Name: דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למד שיטת דיסקציה יעילה לרשתית הגולמי של Drosophila melanogaster לצורך אימונוהיסטוכימיה, ניתוח מערבי ובידוד RNA. הפרוטוקול שומר על שלמות הרקמה ומאפשר עיבוד מהיר של מספר רב של עיניים ליישומי מחקר שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים זאק תוף וסוקרים שלנו עבור הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי R15GM114729.

<ol><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647(2004).</li>
<li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li>
<li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li>
<li>Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li>
<li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796(2017).</li>
<li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li>
<li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%E2%80%90d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li>
<li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li>
<li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval%2C+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).</li>
<li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).</li>
<li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה של ניתוח העין הגולמי דרוזופילה המתוארים כאן מאפשר הבידוד של 6 עד 10 מתחמי עין-מוח בתוך 10 עד 15 דקות. עם זאת, תרגול וסבלנות חיוניים על מנת לשלוט בטכניקה לנתיחה, לשפר את האיכות ואת המהירות של ניתוח. הפעם ניתוח קצר מבטיח בכל עין כ אותו התפתחותית הבמה, הפחתת השתנות בביטוי פנוטיפ או הגן של הרשתית בערכת נתונים. בעוד פרוטוקולים אלטרנטיבית עשויים לדרוש פחות התמחות להתמחות, פרוטוקול שלנו נועד באופן שיטתי לבודד רקמת רשתית עדינה תוך מזעור הסיכון של קריעה או הטיה, כי נזק לעין יכול לגרום מתח מסלול הפעלה או אפילו מוות ...

