Name: מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו כיצד למדוד יציבות אנזימטית באמצעות טיטור איזותרמי Calorimetry. שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של פעילות האנזים ומצריכה פחות שעות עבודה מבדיקות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת דוגמאות
<ol><li>
1,000 מ ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר ב- pH 4.6
	<ol>
<li>למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל סיים את לימודיו.</li>
		<li>שוקל 8.2 גר' נטול מים סודיום אצטט ולהוסיף אותו הספל.</li>
		<li>מניחים את הספל על צלחת stir, למקם את מוט מערבבים הספל, להפעיל את הצלחת מערבבים ומביאים לרתיחה עד התפרקה לחלוטין.</li>
		<li>כאשר נטול מים סודיום אצטט התפרקה לחלוטין, למדוד את ה-pH של התמיסה עם מד pH מכוילת.</li>
		<li>להוסיף 1 M HCl או NaOH בהתאם להשגת רמת ה-pH 4.6 הרצוי.</li>
		<li>להוסיף מים מזוקקים עד שאמצעי האחסון סך 1,000 מ.</li>
		<li>לאחסן בטמפרטורת החדר עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אנזים פתרון
	<ol>
<li>הכינו 10 מ"ל של הגליל פתרון בטווח 10-30 מ"ג/מ"ל על ידי הראשון מ 8 מדידה ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 ב 15 מ"ל סיים את האנזים.</li>
		<li>הוסף את בופר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם אנזים ומנערים נמרצות עד האנזים יש התפרקה.</li>
		<li>מוסיפים עוד בופר עד שאמצעי האחסון הכולל 10 מ"ל.</li>
		<li>לאחסן את הפתרון אנזים ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פתרון המצע
	<ol>
<li>כדי להכין פתרון המצע בטווח 300-600 מ מ, לחשב את כמות המצע הדרושים גרמים. כדי לעשות את הריכוז הרצויה.</li>
		<li>שוקל את המצע ומניחים לתוך גביע זכוכית 100 מ</li>
		<li>למדוד 20 מיליליטר בופר באמצעות צילינדר 25 מ ל סיים את לימודיו ולאחר מכן להוסיף זה כוס זכוכית.</li>
		<li>מניחים את הספל על צלחת מערבבים ומניחים מוט מגנטי מערבבים לתוך הספל. להדליק את החימום ולהתאים את המהירות מלהיב בהתאם.</li>
		<li>אפשר לערבב להמשיך עד המצע יש התפרקה.</li>
		<li>שופכים את הפתרון המצע לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 עד שאמצעי האחסון הכוללת 45 מ. מערבבים ע י ניעור.</li>
		<li>לאחסן את הפתרון המצע בטמפרטורת החדר עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ביצוע הניסוי
<ol><li>הכנת הכלי ITC<ol>
<li>ודא כי התא הפניה נטען עם 350 µL של מים מזוקקים. לפני טעינת האנזים לתוך התא לדוגמה, ודא כי התא מדגם נוקה.</li>
		<li>ניקוי פרוטוקול-מילוי המזרק טעינה עם 500 µL של 2% לניקוי (טבלה של חומרים), בזהירות את המחט לתוך התא מדגם, למלא את התא, הסר את הנוזל בעזרת המזרק באותו. השלך את הנוזל לתוך גביע. חזור על שלב זה פעמיים עם 2% לניקוי (טבלה של חומרים), שלוש פעמים עם אתנול 70% ולאחר מכן לשטוף 10 פעמים עם מים מזוקקים.</li>
