Name: צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למדו כיצד קרינה מייננת משפיעה על גיוס תאי גידול באמצעות אורגנואידים מבלוטות החלב של עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין תאי גידול לתאי חיסון והבנת מנגנוני הישנות סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר לורה ל. ברוסארט עבור מתן GFP ו-dTomato התווית RAW 264.7 מקרופאגים. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.
1. הכנת עכברים ורכישת תאים (מותאם מ-נגוין-Ngoc et al.11)
<ol><li>להקריב את העכברים Nu/Nu (8-10 שבועות בן) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צווארי. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.</li>
	<li>לכרות בלוטות החלב הבטן והאינרינאלה מעכברים באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים. הסר בלוטות הלימפה לפני ההסרה. שטפו בתמיסת מלח מעוקר באגירה בגודל 1 x (PBS) (איור 1X).</li>
	<li>מניחים אותו 15 מ ל צינורות עם 10 מ ל של דולבקה שונה מדיה נשר/תערובת מזינים F12 (Dמאמ/F12) עבור הובלה. ניתן להשאיר דגימות בין לילה ב -4 ° c או בעיבוד מיידי. . המשיכו לאכול</li>
	<li>הקרינים דגימות ב 20 Gy באמצעות מקור צסיום (איור 1B).</li>
	<li>45 דקות לאחר ההקרנה, המקום בלוטות החלב בלוח 35 מ"מ תא סטרילי והומה עם אזמלים (איור 1C, D). האוהב עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיע וחתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר כ 1 מ"מ2 באזור.</li>
	<li>העבר לפתרון הקולגן בתוך צינור הצנטריפוגה 50 mL. הפתרון מורכב 2 מ"ג/mL הקולגן (ראה טבלה של חומרים), 2 מ"ג/ml טריפסין, 5% v/v סרום בקר העוברי (fbs), 5 Μg/ml אינסולין, ו 50 Μg/ml GENTAMICIN ב Dmem/F12 מדיה. השתמש ב-10 מ"ל הפתרון הקולגן לכל עכבר.</li>
	<li>מניחים באמבט מים ב 37 ° c, vortexing כל 10 דקות עבור 30-60 דקות. העיכול מושלם כאשר התמיסה הקולגן מעונן (איור 1E, F).</li>
	<li>לסובב את הפתרון מתעכל ב 450 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שלוש שכבות יובחנו. הסופרנטאנט מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מימית, והתחתית היא גלולה. הגלולה יופיע אדום כפי שהוא תערובת של תאים אפיתל, בודדים סטרומה תאים, וכדוריות הדם האדומות (איור 1G).</li>
	<li>העבר את כל הפיפטות, עצות הפיפטה וצינורות הצנטריפוגה עם התמיסה של סרום השור (BSA) לפני המגע. הפתרון BSA מורכב 2.5 w/v% BSA בתוך מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לציפוי מראש, פשוט להוסיף ולאחר מכן להסיר פתרון BSA לתוך החלק הפנימי של הצנרת וצינורות. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, למרות שהוא אמור להיות מסונן לפני כל ניסוי.</li>
	<li>להתאוששות נוספת, להעביר את הסופרנטאנט לצינור BSA טרי מצופה שפופרת 15 mL. פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר שכבת שומן. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. ולאחר מכן, מותיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי להימנע מלבשל את הגלולה הסלולרית.</li>
	<li>מנקז את השכבה הימית. מהצינור עם הגלולה המקורית</li>
