דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

תאי מונונוקלאר דם טבור, או CBMC, הופיעו כמקור תא פוטנציאלי לרפואה רגנרטיבית, כי הקלדת אנטיגן לויקוציטים אנושית חיונית למערכת הבנקאית של התאים. תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי CBMC, או CMBC-iPSCs, יכולים להיות מובחנים לקרטינוציטים ופיברובלסטים. כדי ליצור אורגנואיד עור תלת מימדי, אנחנו משתמשים במחקר דרמטולוגי.

התחל על ידי culturing CBMC-iPSC על צלחות 100 מיליליטר מצופה vitronectin ב 37 מעלות צלזיוס ו 10% פחמן דו חמצני. כאשר התאים הגיעו 80%confluency, לשטוף את התרבויות עם PBS, ולטפל בהם עם מיליליטר אחד של EDTA מילימולרי לכל צלחת במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם שלושה מיליליטר של E8 בינוני לכל צלחת, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

להשעות מחדש את כדורי בחמישה מיליליטר של מדיום E8 לספירה, ולהעביר תאים חד פעמיים 10-the-השישי לצינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים שהועברו עם 2.5 מיליליטר של מדיום היווצרות הגוף העוברי, בתוספת 10 מיקרומולר rho-associated קינאז, או מעכב רוק. השתמש פיפטה להעביר 125-microliter טיפות של תאים על מכסה צלחת תרבות לא מצופה.

כאשר כל טיפות הונחו, להפוך את המנה כדי לאפשר טיפות לתלות מהמכסה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לשטוף את המכסה עם מדיום E8 טרי, ולהעביר את פתרון הגוף העוברי לצינור חרוט 50 מיליליטר. אפשר לגופים העובריים להסתפק בדקה אחת בטמפרטורת החדר, לפני שאפת העל-טבעי והשעיה מחדש את הגופים העובריים עם מדיום E8 טרי לתרבותם בצלחת פטרי של 90 מילימטר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד להתבוללותם.

עבור בידול קרטינוציטים CBMC-iPSC, החלף את מדיום E8 מתרבות הגוף העוברית במדיום E8 טרי, בתוספת ננוגרם אחד למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם 4 עבור דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לקצור את הגופות העובריות לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר כפי שהוכח, ולאפשר לגופות להסתפק בדקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את העל-טבעי בשישה מיליליטר של דידול קרטינוציטים בינוני 1, או KDM1, בתוספת 10 מעכבי רוק מיקרומולריים, והעבר את הגופים העובריים לצלחת 100 מילימטר מצופה קולגן מסוג IV.

בימים אפס עד שמונה של תרבות, להחליף את המדיום כל יומיים עם KDM1 טרי, בתוספת חומצה רטינואית שלושה מיקרומולרית ו 25 ננוגרם למיליליטר כל חלבון מורפגנטי עצם 4 וגורם גדילה אפידרמיס. בין ימים תשע עד 12, להחליף את המדיום כל יומיים עם KDM2, בתוספת חומצה רטינואית שלושה מיקרומולרית, 25 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם 4, ו 20 ננוגרם למיליליטר של גורם הגדילה האפידרמלי. בין ימים 13 עד 30, לשנות את המדיום כל יומיים KDM3, בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם 4, ו 20 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אפידרמיס.

עבור בידול פיברובלסט CBMC-iPSC, להשעות מחדש את תרבות הגוף העוברי בשישה מיליליטר של בידול fibroblast בינוני 1, בתוספת מעכבי רוק 10 מיקרומולרי, ולהעביר את ההשעיה הגוף העוברי לצלחת מטריצת מטריצת ממברנה מרתף מצופה 100 מילימטר. לאחר שלושה ימים של דגירה, לטפל בתרבות עם חלבון morphogenetic עצם 0.5-nanomolar 4 במשך ארבעה ימים, לפני שינוי בינוני כדי פיברובלסט ההידול בינוני 2. ביום השביעי לתרבות, שנה את המדיום ל- FDM2 כל יומיים במשך שבוע אחד.