		<li>למלא את המזרק טעינה עם 450 µL של אנזים פתרון, בזהירות את המחט כל הדרך עד לתחתית התא מדגם והקש על הבוכנה עד לקו µL 100 באיטיות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.</li>
		<li>לשטוף את המזרק טיטור 50 µL עם מים מזוקקים שלוש פעמים על-ידי הצבת את מחט לתוך מים לאט תופס את המים לתוך המזרק, ואז מחלק את המים לתוך מיכל פסולת.</li>
		<li>להסיר שאריות מים על ידי שטיפה עם המצע פתרון שלוש פעמים.</li>
		<li>למלא את המזרק טיטור המצע פתרון על ידי ציור הפתרון עד המזרק מלא ללא כל בועות אוויר.</li>
		<li>עם המזרק עדיין בפתרון המצע, להסיר את הבוכנה ולאפשר כ 2 µL של אוויר כדי להזין העליון של המזרק והכנס הבוכנה.</li>
		<li>הסר את ידית buret המרכז לטניס בישראל, למקם את המזרק בתוך הידית buret ולהתעסק עד חזק.</li>
		<li>לנגב את קצה בחישה עם טישו נטולת מוך, ואז בזהירות למקם את ידית buret לתוך המכשיר ITC ונעל אותה במקום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הגדרת ITCrun
<ol><li>במחשב, לפתוח ITCrun ולחץ על ' הגדר'.</li>
	<li>לחץ על ערבוב קצב והגדר 350 סל"ד. בדוק את גודל מזרק (µL) ולהבטיח שזה ב- 50 µL.</li>
	<li>הגדר את הטמפרטורה ולחץ על ' עדכון'. מומלץ כי שלב זה ניתן לבצע לפחות שעה לפני הכנת את המרכז לטניס בישראל. דבר זה מאפשר מספיק זמן עבור כלי לחמם או לקרר כנדרש.</li>
	<li>עבור הגדרת הניסוי, בחר טיטור מצטבר.</li>
	<li>לחץ על הוסף כדי להתקין את הזריקות. להתאים את מרווח הזמן של הזרקת כדי 5,400 s, נפח הזרקה (µL) ועד 4 מספר זריקות ל- 4. לחץ על אישור כדי לאשר את הגדרות.</li>
	<li>תיבת Equilibration, בחר equilibrate אוטומטי גדול צפוי מחממת. (אם מחממת הצפוי הם קטנים, אחד באפשרותך לבחור קטן תחת מחממת הצפוי; עם זאת, זה יגביר את הזמן equilibration).</li>
	<li>להגדיר את התוכנית הבסיסית הראשונית ל-300 s.</li>
	<li>להתחיל לרוץ, לחץ על להתחיל סמל ליד קצב ערבוב ולאחר מכן לחץ על התחל אשר נמצא ליד סמל מפתח הברגים.</li>
	<li>שמור את הקובץ ולאפשר את המכשיר להפעיל.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את הקובץ ב- NanoAnalyze. לחץ על נתונים ובחר עמודות נתונים.</li>
	<li>בחר את כל הנתונים, העתק ולאחר מכן הדבק את הנתונים ל- Microsoft Excel.</li>
	<li>להתאים אפס בסיסית על-ידי הוספת הערך הנדרש 300 s כדי שזה אפס. להחיל את התיקון על העמודה כולה מערכי שיעור חום.</li>
	<li>למצוא את הערך המינימלי או המקסימלי של שער חום עבור כל זריקה באמצעות המשוואה: =MIN(cell:cell) או MAX(cell:cell). כל נקודת נתונים מייצג הפעילות האנזימטית מתרחשת שיא של האנזים אצל כל זריקה.</li>
	<li>מגרש גרפים של ערכי מינימום או מקסימום נגד הזמן שבו הערך אירעה בעת טיטור.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