	<li>הוסף 10 מ ל של DMEM/F12 לצינור עם הגלולה המקורית להעביר את הצינור השני. פיפטה במרץ כדי לשלב ולהשעות את שתי החבילות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. משלחים את הסופרנטאנט ומוסיפים 4 מ ג/F12 לצינור.</li>
	<li>להוסיף 40 μL של deoxyribonuclease (DNase) אל ההשעיה בעדינות לנער ביד עבור 2-5 דקות ב RT. DNase פתרון מורכב 4 U/mL DNase ב DNASE/F12.</li>
	<li>הוסף 6 מ ל של Dמאמ/F12 ו פיפטה ביסודיות. צנטריפוגה את הצינור ב 450 x g עבור 10 דקות ב RT.</li>
	<li>. מפני שהוא מסמן את ה0.5 השהה מחדש ב-10 מ ל של Dמאמ/F12 ופיפטה ביסודיות.</li>
	<li>דופק 450 x g ולעצור 4 s לאחר שהגיע במהירות זו.</li>
	<li>חזור על הצעדים 1.16-1.17 עוד שלוש פעמים כדי לטהר את האורגנואידים באמצעות בידול צנטריפוגלי. הגלולה צריך עכשיו להיות צבע מחוץ ללבן המורכב של רק אורגנואידים אפיתל (איור 1H). הערה: אורגנואידים ניתן גם לסנן באמצעות רשת סטרילית 40 יקרומטר מסננים. לאחר שלב 1.16, מדיה פיפטה המכיל אורגנואידים דרך מסנן לתוך שפופרת צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף עם 5 כדי 10 מ ל של Dמאמ/F12 מדיה. הפוך את המסנן מעל שפופרת צנטריפוגה חדשה 50 mL. העבר 10 מ ל של DMEM דיה/F12 דרך, הולך בדרך הפוכה לשטוף כל רטינטאט. הרטינטאט צריך להיות מורכב מאורגנואידים, והפילטרט צריך להיות מורכב בעיקר של תאים סטרומה, אשר ניתן להיפטר או לשמור במידת הצורך.</li>
</ol>2. קביעת צפיפות וציפוי מאורגנואידים
<ol><li>להשעות את הגלולה ב 10 מ ל/F12. פיפטה ביסודיות ליצירת פתרון הומוגנית.</li>
	<li>העבר 50 μL ל 30 מ"מ צלחת פטרי, ולהציג תחת מיקרוסקופ הניגודיות שלב ב 20x. תספור את מספר האורגנואידים. עם מונה מספרים הערה: הנה טיפים פיפטה שימשו בעקביות עם קוטר מינימלי של 457 μm, וזה 5-10 פעמים קוטר של האורגנואידים כי הם הנזרע. להעברת כרכים של 2 מ ל או יותר (למשל, שלבים 1.16 ו-2.1), יש להשתמש בפיפטות נסיולוגיים עם קצה קוטר של 1,500 μm.</li>
	<li>חישוב צפיפות האורגאיד באמצעות המשוואה הבאה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg"> הצפיפות הרצויה היא 1,000 אורגנואידים/mL כדי לפשט דילול נוסף. אם הצפיפות נמוכה מדי, צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ומדי התקשורת. הוסף מדיה הדרושים כדי להגיע ל-1,000 אורגנואידים/mL, ופיפטה ביסודיות ליצירת תערובת הומוגנית.<ol>
<li>כדי לגדל אורגנואידים במטריצה חלבון, אורגנואידים הזרעים בריכוז של 1 אורגאיד/L בסוג קולגן 1 מדולל 87% או בקרום המרתף שחולצו מ אנגלברth-הולם-סרקומה של העכבר. , בזמן שעבדתי עם דגימות. המשיכו לאכול</li>
		<li>כדי להקפיא אורגנואידים, העבר את העוצמה הרצויה לשפופרת צנטריפוגה נפרדת. ספין למטה ב 450 x g עבור 5 דקות. התקשורת ולאחר מכן להוסיף את אותו כמות של 90% fbs/10% dmso. , להשעות את האורגנואידים. ואז להיכנס לקריוצינורות העברה ל-80 ° c ולאחר מכן לחנקן נוזלי בתוך שבוע אחד.</li>
		<li>להפשיר, להתחמם באמבט מים ב37 מעלות צלזיוס לדקה אחת. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן הקפאת מדיה הקפאה. לשטוף עם DPBS סטרילי, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב. . ולהוסיף מדיה ארגונית</li>
