החדש מצב הרדמה. הערה: הן FITC-dextran ו-α-כchloralose מומס 0.9% תמיסת מלח.</li>
</ol>3. הפעלת שני הפוטונים הראשונה
<ol><li>העבר את העכבר לשלב של מיקרוסקופ דו-פוטון מסחרי (טבלת חומרים). תחת שני חלבון פלורסנט אדום (rfp, איור 1ג) וחלבון פלורסנט ירוק (gfp, איור 1ג) מצבי התאורה של אפינפרין-פלורסנט, צלם תמונה של קליפת המוח החשופה במטרה 5x. השתמש בתמונה RFP כ-' map ' להוספת מיקרו-פיפטה מזכוכית בהפעלה הבאה. הערה: מפת ה-GFP משמשת להבחנה בין הורידים/העורקים מעורקי העורקים/העורק.</li>
	<li>לבצע הדמיה שני-פוטון באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטון ו 25x 1.0 מספריים הצמצם (NA) מטרה טבילה המים עם מנוע piezo. הגדר את אורך הגל ל900 ננומטר. חפשו בקליפת המוח ועקבו אחר כל arteriole חודר ומצאו את הענפים האופקיים (1 מסדר נימים).</li>
	<li>התמונה חודר העורקי העורקיםהראשון שלהם הסדר בתוך מנוחה ובמהלך גירוי משטח החליבה. ראה את הפרמטרים המפורטים להדמיה בסעיף 5.</li>
	<li>סמן מיקומים בסדר 1 נימים הזמנה עם > 5% בין במהלך גירוי משטחהחלקה על rfp ' מפת ' (איור 1ג). מיקומים עם < 5% והסנה נחשבים להיות מחוץ לאזור קליפת החבית הויקר. הערה: אם נעשה שימוש בעכברים מסוג פראי במקום בעכברים NG2DsRed בניסוי, תמונת ה-GFP משמשת כ-' map ' במקום זאת.</li>
</ol>4. החדרת זכוכית מיקרו-פיפטה
<ol><li>להכין זכוכית מיקרו-פיפטות לעשן בעזרת מיכל פולר (שולחן חומרים). מיקרו-פיפטות זכוכית יש התנגדות של 3-3.5 MΩ ואורך להתחדד של 4.5-5 מ"מ. טען פיפטה עם תערובת של ATP 1 מ"מ ו 10 μM אלקסה 594 על מנת להמחיש את טיפ הפיפטה תחת המנורה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ שני הפוטונים.</li>
	<li>הר זכוכית מיקרו-פיפטה על מחזיק מהדק טלאי ולחבר אותו משאבת האוויר. הפעילו את המשאבה. שמחזיקה לחץ על 0 psi</li>
	<li>בעזרת התאורה הפלואורסצנטית האדום, התמקד בעצת הפיפטה עם המטרה 5x. מניחים את הזכוכית מיקרו פיפטה לתוך aCSF מעל הצמח. להתאים את הלחץ החזקת של משאבת האוויר כדי 0.2 psi. ענן אדום קטן ניתן לצפות הוצאת מתוך הטיפ של פיפטה ב aCSF. זה כדי למנוע סתימת. בזמן החדרת הצנרת</li>
	<li>בחר באחד מהמיקומים המסומנים ב-RFP ' map ' כיעד. הזז את קצה הפיפטה אל המישור האופקי של קצה הזכוכית המכסה עם מרחק של 30 מטרים, בערך מצביע לעבר היעד במישור x-y.</li>
	<li>הורידו בזהירות את קצה הפיפטה בציר z מתחת למכסה הזכוכית. ואז להתחיל לקדם את הצנרת זכוכית לכיוון היעד עד ~ 500 יקרומטר מעל פני השטח המוח. מעבר מיקוד לעתים קרובות בין הקצה זכוכית המכסה, את קצה הפיפטה ואת משטח המוח, וודא שיש מספיק שטח פנוי להזזת הפיפטה.</li>
	<li>. העבר את המטרה ל -25 x הסנטר מחדש את קצה הפיפטה והעבר את קצה הפיפטה לכיוון היעד במפת ה-RFP. השאר את קצה הפיפטה בשכבה האגפית.</li>
	<li>כאשר טיפ הפיפטה הוא ~ 100 יקרומטר מעל פני המוח, החלף את מצב ההדמיה במיקרוסקופ שני-פוטון. . תתמקד במיקום מטרה לנשיפה רשום את הקואורדינטות x, y (x0, y0) והעומק שלה מתחת למשטח (z0). חשב את הקואורדינטות של נקודת ההכנסה על פני המוח (xi, yi) כדלקמן: xi = x0 + z0 /tan θ yi = y0 כאשר θ היא הזווית בין מחזיק הפיפטה לבין המישור האופקי.</li>
	<li>הצב את קצה הצינורות לנקודות הציון (xi, yi) על פני המוח. הכנס את הפיפטה בעדינות ובאיטיות עד שיגיע (x0, y0, z0). אם כלי קיבול נמצא בדרכו של נתיב הכנסה, משיכת הפיפטה וחישוב מחדש של קואורדינטות הכנסה ונתיב אחרים; או הפוך את לוחית הבמה במקצת (כפי שמצוין באיור 1א).</li>
	<li>להגדיר את המשאבה החזקת לחץ 0 psi ולחץ הפליטה ב 10-15 psi. פאף ATP עבור 200-400 ms במיקום היעד במהלך הדמיה של שני פוטונים. כוונן את הלחץ והמשך של העשן עבור כל פיפטה ולאורך זמן כפי שהוסבר בסעיף הדיונים.</li>
</ol>5. היפרסטאק two-פוטון הדמיה
<ol><li>לבצע ניסויים באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ ו 25 x 1.0 NA מטרה טבילה מים עם מנוע piezo. הגדר את אורך הגל ל900 ננומטר. לסנן את האור הנפלט כדי לאסוף אור אדום מ DsRed (טריולוציטים)/טטרמתיד isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) מכתים דם פלזמה ואור ירוק מ FITC-dextran (דם פלזמה)/gcamp6 (GFP, סידן אסטרוציטוטי).</li>
	<li>הפקת מחסנית z ברזולוציה גבוהה במיקום הריבית המכילה arteriole חודר, 1 מסדר קפילר, הזמנה 2 קפילר ואולי תאי פלורסנט השכנה (למשל, קרום הלב, אסטרוציטים). קבע את נפח x * y * z של הדמיה hyperstack על ידי כלילת מבנה תלת-ממד של כלי הדם ככל האפשר. הגובה הכולל של כל מחסנית עשוי להשתנות מ30-50 יקרומטר, בעוד המטוס x-y בערך מכסה שטח של 60 יקרומטר x 40 יקרומטר.</li>
	<li>הגדר את מחסנית התמונה בתוכנת הדימות כדי להיות מורכבת 8-10 מטוסים עם מרחק בין המישור של 4-5 μm. המטרה piezo-מנוע עוצרת בכל רמה על ציר z כדי לרכוש את התמונה של כל מטוס. קצב הדגימה הוא 1 למחסנית ורזולוציית פיקסל במישור x-y הוא 0.2-0.3 מטרים (איור 2א). הקלטה אחת כוללת בדרך כלל 10 ערימות תמונה טרום העלים ו 150 לאחר התמונה ערימות.</li>
</ol>6. עיבוד נתונים
<ol><li>עבד נתונים באמצעות תוכנה אנליטית שנעשתה בהתאמה אישית. משטח כל מחסנית תמונה לתמונה אחת באמצעות הקרנת עוצמה מירבית (איור 2ב'). צייר אזור מלבני של עניין (ROI) עם רוחב של 3 יקרומטר ניצב על פני כלי העניין (איור 2ג).</li>
	<li>כדי למזער הפרעות מפני צללים של כדוריות הדם האדומות ומתנודות קלות של קליפת המוח, הממוצע ROI מלבני על ידי הקרנת אותו לשורה אחת, אשר לאחר מכן מייצג את הפרופיל הממוצע של מקטע הספינה. עשה זאת עבור כל תמונה בעלת עוצמה מירבית.</li>
	<li>התווה את קווי הפרופיל כתמונה דו-ממדית עם ציר ה-x המייצג תמונות בעוצמה מירבית בסדר כרונולוגי (איור 2D, הלוח העליון). השתמש באלגוריתם מתאר פעיל (פילוח Chan-vese) כדי למצוא את הקצוות של כלי הקיבול8,9 (המצוין באמצעות עקומות אדומות). איור 2 D, הלוח העליון).</li>
	<li>חישוב מסלול הזמן של שינויי הקוטר כהפרש בין קצות כלי הדם (מרחק אנכי בין העקומות האדומות העליונות והתחתונות באיור 2D, הפאנל התחתון). לנרמל שינויים בקוטר בסיסית מראש קוטר ועקומות העלילה של שינוי קוטר לאורך זמן. עשה זאת עבור כל ROI (איור 2E).</li>
	<li>משרעת תגובת הכלי מוגדרת כשרעת השיא הגבוהה/הנמוכה ביותר לאחר הנושפת. השהיית התגובה מוגדרת כהשהיה של משרעת חצי מקסימום (איור 2G). באופן ידני לעקוב אחר מבנה כלי הדם השלד על ידי הצבת צמתים לאורך כלי (איור 2F) ומדידת המרחק הגיאוגרפי בין כל ROI לבין arteriole חודר. חישוב מהירות CVR על-ידי חלוקת המרחקים באמצעות הפרשי השהיה.</li>
</ol>7. ויראלי הזרקה
<ol><li>על מנת לחקור במקביל תגובות astrocytic סידן, להזריק נפח של 0.6 μL ויראלי וקטורי (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) לתוך הקליפה הסוחושית של NG2DsRed עכברים, בעקבות ההליך הרגיל של הזרקה סטריאוטקטיקה ויראלית . בסדר, עשר</li>
	<li>לאחר שלושה שבועות, אסטרוציטים בקליפת המגע של העכבר לבטא את אינדיקטור סידן מקודד גנטית, GCaMP6f. בצע את ההליך הכירורגי הנ ל 2-פוטון הדמיה עבור עכברים. כדי להבדיל בין אסטרוציטים לבין כלי לומינה, tritc-dextran במקום fitc-dextran משמש כדי להכתים את הספינה ומינה אדום.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li>
<li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li>
<li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li>
<li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787(2014).</li>
<li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2%2B+Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li>
<li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726(2018).</li>
<li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+%28Scape%29+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אתגר אחד עבור לימודי כלי דם הוא המדידה המדויקת של קטרים הספינה. השיטה שאנו מתארים כאן השתמשו מטרה piezo ממונע להפוך מהיר וחוזר הדמיה היפרסטאק על ידי שני פוטון מיקרוסקופ. ראשית, שיטה זו מאפשרת בדיקות חוזרות של הarteriole חודר, 1 לסדר ו-2 נימים הזמנה ללא אובדן של מיקוד והובילו לגילוי של לאט ביצע תגובות כלי הדם נימים ב vivo. שנית, בשילוב עם טכניקת הזרקה וקטורית ויראלי, היא מאפשרת לנו לחקור תגובות הסידן astrocytic בשלושה ממדים, אשר הכרחי למחקרים של בקרת זרימת הדם.
שיטה זו אינ...