היתרון העיקרי של ITC אנזים יציבות וזמינותו המתוארים כאן הוא אוטומציה. לאחר כל מאגרי המתאים ואת פתרונות נעשים, הגדרת זמן עבור כל assay הוא כ 15 דקות עבור האדם עושה את הבדיקה. לעומת זאת, מבחני קונבנציונליים עבור אינוורטאז ופעילות לקטאז דורשים בערך 2 h עם מעורבות מתמדת של האדם עושה את הבדיקה ולקחת הרבה פעילות אנזימטי מבחני הוקטנה באופן משמעותי יותר. בפרסום הקודם, הראו כיצד הנתונים מן השיטה ITC משתווה שיטה spectrophotrometric מסורתיות יותר של פעילות אינוורטאז11.
יתרון נוסף ...

אנזימים הם חלבונים מסוגל ותזרז מגוון רחב של תגובות אורגני. הפונקציה אנזימים רוב ב תמיסה מימית-ליד ה-pH נייטרלי וכך למנוע את השימוש בממיסים קשים. בגלל סלקטיביות גבוהה שלהם, אנזים מזורז ותגובות לייצר פחות (בחלק מהמקרים אין תוצרי לוואי) תוצרי לוואי מאשר זרזים לא בררניים כגון חומצות ובסיסים1. זה רלוונטי בעיקר בייצור מזון שבו כל תגובות כימיות חייב להיעשות כך המוצר הסופי הוא בטוח לצריכה אנושית. כיום, אנזימים משמשים להפקת פרוקטוז גבוהה סירופ תירס2, גבינה3, בירה4, לקטוז חלב5ומוצרי מזון חשוב. בעוד מאמר זה מתמקד אנזים לשימוש בתעשיית המזון, ישנם שימושים רבים ומגוונים עבור אנזימים כולל סינתזה התרופות, כימיה ירוקה.
השירות של אנזימים הוא מוגבל על ידי היציבות של פעילות אנזים, אשר תלויה שמירה על מבנה תלת-ממדי של האנזים. מבנה האנזים יכול התייצב על-ידי שינויים כגון PEGylation6, קיבעון על תמיכה מלאה7, שינויים גנטיים8ו פורמולציות. כיום, אנזים יציבות נמדד בדרך כלל על ידי calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), פעילות אנזים הקצה של מבחני9. DSC מודד את הטמפרטורה שבה מתגלה אנזים; גבוה יותר הטמפרטורה, המבנה יציבים יותר. עם זאת, אובדן של פעילות מתרחשת לעיתים קרובות בטמפרטורה נמוכה יותר מהנדרש כדי לגולל את אנזים או תחומים בתוך ה אנזים10. לכן, DSC אינה מספיקה לקבוע אם השינוי האנזים מגדילה את היציבות של פעילות אנזים. הקצה של אנזים מבחני הן בדרך כלל זמן אינטנסיבי, דורשים דוגמאות מרובות, לעתים קרובות כרוך תגובה ערכי צבע מוחלטים בשילוב אינה ישימה פתרונות מאוד צבעוניים או אטום או המתלים.
עבודה זו מדגימה שיטה למדידה ישירה היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). המרכז לטניס בישראל מודד את הקצב של חום שוחררו או נספג במהלך תגובה. מאז כמעט כל התגובות לייצר או קולטים חום, ITC יכול לשמש עבור רוב התגובות מזורז-אנזים, לרבות תגובות לא תגובה בשילוב או להופיע בתקשורת אטומים כגון חלב. ITC שימש במשך עשורים רבים כדי למדוד פרמטרים כימיים קינטי עבור סוגים רבים של תגובות, אבל פרוטוקול המובאת כאן מתמקד בשימוש ITC כדי למדוד את קצב חום שיא של תגובות מזורז-אנזים ומדגים כי פעילות אנזים הוא באופן ליניארי בקורלציה עם שיעור שיא החום. ITC מדידות של שיא החום המחירים בעיקר אוטונומי, דורשים מעט מאוד זמן צוות ההתקנה ולנתח.

<table><tbody><tr><td>א-לקטוז</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>לא ידוע (ישן מדי)</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן אצטט, נטול מים 99% דקות</td><td>אלפא Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250 גרם</td></tr><tr><td>לקטאז&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוקולרית 5 גרם, 1N&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>SA48-500</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>מד ספסל- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>מיקרו-90</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1 ליטר (תמיסת ניקוי)</td></tr></tbody></table>

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

עבודה זו מדגימה שיטה חדשה למדידת את היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). קצב חום שיא נצפתה לאחר זריקה אחת של הפתרון המצע לתוך פתרון אנזים הוא מתואם עם פעילות אנזים. זריקות מרובות של המצע לתוך אותו אנזים פתרון לאורך זמן להראות את אובדן פעילות אנזים. וזמינותו הוא אוטונומי, הדורשות כוח אדם מעט מאוד זמן, והוא החלים על מרבית התקשורת ואנזימים.