	</ol>
</li>
	<li>פיפטה 50 μL (50 אורגנואידים) לתוך כל באר של לוחית הדבקה נמוכה (איור 1I).</li>
	<li>הוסף 150 μL של מדיה ארגונית כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל 200 μL. אורגנואיד מדיה מורכב 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% אינסולין-הועבר-סלניום (שלה) ב-Dמאמ/F12 מדיה.</li>
	<li>כל יומיים מחליפים את המדיה בקפידה. הערה: לוחיות הדבקה נמוכות אינן מטופלות בתרבות הרקמה; לכן, ניתן להתנתק בקלות בתאים. מנושף את התקשורת באיטיות על-ידי הטיית הצלחת והחדרת הקצה של הפיפטה בקצה של כל באר. השאירו כמות קטנה של מדיה בתחתית הבאר. הוסף באיטיות מדיה חדשה כדי להימנע מהחלת כוחות הטיה לא נחוצים לאורגנואידים.</li>
</ol>3. Co-culturing עם מקרופאגים
<ol><li>שמור על GFP או dTomato-מקרופאגים RAW 264.7 במדיה DTOMATO בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. Seed 1 x 104, 5 x 104, או 1 x 105 תאים/mL לתוך מדיה ארגונית.</li>
	<li>השתמש בניגוד לשלב החי של התאים והדמיה פלואורסצנט לניטור הסתננות מקרופאג לאורך זמן.</li>
</ol>4. כתמים מאימונולואורנציה של אורגנואידים
הערה: הארגון יכול להיות מוכתם בבארות הדבקה נמוכות או שניתן להעבירו לשקפים קאמריים. כדי להעביר, הפיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהאורגנואידים התנתק מלוחות. העברה לשקופיות קאמרית ו-דגירה עבור 4-8 h כדי לאפשר לאורגנואידים לדבוק משטח הצלחת.
<ol><li>הסר את המדיום האורגאידית מבארות על-ידי הסרת האספירין בזהירות. לתקן דגימות עם 10% המאגר ניטרלי באגירה עבור 15 דקות ב RT.</li>
	<li>שטוף 3 x 5 דקות ב-1x PBS. במקרה הצורך, ניתן לאחסן דגימות קבועות ב-4 ° צ' למשך שבוע עבור כתמים נוספים.</li>
	<li>החדירות עם 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-טטרמתיבוטיל) פניאיל-פוליאתילן גליקול 5 דקות. הערה: כדי להכתים את F-actin, מדגמים מודורים עם phalloidin מדולל 1:1000 ו 1.67 ננומטר ביבנזימיד לצבוע גרעינית 1% PBS/BSA עבור 1 h ב RT. . אז, המשך לשלב 4.8</li>
	<li>ברימיוז עם 0.5 PBS. דגימות יכולות להיות מאוחסנות בתמונות 4 העתק ותמונות מוחיסורמיות. מנגנונים שתורמים CTC rlock עם סרום עז 5% רגיל ב 0.1% PBS/פוליאתילן גליקול ביתן monolaurate (PBST) עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות עם PBS.</li>
	<li>דגירה עם אנטי ציטוקרטין 14 מדולל 1:1000, E-קדהרין מדולל 1:200, או הדוקה החלבון הצומת 1 מדולל 1:100 ב 1% NGS ב PBST עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות ב PBST.</li>
	<li>דגירה עם עז נגד ארנב משני מדולל 1:200 עם 1% NGS/PBST עבור 1 h ב RT. לכסות עם נייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור.</li>
	<li>שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. השתמש בצבע הגרעיני (ראה טבלת חומרים) כדי להכתים גרעינים.</li>
	<li>שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. , אם אתה משתמש במגלשה. הר עם שמיכות החנות עטופה בנייר כסף ב -4 ° c עד שבועיים.</li>
</ol>