הרשתית דרוזופילה מורכב כ-750 ommatidia מוקף תאים פיגמנטים מסודרים חלת דבש סריג1,2,3,4. כל ommatidium כוללת שמונה קולט אור נוירונים, תאי חרוט מפריש עדשה 4 שני תאי הפיגמנט העיקרי. סביב כל ommatidium הם תאים מייצרי פיגמנט סריג וקבוצות זיפים חושית. בשל הטבע שלאחר mitotic שלה סטריאוטיפית סידור משושה, הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic כולל תא אדהזיה5,6, 7,8,9,10 ואפופטוזיס11,12,13,14,15.
מספר פרוטוקולים שפורסמו לנצל לחץ האוויר לחלץ עין-מוח מתחמי דרוזופילה הגלמים16,17,18. הפרוטוקול המתואר כאן במקום זה מנצל כלים microdissection בקפידה ולבודד בדיוק מתחמי מוח-עין עם המטרה של השגת רקמת רשתית ניזוק. דבר זה חיוני אם הרשתיות הן כדי להיות מנוצל עבור מורפולוגי, חלבון, או ביטוי גנים מנתח מאז נזק הרשתיות עלול לגרום מתח סלולארית או המוות, אשר יכול לשנות את הביטוי הסלולר של פנוטיפ או הגן. בנוסף, לאחר תרגול, יכול מבודדת 6 עד 10 עין-מוח מתחמי ב 10-15 דקות, דבר המקל על המטרה של צמצום השתנות גיל, שלב התפתחותי של רקמת העין גזור.
הקיבעון, immunostaining ופרוטוקול כולה-הר המתוארים להלן מתאים ההכנה של העיניים דרוזופילה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יכול להיות מודגרות הרשתיות עם נוגדנים מיקוד חלבונים עניין. כך למשל, נוגדנים למרכיבים צומת adherens יכול להיות מנוצל להמחיש circumferences הפסגה של תאים כך מאפיינים כולל סוג התא, הצורה ואת סידור יכולה להיות המוערך19. לפני קיבוע, העיניים יכול במקום להיות ביקע מהמוח לצורך חילוץ חלבון לניתוח המערבי, או RNA לשימוש ב- PCR לרביעיית או RNA-רצף.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>תוכנת עיבוד תמונה</td><td>Adobe</td><td></td></tr><tr><td>סדים במבוק, 6 אינץ'&nbsp;</td><td>טד פלה בע"</td>מ <td>116</td><td></td></tr><tr><td>בטא מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>בטא-גליצרול פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> חיתוך שחורה <td>צלחת פטרי מזכוכית ממולאת עד השפה עם SYLG170 או SYLG184 (בצבע שחור עם אבקת פחם טחונה דק). השאירו בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות לפילמור.</td></tr><tr><td>מחזיק להב</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, טבליות קוקטייל מעכבות פרוטאז ללא EDTA</td><td></td> מיקרוסקופ <td>קונפוקלי Roche</td> 4693132001 <td></td></tr><tr><td>(Zeiss LSM 501)</td><td>קרל זייס</td><td></td><td>או מיקרוסקופ דומה</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila מדיה למזון, עשיר בחומרים מזינים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7.5% סוכרוז, 15% גלוקוז, 2.5% אגר, 20% שמרי בירה, 5% פפטון, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td></tr><tr><td>Drosophila מדיה למזון, </td> מתכון קמח תירס סטנדרטי <td></td><td></td> של <td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה</td><td></td><td></td> מקבעת <td>4% פורמדהיד ב-PBS, pH 7.4.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מיקרוסקופ TCS SP5 DM)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>או מיקרוסקופ דומה</td></tr><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td>יש לחדד מלקחיים</td> של <td>Fine Science</td><td>Tools 91150-20</td> לעתים קרובות.</tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>כלי זכוכית 9 בארות&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>7220-85</td><td>ידוע גם בשם מנות 9 בארות&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית (22 x 22 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (25 x 75 x 1 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio גרסת תוכנה 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>תוכנת עיבוד תמונה לכימות כתמים מערביים.</td></tr><tr><td>מאגר דגימת Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X מאגר דגימת חלבון מרוכז, תוספת עם בטא מרקפטואתנול לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>מאגר דגימה להפחתת סמני נתיב&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X מאגר דגימת חלבון מרוכז.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריגורה&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-דיסקציה&nbsp;</td><td>מגשי Microwell של Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>(72 x 10 ומיקרו; L wells)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי</td><td></td><td></td> הרכבה <td>0.5% N-propylgallate ו-80% גליצרול ב-PBS</td></tr><tr><td>N-propylgallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>ללא נוקלאז PBS (PBS ב-0.1% DEPC, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>הוסף נפח מתאים של DEPC ל-PBS, ערבב היטב ודגר למשך הלילה בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מתמיד. חיטוי למשך 20 דקות לפחות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS (חוצץ פוספט עם תמיסת מלח pH 7.4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>הכן לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS בתוספת מעכבי פרוטאז ופוסהטאז)</td><td></td><td></td><td>10mM NaF, 1 מ"מ בטא-גליצרול פוספט ו-1 מ"מ Na3VO4 ב-PBS, pH 7.4.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0.15% TritonX ו-0.5% אלבומין בסרום בקר ב-PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>מחזיק פינים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 26016-12</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני: עז אנטי-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>לכתמים מערביים. בשימוש ב-1:3000</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני: ארנב אנטי-שסוע Dcp-1</td><td>איתות תאים</td><td>9578S</td><td>לאימונופלואורסצנטיות. בשימוש בשעה 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני: מחקרים התפתחותיים נגד DEcad של חולדות</td><td>בנק היברידומה</td><td>DCAD2</td><td>לאימונופלואורסצנטיות. בשימוש בשעה 1:20</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני: אנטי-DEcad של חולדה</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; מתנה מטדאשי אומורה. בשימוש בשעה 1:100.</td></tr><tr><td>ערכת תוספת RNA: ערכת Relia Prep לרקמת RNA Miniprep&nbsp;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טיהור Rnase (RNase Away)</td><td>מוצרים ביולוגיים מולקולריים</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>נתק חתיכה קטנה של להב סקיפל ואבטח במחזיק הלהב.</td></tr><tr><td>נוגדן משני: 488-מצומד&nbsp; חמור נגד חולדות IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>לאימונופלואורסצנטי. בשימוש בשעה 1:200</td></tr><tr><td>נוגדן משני: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>לאימונופלואורסצנטי. בשימוש בשעה 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן משני: HRP מצומד עז נגד חולדות IgG (H+L)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>7077</td><td>לכתמים מערביים. בשימוש בשעה 1:3000</td></tr><tr><td>נוגדן משני: ארנב מצומד HRP נגד עזים IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>לכתמים מערביים. בשימוש ב 1:3000</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ונדאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (NanoDrop)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח סטריאו (M60 או M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>או מיקרוסקופ דומה</td></tr><tr><td>Sylgard (שחור)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (שקוף)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>צבע שחור עם אבקת שרקול טחונה דק</td></tr><tr><td>רקמה: Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride pH7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>מחט טונגסטן, עדינה</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>הכנס למחזיק סיכה</td></tr><tr><td>מחט טונגסטן, Fine</td><td>Science Tools</td><td>10130-20</td><td>הכנס למחזיק סיכה</td></tr><tr><td>WTLB (מאגר ליזה של רקמות מערביות)</td><td></td><td></td><td>150 מ"מ NaCl, 1.5% טריטון X-100, 1 מ"מ EDTA, 20% גליצרול, 10 מ"מ NaF, 1 מ"מ בטא-גליצרול פוספט ו-1 מ"מ Na3VO4 ב-50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5). תוסף עם שולחן קוקטייל פרוטאז cOmplete אחד לכל תמיסה של 10 מ"ל.</td></tr><tr><td>משחת שמרים</td> <td>(סופרמרקט מקומי)</td><td></td> <td>כ -2 כפות שמרים פעילים יבשים של פליישמן (או דומים) מומסים ב ~ 20 מ"ל מזוקק H2O</td></tr></tbody></table>

