אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

קומפלקסים-על הם הרכבות על-טבעיות שנוצרו על-ידי קומפלקסים של שרשרת הנשימה בממברנה הפנימית-מיטוכונדרית. היווצרות של supercomplexes אלה הוא האמין להעניק מספר יתרונות מבניים ותפקודיים, הכוללים ייצור מופחת של מיני חמצן תגובתי, ייצוב הרכבה יעילה יותר של קומפלקסים שרשרת הנשימה בודדים, ויסות פעילות שרשרת הנשימה, ומניעת צבירת חלבון בסביבה עשירה בחלבון של הממברנה הפנימית. שינויים בהרכבה ובהרכב של supercomplexes הם דינמיים, והם מוצגים יותר ויותר כדי ביסוד שינויים בתפקוד המיטוכונדריאלי שנצפו במהלך הסתגלות פיזיולוגית, כמו גם מגוון של מחלות גנטיות שנרכשו.

סרטון וידאו זה מציג פרוטוקול PAGE מקורי ברור/כחול היברידי כדי לפתור ולנתח supercomplexes בצורה מדויקת וחסכונית בזמן. היתרון העיקרי של שיטת דף מקורית ברורה/כחולה היברידית זו הוא שהיא משלבת באופן אופטימלי היבטים שונים של פרוטוקולי PAGE מקוריים מסורתיים כחולים וברורים, המאפשרים לצמצם את החשיפה לחומרי ניקוי ותרכובות אניוניים למינימום בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו. הפרדה אופטימלית וניתוח של supercomplexes מושגת על ג'לים הדרגתיים גדולים.

הליך זה כרוך במספר צעדים עדינים הדורשים מיומנויות ידניות וביצוע זהיר. תמיכה חזותית בפרוטוקול הכתוב מספקת עצות חשובות המאפשרות את יישום הטכניקה. מדגימה את ההליך היא אלכסנדריה, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, צנטריפוגה המיטוכונדריה מבודדת מרקמת החיה בצינור 1.5 מיליליטר ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי והוסף את הנפח המחושב של חיץ מיצוי קר כקרח המכיל דיגיטונין לצינור כדי להשתמש מחדש את גלולת המיטוכונדריה. מניחים צינורות על מסובב צינור מיני דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס במהירות סיבוב בינונית.

דגימות צנטריפוגה ב 20, 400 פעמים G במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שברים בלתי פתירים. העבר את העל-טבעי לצינור חדש על קרח. אם אלקטרופורזה אינה מבוצעת באותו יום, יש לאחסן דגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

פתח את תא הליהוק. מניחים צלחת זכוכית החיצונית 20 ס"מ פעמים 22 ס"מ בתא. מקם קבוצה אחת של רווחים של 1.5 מיליליטר באמצעות כרטיס היישור כדי להבטיח שהם יושבים בחוזקה כנגד הצד ופינות התא.

מניחים צלחת זכוכית פנימית על גבי החללים כדי ליצור את כריך הג'ל, ולשים גיליון הפרדה פלסטיק על גבי צלחת הזכוכית. מסדרים עוד שלושה הרכבה של כריך ג'ל. הוסף בלוקים אקריליים נוספים או צלחות זכוכית במידת הצורך כדי לקחת את השטח הנותר בתא.

מניחים רצועה של פרפילם בחורב לפני ישיבה אטם בחוזקה חריץ אטם. מניחים את צלחת התקרה על התא ומהדקים את כל ששת הברגים. תעמוד בתא הליהוק.

מניחים שיפוע לשעבר על צלחת ערבוב עם מערבל מגנטי בתא ערבוב האור. חבר את הצינורות של תא הליהוק לשיפוע לשעבר, ואבטח את הצינורות בקלטת של המשאבה ההיסטנטית. ודא שהתחנה של המילוי ההדרגתי לשעבר סגורה.

כדי להטיל ארבעה ג'לים, הכינו 60 מיליליטר של 4%ו-60 מיליליטר של 12% ג'ל בשני בקבוקונים של ארלנפייר, וערבבו היטב כדי לערבב. יוצקים את תסכום 4% ג'ל בתא ערבוב האור, ואת 12% בתא המאגר הכבד של שיפוע לשעבר. מניחים את מהירות הערבב של צלחת הערבב ב-350 סל"ד.

ואז לפתוח את stopcock ולהדליק את המשאבה ב 35 סל"ד. לאחר רמת הפתרון של שבר האור נמוך יותר מאשר שבר כבד, להשהות את המשאבה ולפתוח את גזע השסתום בין מאגרים קלים וכבדים. תן לשברים באמצעי האחסון לצייד ולהפעיל מחדש את המשאבה.

ודא שאין בועות להיכנס למערכת להילכד בין צלחות זכוכית. לאחר ג'ל שיפוע הוא שפך לחלוטין, לעצור את המשאבה ואת כיסוי מים מיליליטר אחד על כל כריך ג'ל כדי למנוע ייבוש של ג'ל. תן לו להפוך לפולימר במשך שעתיים.

הכינו ג'ל לערום 25 מיליליטר בבקבוק ארלנפייר ומערבולת לערבב ביסודיות. היפוך עדין של המונטאז' להסרת מים, והכנסת 15 סרסים היטב לכל כריך ג'ל. יוצקים ג'ל לערום ולתת לו פולימריזציה במשך שעתיים.