התוצאות נציג איור 1 , איור 5 הצג נתונים שני אנזימים, לקטאז, אינוורטאז. לקטאז, אינוורטאז לעודד את הידרוליזה של דו-סוכר לתוך שני monosaccharides, endothermically, exothermically, בהתאמה. שתי תגובות אנזימטיות נוהלו בריכוזים אשר מנעה הרוויה של האנזים.
הנתונים לקטאז להדגים כיצד ניתן להשתמש ITC נתונים להערכת יציבות אנזים. ארבעה רציפים 4 µL זריקות של 600 מ מ לקטוז (איור 1), היו טיטרציה לתוך 20 מ"ג/מ"ל לקטאז. מרו...

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

שימוש באנזימים כזרזים בתגובות יכול להפחית את כמות האנרגיה הדרושה לתגובה, ולהפחית תוצרי לוואי רעילים. עם זאת, השימוש באנזימים בתעשייה מוגבל, כי אנזימים אינם יציבים והוא יכול להיות יקר. פרוטוקול זה יכול להפחית את משך הזמן שלוקח לקבוע אם התנאים מזיקים לפעילות האנזים, או אם שינויים באנזים הגדילו את יציבותו.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת פחות שעות אדם מאשר מראי יציבות אנזימים מסורתיים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מגוון רחב של אנזימים כי זה יכול לשמש עם כל תגובה המשחררת או סופג חום. כדי להתחיל, להכין 0.1 מאגר נתרן אצטט טוחן.מידה 800 מיליליטר של מים מזוקקים ב 1, 000 מיליליטר סיים את הבקבוק. לאחר מכן, לשקול 8.2 גרם של אצטט נתרן נטול מים, ולהוסיף אותו לקוסם. מניחים את הסקילר על צלחת ערבוב.מניחים מוט ערבוב לתוך המק, ומדליקים את צלחת הערבב כדי לערבב אותה עד להמסה מוחלטת. כאשר אצטט נתרן נטול מים מומס לחלוטין, השתמש במד pH מכויל כדי למדוד את ה- pH של הפתרון. השתמש פיפטה להוסיף 1 חומצה הידרוכלורית טוחנת או נתרן הידרוקסיד בהתאם כדי לקבל את ה- pH הרצוי ב 4.6.מוסיפים מים מזוקקים לתוך המזווה עד שהנפח הכולל מגיע ל-1,000 מיליליטר. כדי להכין את פתרון האנזים, בצילינדר בוגר 15 מיליליטר, למדוד 8 מיליליטר של חיץ אצטט נתרן טוחן 0.1. לאחר מכן, מוסיפים את תמיסת החיץ לצינור חרוטי 15 מיליליטר עם אנזים, ומנערים במרץ עד שהאנזים מתמוסס.הוסף פתרון מאגר נוסף עד שאמצעי האחסון הכולל יגיע ל- 10 מיליליטר. יש לאחסן את תותב האנזים ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין את פתרון המצע, לשקול את המצע, ולמקם אותו לתוך זכוכית 100 מיליליטר.השתמש גליל מדורג כדי למדוד 20 מיליליטר של פתרון החיץ, ולאחר מכן להוסיף אותו זכוכית. מניחים את המק על צלחת ערבוב, וממקם מוט ערבוב מגנטי לתוך המק. מפעילים את החום, ומתאימים את מהירות ההתערבבות בהתאם.אפשר ערבוב להמשיך עד המצע נמס. יוצקים את פתרון המצע לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר, ומוסיפים את מאגר אצטט נתרן שהוכן בעבר, עד נפח הכולל הוא 45 מיליליטר. לנער את הצינור כדי לערבב.אחסן את פתרון המצע בטמפרטורת החדר עד לשימוש. במחשב, פתח את ITC Run ולחץ על תוכנית ההתקנה. לחצו על קצב ערבוב והגדירו ל-350 סל"ד.בדוק את גודל המזרק הוא ב 50 microliters. הגדר את הטמפרטורה ל 55 מעלות צלזיוס, ולחץ לעדכן. המתן לפחות שעה אחת לפני שתמשיך, כדי לאפשר מספיק זמן עבור מכשיר ITC להתחמם או להתקרר לפי הצורך.לפני טעינת האנזים, ודא שתא הייחוס טעון ב-350 מיקרוליטרים של מים מזוקקים. כדי לנקות את תא המדגם, מלא את מזרק הטעינה ב- 500 מיקרוליטרים של תמיסת ניקוי של 2 אחוזים. בזהירות להכניס את המחט לתוך תא המדגם, למלא את התא, לאט להסיר את הנוזל באמצעות אותו מזרק.