ביום 14 של תרבות, לנתק את התאים עם EDTA מילימולר אחד כפי שהוכח, ולאסוף את התאים בשלושה מיליליטר של דידול fibroblast בינוני 2 עבור צנטריפוגה. השהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של דידול פיברובלסט בינוני 1 לספירה, והעברת תאים פעמיים עד 10 לשישית לצלחת לא מצופה. ביום ה-21 לתרבות, העברו תאים פעמיים עד 10 עד שישית מהתרבות לתבשיל 100 מילימטר מצופה קולגן מסוג I במדיום פיברובלסט טרי 1.

ביום ה-28 לתרבות, העברו פעמיים-10 ל-6 מהפיברובלסטים שמקורם ב-iPSC לתבשיל חדש שאינו מצופה. עבור הדור האורגנואידי של העור התלת מימדי, יש לקצור את הפיברובלסטים שמקורם ב-iPSC מתרבות, ולהעביר תאים פעמיים עד 10 עד חמישית לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולת fibroblast ב 1.5 מיליליטר של דידול fibroblast בינוני 1, ו 1.5 מיליליטר של פתרון קולגן מסוג I מנוטרל.

הדגירה את התאים על הכנס מיקרופלסטיק שש באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הפתרון התגבש, להוסיף שני מיליליטר של בינוני לראש הכנס, ושלושה מיליליטר לתחתית באר. לאחר מכן מניחים את מטריצת פיברובלסט לתוך החממה במשך חמישה עד שבעה ימים, עד הג'לציה הושלמה, ואת המטריצה כבר לא מתכווצת.

בסוף הדגירה, לקצור את הקרטינוציטים שמקורם ב- iPSC, ולהעביר תאים חד פעמיים 10-6 לצינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה ב 50 כדי 100 microliters של מדיום אפיתל סידן נמוך 1, ולהחליף את המדיום על מטריצת fibroblast עם פתרון התא keratinocyte. לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את המדיום בחלק העליון של הכנס עם שני מיליליטר של מדיום אפיתל 1, ואת המדיום בתחתית היטב עם שלושה מיליליטר של אותו, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור.

לאחר יומיים, להחליף את המדיום בהכנסה ואת באר עם מדיום אפיתל סידן נורמלי 2 במשך יומיים נוספים של תרבות. ביום הרביעי לתרבות, הסר את כל המדיום, והוסף שלושה מיליליטר של מדיום קורניפיפיקציה לתחתית באר בלבד, כדי ליצור ממשק נוזלי אוויר. לאחר מכן להחזיר את הצלחת לאנקובטור עד 14 ימים לפני קצירת אורגנואיד העור 3D לניתוח במורד הזרם.

לקרטינוציטים שמקורם ב- CBMC-iPSC יש מורפולוגיה הדומה לקרטינוציטים ראשוניים, והביטוי של סמני קרטינוציטים גדל בתאים אלה. CBMC-iPSC נגזר fibroblasts יש מורפולוגיה דומה פיברובלסטים ראשוניים, ואת הביטוי של סמן תאי גזע פלוריפוטנטי אוקטובר-4 הוא למטה מוסדר, בעוד סמנים fibroblast הם up-regulated. עובי אורגנואיד העור 3D עולה במהלך תרבות 3D, המאשר כי אורגנואיד העור 3D מופק קרטינוציטים שמקורם iPSC ו fibroblasts.

לאחר שבועיים, השתלת אורגנואיד עור תלת מימדי מושתלת משלבת ביעילות לתוך עור עכבר נמען, כפי שאושר על ידי ניתוח HNE. יתר על כן, קרטינוציטים התבגרות סמני בידול אפידרמיס באים לידי ביטוי CBMC-iPSC נגזר 3D אורגנואידים העור, הוכחת בידול תפקודי, השתלה יעילה, וריפוי יעיל של פגמים בעור העכבר. אנו משתמשים בעבר עם מדיום סידן גבוה המביא שכבות מרובדים של אורגנואיד עור תלת מימדי לחקות ליד העור.

ניתוח מראה כי העור הוא ריבוד. CBMC-iPSCs הם מקור תאי פוטנציאלי עבור שתלי עור, ו אורגנואידים עור 3D נגזר CBMC-iPSC ניתן להשתמש במחקרים הקשורים דרמטולוגיה, הקרנה קוסמטית, ורפואה רגנרטיבית.