דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זוהי שיטה יעילה לבידוד של רקמת העין הפופאלית Drosophila עבור יישומים מרובים במורד הזרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת ניתוח מהיר של מספר רב של עיניים pupal מבלי לפגוע ברקמה. ניתוח הרשתית הפופאלית של דרוזופילה יהיה מאתגר למתחילים.

תרגול הטכניקה היא הדרך הטובה ביותר לשפר את מהירות הניתוחים ואת איכות התוצאות. לאחר הנחת הגולה Drosophila על צלחת חיטוי שחורה, להניח חתיכה טרייה של סרט דו צדדי על צלחת חיטוי, מן הגולה, ולהשתמש בזוג מלקחיים כדי למקם בזהירות את הצד הגבי גלמים על הקלטת. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולהשתמש מדפים כדי להסיר את operculum של כל גולם.

השתמש מספריים microdissection לחתוך כל מקרה pupal, המאפשר לו להיות flapped פתוח לחשוף את הראש, בית החזה, ואת קטע הבטן לפני, ולאבטח את הקצוות של מארז pupal לקלטת דו צדדית. לנקב את הבטן של כל גלם עם מדפים חדים, ולהסיר את הגולה ממארז הגופל שלה. מניחים את הגופה על צלחת הניתוח, הרחק מהקלטת, ומכסים את הגופה עם 400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח.

השתמש במקלפים כדי לתפוס כל אחד על ידי הבטן, ולהשתמש מספריים microdissection לעשות חתך אחד נקי דרך בית החזה, חיתוך הגלמים לשניים. באמצעות שני זוגות של מטלטולים עדין, לתפוס את הקצוות החתוכים של כל אפיתל בית החזה בהדרגה לקרוע לפתוח את בית החזה ואת קפסולת הראש, חשיפת קומפלקס העין-מוח ואת רקמת השומן שמסביב. לאחר מכן, מבלי לתפוס את הרקמה, השתמש במטסים כדי להנחות כל תסביך שקוף, לא לבן, בצורת משקולת, הרחק מהשרידים של קפסולת הראש.

לאחר ניתוח 6 עד 10 גלמים, חותכים קצה מיקרופיפט עם סכין גילוח נקי לקוטר של כמילימטר אחד, ומשמנים את הקצה בתערובת של PBS ושומן. השתמש בקצה פיפטה משומן כדי להעביר את מתחמי המוח העין לתוך באר אחת של צלחת זכוכית תשעה באר המכיל 400 microliters של PBS על קרח, ולאחר מכן להעביר את הרקמה ב 20 microliters של PBS לתוך לפחות 250 microliters של קיבוע עבור דגירה של 35 דקות על קרח. בסוף הקיבעון, השתמש באותו קצה פיפטה כדי להעביר את הרקמה לתוך באר שלישית המכילה 400 microliters של PBS טרי במשך חמש עד 10 דקות על קרח.

כדי לחסום כל איגוד נוגדנים לא ספציפי, העבר את מתחמי העיניים-מוח ל-400 מיקרוליטרים של PBS בתוספת טריטון X עבור דגירה של 10 עד 60 דקות על קרח. בסוף הדגירה, aliquot 10 microliters של פתרון הנוגדנים העיקרי לתוך המספר הדרוש של בארות של צלחת microwell 72 היטב, ולהשתמש micropipette אוויר תזוזת P10 עם קצה 0.5 מילימטר שונה משומן עם PBS בתוספת טריטון X להעביר לא יותר מחמישה מתחמי עין-מוח ולא יותר משלושה microliters של PBS לתוך כל באר של פתרון נוגדנים. לאחר דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את הדגימות פעמיים 400 microliters של PBS בתוספת טריטון X באר אחת של צלחת זכוכית תשע היטב במשך חמש עד 10 דקות לכל לשטוף.

לאחר הכביסה השלישית, להעביר את הרקמה לתוך 100 microliters של פתרון נוגדנים משני מתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור, הבאים על ידי שלוש חמש עד 10 דקות שוטף ב 400 microliters של PBS בתוספת טריטון X וכביסה אחת PBS. לאחר מכן, לצייד את הדגימות ב 200 microliters של מדיום הרכבה במשך שעה עד שעתיים. בסוף הדגירה, להעביר את הדגימות לשקופית מיקרוסקופ, ולהשתמש מחט טונגסטן חסון להצמיד קומפלקס מוח העין לשקופית תחת מיקרוסקופ מנתח.