למוח יש שיעור צריכת אנרגיה גבוהה. כ-20% מהחמצן ו -25% מהגלוקוז הנצרך על ידי גוף האדם מוקדשים לתפקוד מוחי, בעוד המוח תופס רק 2% ממסת הגוף הכוללת. אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי זרימת הדם ברשת מורכבת של כלי קיבול. פעילות מוחית מקומית וזרימת דם מוחית (cbf) הם מכבש בהתאם למאפיינים הפונקציונליים של נוירונים, אסטרוציטים, קרום הלב, תאים שריר חלק (smcs) ותאי האנדותל (ecs)1. לאחרונה, ההוראות הראשונות של נימים מסתעפת מפני חדירה בתוך העורקים הופיעו כ-"נקודה חמה"2, מראה התקנה פעילה של זרימת דם נימי. תגובה איטית של כלי הדם (CVR) התגלתה ב נקודה חמה זו בקליפת המגע של העכבר במהלך גירוי הויקר והפליטה המקומית (לעשן) של ATP עם מיקרו פיפטה מזכוכית3.
למרות בvivo הדמיה של שני פוטון לייזר סריקה מיקרוסקופ פלורסנט כבר בשימוש נרחב ללמוד תגובות נוירונימי בקליפת מוחין, רוב המחקרים שנמדדו בכלי הדם קטרים וחקר הרגולציה שלהם ב מישור x-y דו-ממדי (2D). האתגרים הם: ראשית, כלי דם מוחין והאסטרוציטים החובק שלהם, קרום הלב ו SMCs לבנות ענפים בשלושה ממדים (3D). לכן חשוב ללמוד את האינטראקציות שלהם ב-3D. שנית, אפילו כמות קטנה של סחיפה בפוקוס ישפיע על המדידה המדויקת של שני קטרים ואותות פלורסנט סלולריים. לבסוף, CVRs הם מהירים ומרחיקי לכת בשלושה מימדים. סריקת נפח תלת-ממד היא אופטימלית לזיהוי CVRs וחשיפת המנגנונים שלהם. אנו הטמיעה מטרה piezo מנוע במיקרוסקופ שני פוטון ללמוד קליפת המגע של העכבר בvivo, המאפשר מדידות קוטר מדויק על ידי התחזיות אינטנסיביות מקסימלית של התמונות שהתקבלו.
זכוכית מיקרו-פיפטות לעתים קרובות נעשה שימוש במחקרים במוח vivo, למשל, כדי לטעון בצובר צבעים אורגניים4, שיא eegs5 ועבור תיקון לסדר6. עם זאת, נותרו מגבלות. בדרך כלל, הקצה של מיקרו פיפטה זכוכית הוא imprecisely ממוקם, או מיקרו פיפטה לא משמש התערבויות מקומיות. כאן, יש לנו אופטימיזציה ההליך של החדרת מיקרו פיפטה והוצאה מקומית.
יתר על כן, השילוב של 3D two-פוטון מיקרוסקופ ו מקודד גנטית מחוונים פלורסנט מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור צימוד וסקולרית בטווח תלת-ממד. במחקר זה, ניצלנו את זה והזריקו וקטורים ויראליות נושאת מחווני סידן מהונדסים גנטית מסוימת לתוך קליפת המגע של העכבר. האסטרוציטים כמו גם קטרים של כלי היו התמונה בו על ידי שילוב סמנים פלורסנט שונים.
באופן כללי, אנו מציגים שיטה ממוטבת של הוצאה מקומית (לעשן) על ידי זכוכית מיקרו פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימי. בנוסף, השיטה שלנו מספקת כלי הרומן ובמקביל לחקור פרופילי 3d של Ca2 + תגובות אסטרוציטים ו בקוטר כלי דם תגובות.