<ol><li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Surgery%22%5BJournal%5D)">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li>
<li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li>
<li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li>
<li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+of+matrix+metalloproteinases%2C+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).</li>
<li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li>
<li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Morphogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li>
<li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li>
<li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li>
<li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li>
<li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5%2Bcells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li>
<li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li>
<li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28United+Kingdom%29%22%5BJournal%5D)">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li>
<li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li>
<li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).</li>
<li>Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from:
 <a target="_blank" href="http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract">http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract</a> (1989).</li>
<li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+Adipocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+M1%2FM2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בפרוטוקול זה פיתחנו שיטה לצמיחה ואפיון של מארגני הפטמות הקרינה (איור 1). מינון הקרנה של 20 Gy הוחל על מראה הקודם במודלים vivo של הזרקור של תא הגידול5. הקרנה של בלוטות החלב לשעבר vivo לפני היווצרות אורגאיד מותר לבידוד של אפקטי נזק קרינה ללא חדירה מתאימה של תאים חיסוניים. התפתחות של מודל רקמה נורמלית לקרינה מחוץ לתמונה מאפשרת צפייה בזמן אמת של אינטראקציות סלולר שעשויות לתרום CTC גיוס המושרה11,12.
<p class="j...

כ 60% של סרטן השד שליליים משולשת (TNBC) מטופלים בוחרים בשד-שימור טיפול (BCT) כסוג של טיפול1. במובן זה מודאליות, הגידול המכיל חלק של רקמת השד מוסר, ואת הרקמה הנורמלית המקיפה נחשפת קרינה מייננת להרוג כל שרידי תאים סרטניים. הטיפול מפחית הישנות יותר של אוכלוסיית סרטן השד; עם זאת, כ 13.5% של חולים מטופלים עם החוויה TNBC לוקליזציה מופעים חוזרים2. לכן, ללמוד כיצד קרינה יכול לגייס תאים סרטניים במחזור (ctcs) יוביל לתובנות חשובות להישנות המקומי3,4.
העבודה הקודמת הראתה כי הקרינה של רקמות נורמלי מגביר את הגיוס של סוגי תאים שונים5. במודלים טרום קליניים של TNBC, הקרנה של רקמה נורמלית גדל מקרופאג ולאחר מכן הגידול התא הגיוס לרקמות נורמלי5. המצב החיסוני השפיעו על גיוס תאים סרטניים לאתרים שנחשפו לקרינה, עם הגירה תא הגידול נצפתה בנושאים חיסוני. העברת האינטראקציות הללו תוך שימוש באורגנואידים הנגזרים מבלוטות החלב תאפשר צפייה בהעברת תאים ואינטראקציות תאים מסטרומה בזמן אמת עם מיקרוסקופ ודימות תאים חיים כדי לקבוע את התפקיד של נזקי קרינה בשנות התנהגות תא הגידול.
אורגנואידים של העכבר עזרו להבהיר שלבי מפתח בהתפתחות בלוטת החלב. מבנה החלב הוא מגוון, שלושה מימדים המבנה של אפיתל החלב בודד כי הוא גדול יותר 50 יקרומטר6,7,8,9,10. באמצעות מארגני האפיתל העיקרי, Simian ואח ' העריך את הגורמים הדרושים עבור הסתעפות בבלוטת החלב7. שמיר ואח ' גילה כי הפצת יכול להתרחש ללא האפיתל למעבר mesenchymal, מתן תובנה האשד הגרורתי8. שיטות להפקת ואפיון אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב מבוססים היטב6,11,12,13. עם זאת, על הידע שלנו, שיטות לגידול מאורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב לא דווחו. פרוטוקול לגידול ולאפיון של אורגנואידים הקרינה יהיה צעד מכריע בארגון לכידה של הקרינה הנגרמת החיסונית והגידול תאים.
במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לגידול ולאפיון אפיתל הפטמות המנואידים במיקרופלטות נמוכות מצופות בפולימר הידרופילי התומך בהיווצרות הספרואידים. האורגנואידים האלה היו שותפים לתרבות עם מקרופאגים כדי לבחון קינטיקה חיסונית הסתננות של תאים. עבודה זו ניתן להרחיב כדי לכלול co-culturing אורגנואידים עם תאים האדיפוז מאפייני החלב, תאים סרטניים השד כדי להמחיש הזרקור תאים הגידול, ו CD8 + T תאים ללמוד גידול-אינטראקציות תאים חיסוניים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים שנקבעו בעבר כדי להעריך את האורגנואידים הניתנים לקרינה. מוקדם יותר דגמים שיתוף החלב אורגנואידים ותאים חיסוניים יש לשפוך אור על מנגנונים של גרורות והפצת. DeNardo ואח ' מצא כי CD4 + T בוויסות התאים של מקרופאגים הקשורים הגידול משופרת פניטיפ גרוטיפים של הפטמות אדנוקרצינומות14. בנוסף, נעשה שימוש במודלים של תרבות משותפת כדי להבהיר מנגנונים לפיתוח ביולוגי. פלקס ואח ' הבהיר את תפקידה של CD4 + T כתאי הרגולטורים של החלב באורגאוגנזה15. עם זאת, הקבוצה שלנו היא הראשונה להקים הליך להמחיש כיצד הקרנה רקמה נורמלית משפיע על התנהגות התא החיסונית. מכיוון הקרנה רקמה נורמלית הוכח לשפר את הגיוס תאים סרטניים5, פרוטוקול זה ניתן לפתח עוד כדי לנתח כיצד התנהגות התאים הסרטניים משתנה על ידי הקרנה של רקמות ותאים נורמליים, המוביל להבנה רבה יותר של סרטן הישנות.