לאחר מכן, להכניס מלחצי ג'ל וכריך ולהסיר מסרק. עם צלחת הזכוכית הקצרה הפונה כלפי מטה, הכנס את כריך הג'ל לליבת הקירור. חוזרים על הפעולה בצד השני ומ מניחים את הליבה במיכל האלקטרופורזה.

יוצקים 300 מיליליטר של חיץ קתודה כחול בתא הפנימי של מיכל האלקטרופורזה. עם פיפטה וטיפים לטעינה, יש לטעון 75 עד 175 מיקרוגרם חלבון לגם. בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס, חבר את האלקטרודות לאספקת החשמל והפעל אותו ל-150 וולט, והפעל ג'ל למשך שעה וחצי, או עד שכל הדגימות נכנסו לג'ל השיפוע.

טען שכפולים של המדגם בארות נפרדות כדי לאפשר קביעה מקבילה של פעילויות בג'ל וניתוח immunoblot של קומפלקסים OXPHOS. הסר חיץ קתודה כחול עם פיפטה. החלף על ידי 300 מיליליטר של חיץ קתודה כחול קומאסי חינם, ולהפעיל ג'ל ב 200 וולט לילה בחדר קר.

לפני תום האלקטרופורזה, הכינו מאגרי פעילות בג'ל על פי כתב היד, ושמור אותם בחושך בטמפרטורת החדר. להפסיק אלקטרופורזה ולאחזר ג'ל. חותכים את שקית הניילון כך שניתן יהיה לפתוח אותה כמו ספר.

חותכים נתיבים ומעבירים נתיבי ג'ל לשקיות ניילון. השתמשו באיטום חום כדי לאטום שניים משלושת הצדדים. אם מבוצעים ניסויי בקרה שליליים, הוסיפו מעכבים למאגרי ההתזה.

עבור שלוש דגימות ניסיוניות, להוסיף 20 מיליליטר של חיץ פעילות בג'ל. הסר בועות ואטום את הצד הרביעי של שקית ניילון. דגירה נתיבי ג'ל ב 37 מעלות צלזיוס בחושך ולבדוק כל 15 דקות.

זמן הדגירה משתנה בהתאם לכמות החלבון והמתחמים. לאחר הדגירה, לשטוף נתיבי ג'ל במים כדי לעצור את התגובה, ותמונה על רקע לבן עבור מורכב I, מורכב II, מורכב IV, או רקע שחור עבור V.For מורכבת למשל, פעילות מורכבת IV בג'ל בוצעה כדי לדמיין supercomplexes מבודדים מיטוכונדריה כבד עכבר טרי. הכמות האופטימלית של דיגיטונין לדגימה זו היא ארבעה גרם לגרם, מכיוון שהיא מספקת רזולוציה טובה של קומפלקס מונומרי IV, וסופר-קומפלקסים בעלי משקל מולקולרי גבוה.

ביחס נמוך יותר, להקות אינן ברורות לפתור למריחה במהלך אלקטרופורזה, ואילו השימוש ביחס גבוה יותר של דיגיטונין מוביל לשיבוש של supercomplexes משקל מולקולרי גבוה. מיטוכונדריה בכבד מבודד מעכבר אחד טופלו עם כמות אופטימלית של digitonin כדי לחלץ supercomplexes הנשימה. הניידות האלקטרופורטית של מתחמי OXPHOS מצטמצמת מעט כאשר חלבונים מופרדים באמצעות תנאי דף מקוריים היברידיים ברורים /כחולים, בהשוואה לדף מקורי סטנדרטי, בשל כמות מופחתת של כחול קומאסי.

שינוי ניידות זה גדול יותר עבור מונומרים IV מורכבים, ואחריו מונומרים V מורכבים, ו I.The הרקע הכחול מורכב נמוך יותר בדף מקורי /כחול ברור היברידית לעומת דף מקורי כחול. רמות רקע גבוהות בעקבות דף מקורי כחול מסתירות לחלוטין את הכתם של הפעילות בג'ל עבור קומפלקס II, ומשפרות את רעשי הרקע הקשורים לפעילות של דימרים IV מורכבים. עבור פרוטוקול זה, titration של דגימות עניין עם כמויות שונות של דיגיטונין הוא קריטי על מנת לזהות את התנאים המאפשרים מינון אופטימלי, תוך שמירה על פעילות האנזים אינטראקציות חלבון פיזיולוגי.

כל הצעדים הנוגעים ליציקת הג'ל צריכים להתבצע בקפידה להיווצרות שיפוע אופטימלי להפרדת מדגם נכונה. טיפול קיצוני צריך להילקח גם על המניפולציה של אלה ג'לים גדולים ושבירים. תמיד להחזיק אותם עם כמה אצבעות באמצעות קצה האחוז הגבוה של הג'ל.

בשיטת PAGE מקורית היברידית ברורה/כחולה זו, דגימות נחשפות רק בקצרה לצבע האיום הכחול קומאסי בתחילת האלקטרופורזה ללא חשיפה לחומרי ניקוי אחרים. זה מאפשר להפריד ולפתור supercomplexes ביעילות כמו עם שיטות מסורתיות כחול יליד PAGE, תוך הימנעות ההשפעה השלילית של רמות כחול קומאסי גבוהות על בדיקות פעילות בתוך ג'ל ואינטראקציות חלבון חלבון labile בתוך supercomplexes. עם פרוטוקול זה, ניתן אפוא לשלב מדידות פעילות מדויקות ומהירות בג'ל עם טכניקות אנליטיות הכוללות אלקטרופורזה דו-ממדית, כשל חיסוני ו/או פרוטומיקה המוזכרת בניתוח של סופר-קומפלקסים.