לאחר מכן, השתמש מחט טונגסטן בסדר לחתוך כל עין מן האונה האופטית הקשורה שלה לתמרן כל עין אל פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, כך פני השטח הבסיסיים של העין סמוך למגלשה. לאחר מכן, להחיל כיסוי נקי על הדגימות, ולאטום את כיסוי עם לק. כדי להכין רקמת עיניים pupal לניתוח כתם מערבי, הראשון לנתח 10 כדי 16 גלמים כפי שהוכח בעבר בשתי קבוצות, 10 עד 15 דקות זה מזה PBS בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז.

לאחר שטיפה קצרה של מתחמי מוח העין המבודדים פעמיים בארות בודדות של צלחת זכוכית תשע בארות על קרח ב 400 microliters של PBS בתוספת מעכבי, להעביר את כל קומפלקסים המוח העין לתוך 400 microliters של PBS קר כקרח בתוספת מעכבים decanted על צלחת ניתוח שחור נקי. תחת מיקרוסקופ ניתוח נקי, השתמש במחט טונגסטן יציבה ובסכין גילוח דק כדי לחתוך בצורה נקייה כל עין מהאונה האופטית, ולהשתמש בקצה משומן כדי להעביר את מתחמי העיניים-מוח לחמישה מיקרוליטרים של PBS בתוספת מעכבים לצינור מיקרוצנטריפוגה 500 מיקרוליטר על קרח. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של חיץ תזה רקמה מערבית 10 microliters של חיץ דגימת חלבון מרוכז 2X לצינור.

כדי לעבד את קומפלקסים של מוח העין עבור מיצוי RNA, לובש כפפות, לנקות את הספסל, מיקרוסקופ, כלי ניתוח, ומנות ניתוח שחורות עם 70%אתנול ו RNase טיהור ריאגנט. לאחר מתן אפשרות לאזור להתייבש, לנתח סך של 30 עד 40 גלמים בקבוצות של שש עד שמונה. לאחר שכל קבוצה של מתחמי מוח-עיניים נותחו, העבר את מתחמי העיניים-מוח מהמנה בת תשע הבאר ל-400 מיקרוליטרים של PBS טרי, קר כקרח ונטול גרעין על צלחת ניתוח נקייה, ולהשתמש במחט טונגסטן יציבה ובסכין גילוח עדין כדי לחתוך כל עין מהאונה האופטית.

כאשר כל העיניים עבור אצווה הוסרו, להעביר אותם לתוך סטרילי, צינור microcentrifuge ללא RNase, והבזק להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי לפני שתמשיך לקבוצה הבאה. העין הפופאלית היא רקמה נגישה בקלות המשמשת מודל מצוין לחקירת תהליכים התפתחותיים, כולל אלה שמניעים מורפוגנזה. סביב 40 שעות לאחר היווצרות puparium, הסידור הסופי של תאים מושגת.

זהו גיל אידיאלי שבו ניתן להעריך את ההשלכות של מוטציה גנטית או ביטוי גנים מהונדס. לדוגמה, בעקבות ביטוי חוץ רחמי של Diap1, מעכב הליבה של אפופטוזיס, ניתן להשוות את הגידול כתוצאה מכך במספר תאי הסריג לזה שנצפה ברשתית בקרה. אפופטוזיס ניתן גם להעריך באופן ישיר יותר על ידי שימוש בנוגדנים כדי להפעיל קפסת מוות-1 או באמצעות גישות אחרות לגילוי תאים גוססים.

ניתוחים כתם מערבי של ליזטים העין ניתן להשתמש כדי לקבוע את נוכחות או ביטוי יחסי של חלבונים של עניין או להשוות ביטוי חלבון בנקודות זמן התפתחותיות שונות. חשוב לציין שניתוח יותר מ-60 עיניים לכל גנוטיפ או מצב ניסיוני הוא אופטימלי לבודד מספיק רנ"א באיכות גבוהה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי הרשתית pupal הוא שביר מאוד, ויש לנקוט בזהירות רבה במהלך הניתוח שלה כדי להבטיח את שלמותה.