השלך את הנוזל לתוך מקור. חזור על שלב זה פעמיים עם 2 אחוז פתרון ניקוי, שלוש פעמים עם 70 אחוז אתנול, ולאחר מכן לשטוף עשר פעמים עם מים מזוקקים. לאחר ניקוי תא הדגימה, מלאו את מזרק הטעינה ב-450 מיקרוליטרים של תמיסת אנזימים.בזהירות להכניס את המחט כל הדרך לתחתית תא המדגם, ולאט לאט ללחוץ על הבוכנה עד לקו 100 microliter כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. לאחר מכן, לשטוף את 50 מזרק טיטרציה microliter עם מים מזוקקים שלוש פעמים על ידי הצבת קצה המחט לתוך המים לאט לקחת את המים לתוך המזרק, ולאחר מכן מחלק את המים לתוך מיכל פסולת. יש לשטוף בתסיכת המצע שלוש פעמים כדי להסיר שאריות מים.לאחר מכן, למלא את מזרק ציטריות עם פתרון מצע על ידי ציור הפתרון עד המזרק מלא ללא בועות אוויר. כאשר המזרק עדיין בתסמת המצע, הסר את הבוכנה, ואפשר לכ-2 מיקרוליטרים של אוויר להיכנס לראש המזרק, ולהכניס מחדש את הבוכנה. הסר את ידית הבורט של ה- ITC, מקם את המזרק בתוך ידית הבורט והברג עד להדק.נגב את קצה מזרק התיסוס עם רקמה נטולת מוך, ולאחר מכן מקם בזהירות את ידית הבורט לתוך מכשיר ITC, ונעל אותו במקומו. עבור התקנת הניסוי, בחר טיטריות מצטברת. לחץ על הכנס כדי להגדיר את הזריקות.התאימו את מרווח ההזרקה ל-5, 400 שניות, נפח ההזרקה ל-4 מיקרוליטר ומספר הזריקות לארבע. לחץ על אישור כדי לאשר את ההגדרות. בתיבת האקוויוויבלציה, בחר שיווי משקל אוטומטי וחום צפוי גדול.הגדר את תוכנית הבסיס ההתחלתית ל- 300 שניות. כדי להתחיל את הריצה, לחץ על סימן ההתחלה לצד קצב ערבוב ולאחר מכן לחץ על התחל, הממוקם ליד סימן מפתח הברגים. שמור את הקובץ ואפשר לכלי לפעול.כדי לנתח נתונים, פתח את הקובץ בניתוח ננו. לחץ על נתונים ובחר עמודות נתונים. בחר את כל הנתונים, העתק ולאחר מכן הדבק את הנתונים ב- Microsoft Excel.התאם תוכנית בסיסית 0 על-ידי הוספת הערך הנדרש ב- 300 שניות כדי להפוך אותה ל- 0. החל תיקון זה על העמודה כולה של ערכי קצב החום. לאחר מכן, תרשים תרשים של ערכי המינימום או המקסימום כנגד הזמן שבו הערך התרחש במהלך ההקצבה.בפרוטוקול זה, עקבות נתונים ITC של פעילות לקטאז מוצג עם ארבע זריקות רציפות של לקטוז לתוך פתרון לקטאז ב pH 4.6 חיץ ב 55 מעלות צלזיוס, 45 מעלות צלזיוס, 35 מעלות צלזיוס, ו 25 מעלות צלזיוס. בקרת אנזים לא בוצעה ב 55 מעלות צלזיוס לחום של ערבוב. עבור כל זריקה של אנזים, יש חום אקסותרמי ראשוני של ערבוב, ולאחר מכן, הידרוליזה אנדותרמית לקטאז של לקטוז מתרחשת עד שהתגובה הושלמה, וקצב החום חוזר לקו הבסיס.שיא אנדותרמי מינימום בעקבות כל זריקה, הוא קצת פחות מאשר הזריקה הקודמת בגלל הירידה של פעילות אנזימטית. כצפוי, יציבות האנזים עבור כל זריקה פוחתת עם עליית הטמפרטורה. ניסוי הבקרה מראה שפעילות לקטאז ב-25 מעלות צלזיוס הייתה ירידה של 8 אחוז בפעילות האנזים, עקב דילול לאחר ארבע זריקות.בהתחשב בזריקה הרביעית מראה ירידה של 73 אחוזים בהתמדה, אובדן בפועל של פעילות האנזים היה אפוא 65 אחוזים. לכן, דילול לקטאז נבע מכל זריקה, היה השפעה קטנה יחסית של 11 אחוז על פעילות האנזים. חשוב כי המאגר המשמש כדי להפוך את האנזים ופתרונות מצע מותאמים קרוב ככל האפשר.חוסר התאמה של pH או ריכוז יכול לגרום לחום גדול יותר של ערבוב אשר יכול להסוות את חום התגובה. אתה יכול ליישם פרוטוקול זה כדי לחקור אנזימים ולקבוע את יציבותם על ידי מדידת קצב החום ששוחרר או נספג במהלך תגובה.