<table><tbody><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא&ndash; Aldrich</td><td>A6138</td><td>החל על קליפת המוח החשופה להגנה</td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-10438</td><td>תרכובת ניפוח כתמים לצבע פלורסנט אדום</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>מרחיב כלי דם ומכווץ כלי דם, תרכובת נפיחה</td></tr><tr><td>דבק ומפעיל ציאנואקרילט</td> דבקי <td>לוקטיט</td><td>ודבק SF7452</td><td>לחתיכת מתכת ועין זכוכית כיסוי</td></tr><tr><td> חומר סיכה</td><td>ניטרלי Ophtha, Ophtha A/S, דנמרק</td><td></td><td>שמור על עיני העכבר לחות</td></tr><tr><td>FITC-dextan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>צבע סרום דם, צבע פלואורסצנטי ירוק</td></tr><tr><td>NG2Dsעכברים אדומים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>8241</td><td>עכברים טרנסגניים אלה מבטאים וריאנט חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) בשליטת מקדם העכבר NG2 (Cspg4)</td></tr><tr><td>pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>52924-AAV5</td><td>וקטורים ויראליים ספציפיים לאסטרוציטים הנושאים אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52194</td><td>צבע סרום דם, צבע פלואורסצנטי אדום</td></tr><tr><td><חזק>רשימת ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת אוויר</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td>תן לחץ אוויר לנשיפה פיפטה</td></tr><tr><td>מנתח גז דם</td><td>רדיומטר</td><td>ABL 700</td><td>למדוד את רמות הגזים בדם&nbsp;</td></tr><tr><td>מוניטור לחץ דם</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>BP-1</td><td>מוניטור לחץ דם מהיר</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורת גוף</td><td>CWE</td><td>דגם TC-1000</td><td>שמור על טמפרטורת גוף העכבר בטווח הפיזיולוגי</td></tr><tr><td>קפנוגרף</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>סוג 340</td><td>עקוב אחר ה-CO2 הנשיפה מהעכבר</td></tr><tr><td>ממריץ חשמלי</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISO-flex</td><td>החל גירוי כרית שפם</td></tr><tr><td>מאוורר מכני</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>D-79232</td><td>אוורור מכני של העכבר בטווח פיזיולוגי</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>Femtonics Ltd</td><td>Femto3D-RC</td><td></td></tr><tr><td>רשימת מכשירים כירורגיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה אנטומית&nbsp;</td><td>Lawton</td><td>09-0007</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה זוויתית ומאוזנת</td><td>S& T AG</td><td>00595 FRAS-18 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>לוטון</td><td>05-1450</td><td></td></tr><tr><td>מהדק מיקרו כלי דם</td><td>S& צנתרי כלי דם T AG</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>עכבר</td><td>Verutech</td><td>100828</td><td></td></tr></tbody></table>

בvivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה atp מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי רשת מורכבת של כלי קיבול. עם זאת, התקנה של זרימת דם מוחית (CBF) הוא מובן לחלוטין, במיוחד ברמת נימי. מיקרוסקופ שני פוטון הוא כלי רב עוצמה הנפוץ לחקר CBF והרגולציה שלה. כיום, שדה זה מוגבל על ידי העדר vivo שני פוטון במחקרים מיקרוסקופ בדיקה (1) התגובות CBF בשלושה מימדים, (2) ביצע תגובות כלי דם, ו (3) התערבויות מקומיות בתוך הרשת כלי הדם. כאן, אנו מתארים 3D בשיטה vivo באמצעות שני-פוטון מיקרוסקופ למחקר שנערכו תגובות כלי דם הרוויח על ידי הוצאה מקומית של ATP עם מיקרו פיפטה זכוכית. השיטה שלנו משתמשת hyperstack מהיר וחוזר הדמיה שני-פוטון מתן מדידות בקוטר מדויק על ידי הקרנת עוצמה מקסימלית של התמונות שהתקבלו. יתר על כן, אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור תגובות astrocytic סידן 3D. אנו דנים גם את היתרונות והמגבלות של החדרת מיקרו-פיפטה זכוכית, שני פוטון hyperstack הדמיה.