<table><tbody><tr><td>10% פורמלין ניטרלי חוצץ</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ציטוקרטין 14</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>לוט: GR3200524-3</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג I</td><td>קורנינג</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ- Clostridium Histolyticum, סוג VIII</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin</td><td>Cell Signaling</td><td>24E10</td><td>Lot: 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב אבקם משני</td><td></td><td>ab150077</td><td>green לוט: GR3203000-1</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב abcam משני</td><td>ab150080</td><td>אדום לוט: GR3192711-1</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>Lot: TG2611041</td></tr><tr><td>אינסולין (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת מרתף מטריג'ל (קרום הבסיס המופק מסרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל)</td><td>קורנינג</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות וקטור</td><td>סרום עיזים</td><td>רגיל S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 צלחות באר</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוס</td><td>פישר</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Phalloidin</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Lot: GR3214582-16</td></tr><tr><td>חלבון צומת הדוק 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Lot: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td> <td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט)</td><td>סיגמא</td><td>P1379-100 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

אורגנואידים נגזר מרקמת מתעכל הם רב-תאיים תלת מימדי (3D) מבנים כי טוב יותר לכידה בתנאים vivo מאשר תא monolayers. למרות שהם לא יכולים לגמרי לדגמן במורכבות vivo, הם שומרים כמה פונקציונליות של האיבר המקורי. ב מודלים סרטניים, אורגנואידים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפלישה תא הגידול. פרוטוקול זה מטרתו לפתח ולאפיין אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב הרגילה והקרינה הרדיואקטיבית כדי להעריך את תגובת הקרינה ברקמות רגילות. האורגנואידים האלה יכולים להיות מיושמים על עתיד בלימודי סרטן מבחנה כדי להעריך את האינטראקציות של תאי הגידול עם אורגנואידים לקרינה. בלוטות החלב היו resected, הקרינה עד 20 Gy מתעכל בתמיסה בקולגן השמיני. אורגנואידים אפיתל הופרדו באמצעות בידול צנטריפוגלי, ו 3D אורגנואידים פותחו ב 96-היטב מיקרופלטות הדבקה נמוכה. אורגנואידים הביע את סימן האפיתל האופייני ציטוקרטין 14. מקרופאג האינטראקציה עם האורגנואידים נצפתה בניסויים בשיתוף תרבות. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור לימוד אינטראקציות הגידול סטרומה, הסתננות של תאים חיסוניים, ו מקרופאג קיטוב בתוך סביבת מיקרו הקרינה.

בלוטות החלב שנחשפו לקרינה התקבלו בהצלחה מבלוטות החלב של העכבר, מעובדות ומתרבות על לוחות הדבקה נמוכה (איור 1). תשואה אורגאיד נבדקה על ידי זריעה בסביבות גידול שונות (איור 2A-G). זורעי תאים ישירות על תרבות רקמות שטופלו 10 ס מ לוחות התא הניבו צמיחה יתר של תאים פיברובסט. המיקרותקיעות זוהו תחת מיקרוסקופ לעומת הפאזה או בסמוך לאותו מישור של מיקוד, והם גדלו במהירות מאורגנואידים מצופים תוך ימים ספורים. הצמיחה של פיברותקיעות נצפתה גם כאשר אורגנואידים היו הנזרע קרום המרתף מטריצות חלבון ...