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

קח דילולים סדרתיים של תרבית חיידקים והוסף אליקוטים לבקבוקונים קלורימטריים המכילים מצע גידול.טען את הבקבוקונים האטומים לצלחת מרובת הבארות של מיקרוקלורימטר איזותרמי כדי למדוד את ייצור החום המטבולי.המכשיר מוחזק בטמפרטורה קבועה כדי להבטיח שהחום שזוהה מקורו אך ורק בחילוף החומרים של החיידקים.כאשר חיידקים מפרקים חומרים מזינים ומתרבים, הם משחררים חום שחיישנים מזהים בזמן אמת.במקביל, דגרו בקבוקונים זהים באינקובטור. בעזרת ספקטרופוטומטר, מדוד את הצפיפות האופטית (OD) כדי לנטר את צמיחת החיידקים.באמצעות...

מיקרוקלורימטריה איזותרמית לניטור פעילות מטבולית בחיידקים

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

פרוטוקול מוצג כדי לבדוק במהירות את יציבות תרמית של חלבונים במגוון תנאי באמצעות shift תרמי מבחני וננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry. הכוללת שלושה ייחודי יציבות מסכי, הם לבדיקה מאגר מערכות, מלחים, תוספים, יחד עם חלבונים כדי לזהות מאגרים מתאימים עבור לימודי המבנית תפקודית.

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

בצמחים מדידה של שטפי חומרים מזינים ורעלים חיונית לחקר תזונת הצמח ורעילותו. כאן, אנו מכסים פרוטוקולי רדיו-מעקב לקביעת זרם ופליטה בשורשי צמחים שלמים, תוך שימוש בשטפי אשלגן (K+) ואמוניה/אמוניום (NH3/NH4+) כדוגמאות. נדונים יתרונות ומגבלות של טכניקות כאלה.

מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

למדו כיצד למדוד יציבות אנזימטית באמצעות טיטור איזותרמי Calorimetry. שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של פעילות האנזים ומצריכה פחות שעות עבודה מבדיקות מסורתיות.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

גלה סרטונים נוספים