לאחר הניתוח הושלם, עכברים הועברו למיקרוסקופ שני פוטון (איור 1א). מיקרו פיפטה זכוכית המכילה 1 מ"מ ATP הוכנס בסמיכות לכלי הדם של היעד במיקום היעד (איור 1B).
ביצעו היפרסטאק הדמיה תוך מתן מציצה של 1 מ ל ATP (איור 2a, וידאו משלים 1). כל מחסנית תמונה ששוטחו לתמונה אחת באמצעות הקרנת עוצמה מירבית (איור 2ב</st...

אנו מציגים הליך הוצאה מקומית אופטימיזציה באמצעות זכוכית מיקרו-פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack שיטה הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויים בקוטר נימי וחקירה של התקנה שלה בשלושה ממדים.

בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

פרוטוקול זה נועד לחקור את התגובות כלי הדם שנערכו לאט נימים מוחיים עורר על ידי פליטה מקומית של ATP. היתרון של טכניקה זו היא לדמות פעילויות סינפטיות מקומיות על ידי פליטת פיפטה מקומית ולשמור על הכלי זעום בפוקוס על ידי מיקרוסקופיה דו-פוטונית תלת מימדית. שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר נוירומה מוחית ופעילות גליה במנוחה ובגירוי בשלושה ממדים. הדגמת ההליך תהיה מייקל L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה צדדי חדש להסתכלות של microcirculation מוצג. זה נחשב מתאים תצפית ארוכת טווח, ועל בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological או המולקולרית.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

במאמר זה, אנו מציגים שיטה לניתוח microvessels גידול in vivo באמצעות videomicroscopy הקרינה משופרת ניגודיות דינמי. שני פרמטרים כמותיים נרכשו: צפיפות תפקודית נימים המשקפת את כלי הדם של הגידול, וזליגת מדד המשקפת את הדליפות של קיר אנדותל.

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים.  מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

למד מחקר תגובות כלי דם מוחיים באמצעות הזרקת ATP מקומית ומיקרוסקופיית שני פוטונים תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימים וחקירת פעילות נוירוגלית.

בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה

גלה סרטונים נוספים