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

פרוטוקול זה יכול לשמש ולפתח עוד יותר כדי לנתח כיצד קרינה מייננת משפיעה על גיוס תאים סרטניים, מה שמוביל להבנה טובה יותר של הישנות סרטן. אורגנואידים ממאריים הם מודלים רבי עוצמה. הם מחקים מאפיינים בסיסיים של vivo, אך הם מאפשרים בידוד קל של משתנים ביולוגיים.השימוש בצלחות הידבקות נמוכות שולל אתגרי זרימת העבודה הקשורים למטריס חלבונים. חולי סרטן שד משולש שלילי חווים הישנות אזורית מקומית בשיעורים גבוהים יותר לאחר הטיפול. לימוד האופן שבו קרינה משפיעה על התנהגות הגידולים ותאי החיסון יוביל לתובנות חשובות על מנגנוני הישנות.הפגנת מיקרוסקופיה קונפוקרטית של האורגנואידים היא חוויאר גומז, סטודנט לתואר שני במעבדת סילברה בטיסטה. התחל הליך זה עם הסרת בלוטות החלב בטן ו inguinal מעכברים הקריבו כמפורט בפרוטוקול הטקסט. 45 דקות לאחר הקרנת הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מניחים בלוטות החלב בצלחת תאים סטריליים 35 מ"מ וטחון עם אזמלים.טחון עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיעה חתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר מאשר כ מילימטר מרובע אחד באזור. עכשיו להעביר את הרקמה לתסמת קולגן בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. השתמש 10 מיליליטר של פתרון קולגן לכל עכבר.מניחים את צינורות המדגם באמבט מים במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מערבולת במשך חמש שניות כל 10 דקות. העיכול הושלם כאשר פתרון הקולגנס מעונן. סובבו את הפתרון המתעכל ב-450 פעמים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.עכשיו נצפו שלוש שכבות. העל-טבעי מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מים, והתחתית היא גלולה. גלולה מופיע אדום, כפי שהוא תערובת של תאי אפיתל, תאים בודדים stromal, ותאי דם אדומים.יש לציפוי מראש של כל הפיפטות, טיפים לפיפט וצינורות צנטריפוגה עם פתרון BSA לפני המגע על ידי הוספה והסרה של פתרון BSA. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, אם כי יש לסנן אותו באופן סטרילי לפני כל ניסוי. להתאוששות נוספת, מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי מצופה BSA של 15 מיליליטר.פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר את שכבת השומן. צנטריפוגה המדגם ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאף את supernatant, משאיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי למנוע שאף את גלולת התא.עכשיו שאף את השכבה המים מהצינור עם גלולה המקורית. מוסיפים 10 מיליליטר של DMEM/F12 לצינור עם גלולה המקורית, ומעבירים לצינור השני. פיפטה במרץ לשלב ולתלות מחדש את שני כדורי.לאחר צנטריפוגה ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את העל-טבעי והוסיפו ארבעה מיליליטר של DMEM/F12 לצינור. מוסיפים 40 מיקרוליטרים של deoxyribonuclease להשעיה בעדינות ללחוץ ביד במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף שישה מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות.לאחר צנטריפוגה הצינור ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאף את העל-טבעי לסימן 0.5 מיליליטר. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות. עכשיו צנטריפוגה הצינור על ידי פועם ל450 פעמים G ועצירת ארבע שניות לאחר שהגיע למהירות ש.חזור על שלבי הכביסה שלוש פעמים נוספות כדי לטהר אורגנואידים באמצעות התברואה צנטריפוגלית. גלולה צריך עכשיו להיות צבע לבן המורכב רק אורגנואידים אפיתל. תן שימוש חוזר לכדור ב-10 מיליליטר של DMEM/F12.פיפטה ביסודיות כדי ליצור פתרון הומוגני. מעבירים 50 מיקרוליטרים לצלחת פטרי 30 מ"מ ותצוגה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב 20X. לספור את מספר האורגנואידים עם מונה ספירה.פיפטה 50 מיקרוליטרים של אורגנואידים לתוך כל באר של צלחת הידבקות נמוכה. הוסף 150 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל-200 מיקרוליטרים. בזהירות להחליף את המדיום כל יומיים.שמור על מקרופאגים גולמיים בעלי תווית GFP או D-tomato 264.7 במדיה DMEM בתוספת 10%FPS ו- 1%פניצילין-סטרפטומיצין. זרע את התאים לתוך המדיום האורגנואידי בצפיפות הרצויה. השתמש בניגודיות פאזה של תאים חיים ובהדמיה פלואורסצנטית כדי לפקח על חדירת מקרופאג' לאורך זמן.הסר מדיום אורגנואיד מה בארות על ידי שאספירה בזהירות. תקן את הדגימות עם פורמלין עם 10%-חיץ ניטרלי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את האורגנואידים קבוע שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS.אם תרצה, דגימות קבועות ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד עבור כתמים נוספים. לאחר שטיפה, לחלחל אורגנואידים קבוע במשך חמש דקות. חסום את האורגנואידים הקבועים עם סרום עיזים רגיל של 5% ב- PBST של 0.1% למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני שטיפה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.הדגירה אורגנואידים קבועים עם אנטי ציטוקראטין-14, E-cadherin, או חלבון צומת הדוק אחד, ב 1% NGS ב PBST במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות PBST. עכשיו להדק את האורגנואידים עם נוגדן משני נגד ארנב עזים עם 1% NGS PBST במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.מכסים בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר שטיפה כבעבר, השתמש בצבע הגרעיני כדי להכתים גרעינים במשך כחצי שעה. לשטוף את האורגנואידים מוכתמים במשך חמש דקות PBS שלוש פעמים.אם אתה משתמש בשקופית תא, תמוקם עם פתק כיסוי. לאחסן את האורגנואידים עטופים בנייר כסף בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. אורגנואידים מוקרנים יכולים להיות מתורבתים בצלחות הידבקות נמוכות, או בתוך קרום המרתף, אבל הצמיחה המהירה ביותר התרחשה בצלחות הידבקות נמוכה.אורגנואידים סותמים מחדש את מאפייני בלוטת החלב. מבנים הדומים מורפולוגית לתעלות ולאונות נצפו. מגמות הצמיחה הצביעו על כך שכאשר אורגנואידים נזרעו מיד לאחר העיכול והמיון, אורגנואידים שאינם מוקרנים גדלו מהר יותר מאשר אורגנואידים מוקרנים, ככל הנראה עקב מעצר צמיחת תאים כתוצאה ממנגנונים של תיקון נזק לדנ"א.אורגנואידים הביעו מאפייני אפיתל, אשר הוערכו באמצעות כתמים immunofluorescent. אורגנואידים מוקרנים הביעו סמני אפיתל. ציטוקרטין-14, סמן של מיופיתליום, בא לידי ביטוי בחוזקה על פני השטח של אורגנואידים מוקרנים.בנוסף, E-cadherin וחלבון צומת הדוק אחד באו לידי ביטוי בתוך צמתים הסלולר של אורגנואידים. חלבונים אלה חיוניים להיתוך התא הנכון. לאחר ההקרנה, אורגנואידים המשיכו לשמור על מאפייני האפיתל שלהם.כתמים פלואורסצנטיים של אורגנואידים יכולים להיות חזותיים בתוך צלחות הידבקות נמוכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. עם זאת, ההדמיה הברורה ביותר הושגה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת תוקנה חושבה על ידי חיסור הרקע, ונורמליזציה לפי אזור אורגנואיד.גידול אורגנואידים בצלחות הידבקות נמוכה של 96 בארות גם פישט את הניסויים בתרבות ה-Co. כאשר זרע בריכוזים אופייניים בלוטת החלב, קולוקליזציה מקרופאג גדל עם אורגנואידים מוקרנים. בעת ביצוע הליך זה, הדברים החשובים ביותר שיש לזכור הם לא לעכל יתר על כן את האורגנואידים, ולטהר כראוי את ההתברמות הצנטריפוגלית.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים בתרבות השיתוף. אורגנואידים יכולים להיות מתורבתים במשותף עם תאים סרטניים, תאים חיסוניים אחרים, ותאים סטרומה כדי לשחזר את microenvironment מוקרן הקשורים הישנות. שיטה זו תהיה חשובה להערכת האופן שבו נזק לרקמות נורמלי משפיע באופן ספציפי על הדינמיקה של תאי החיסון, ובסופו של דבר ישמש להבנת מנגנוני גיוס תאים סרטניים.אורגנואידים החלב יש מנגנונים מובהרים של התפתחות בלוטת החלב, יש מחדש חזק סרטן השד במבחנה. אנו מקווים כי המודל שלנו מספק תובנות על גיוס תאים סרטניים הנגרמים על ידי קרינה.

growth-characterization-irradiated-organoids-from-mammary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.

חשיפת הזדמנויות טיפוליות עם מודלים אורגנואידים שמקורם בחולה מלנומה

הטרוגניות של סרטן הערמונית ועמידות לטיפול נותרו אתגרים. אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) המשמרים את מאפייני הגידול ההורי המרכזיים. מודל סטנדרטי זה תומך בבדיקת תרופות ובהתקדמות ברפואה מדויקת.

הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה: פרוטוקול ניסיוני מפורט

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

שיטה ייחודית בהנדסת רקמות פותחה כדי להאריך סיבי עצב רבים בתרבות ידי משחזרת למתוח צמיחה האקסון, סוג של גידול במערכת העצבים לפיה עצבים להאריך בשילוב עם צמיחה של הגוף והרחבת.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

למדו כיצד קרינה מייננת משפיעה על גיוס תאי גידול באמצעות אורגנואידים מבלוטות החלב של עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין תאי גידול לתאי חיסון והבנת מנגנוני הישנות סרטן.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

גלה סרטונים נוספים