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של rna בידוד

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic במהלך הפיתוח. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין רוברט של הרשתית הגולמי עדין דרוזופילה . הגישה כירורגי שלנו מנצל כלים microdissection זמינים פתח הגלמים ולחלץ בדיוק מתחמי עין-מוח. אלה יכולים להיות קבוע, נתון אימונוהיסטוכימיה, הרשתיות ואז רכוב על גבי שקופיות מיקרוסקופ, עם תמונה, אם המטרה היא לזהות מבנים הסלולר או subcellular. לחלופין, הרשתיות מבולבל יכול להיות מבודד רקמת המוח, lysed במאגרי המתאים, מנוצל להפקת חלבון ג'ל אלקטרופורזה או mRNA (להעריך ביטוי חלבון או הגן, בהתאמה). אימון משמעותי וסבלנות עשויים להידרש כדי לשלוט פרוטוקול microdissection תיאר, אך שולט, הפרוטוקול מאפשר בידוד מהיר יחסית של הרשתית בעיקר ניזוק.

העין הגולמי היא רקמות נגיש בקלות המשמש כמודל מצוין לחקור תהליכים פיתוחיים מורפוגנזה כונן זה. כאן, יש פרקנו הרשתיות להשתמש immunofluorescence כדי לזהות את צמתי adherens הפסגה (איור 3 א, ג) או את קספאז Dcp-1 (איור 3D) הופעלה במהלך אפופטוזיס (איור 3)25. גישות אלה לאפשר אחד להתבונן בבירור תאים במהלך תהליכי morphogenetic מפתח כולל גיוס, מורפוגנזה התאים הראשי (מתוך 18 h APF), העיבור של סריג תאים סב...

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זוהי שיטה יעילה לבידוד של רקמת העין הפופאלית Drosophila עבור יישומים מרובים במורד הזרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת ניתוח מהיר של מספר רב של עיניים pupal מבלי לפגוע ברקמה. ניתוח הרשתית הפופאלית של דרוזופילה יהיה מאתגר למתחילים.תרגול הטכניקה היא הדרך הטובה ביותר לשפר את מהירות הניתוחים ואת איכות התוצאות. לאחר הנחת הגולה Drosophila על צלחת חיטוי שחורה, להניח חתיכה טרייה של סרט דו צדדי על צלחת חיטוי, מן הגולה, ולהשתמש בזוג מלקחיים כדי למקם בזהירות את הצד הגבי גלמים על הקלטת. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולהשתמש מדפים כדי להסיר את operculum של כל גולם.השתמש מספריים microdissection לחתוך כל מקרה pupal, המאפשר לו להיות flapped פתוח לחשוף את הראש, בית החזה, ואת קטע הבטן לפני, ולאבטח את הקצוות של מארז pupal לקלטת דו צדדית. לנקב את הבטן של כל גלם עם מדפים חדים, ולהסיר את הגולה ממארז הגופל שלה. מניחים את הגופה על צלחת הניתוח, הרחק מהקלטת, ומכסים את הגופה עם 400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח.השתמש במקלפים כדי לתפוס כל אחד על ידי הבטן, ולהשתמש מספריים microdissection לעשות חתך אחד נקי דרך בית החזה, חיתוך הגלמים לשניים. באמצעות שני זוגות של מטלטולים עדין, לתפוס את הקצוות החתוכים של כל אפיתל בית החזה בהדרגה לקרוע לפתוח את בית החזה ואת קפסולת הראש, ח

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את קומפלקס עין-מוח מגלמי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המניב רקמות באיכות גבוהה, התואמות, למשל, immunostaining, כמו גם, ניסויים אחרים ביטוי גנים.

דיסקציה של קומפלקס עין-מוח מגלמי זבובים: שיטה לבידוד רקמת רשתית

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

למד שיטת דיסקציה יעילה לרשתית הגולמי של Drosophila melanogaster לצורך אימונוהיסטוכימיה, ניתוח מערבי ובידוד RNA. הפרוטוקול שומר על שלמות הרקמה ומאפשר עיבוד מהיר של מספר רב של עיניים ליישומי מחקר שונים.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

גלה סרטונים נוספים