לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה
28 באוגוסט 2019
פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.
פרוטוקול זה מקל על השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עבור יישומי סינון תוכן גבוה. זה מתאים במיוחד עבור לתעתע סינפסות, אשר בנוירונים אנושיים דורשים תקופות תרבות ארוכות. אנו מדגימים את ההחזרה של נוירונים ממנות בפורמט גדול לתוך בארות מרובות תואמות HCS באופן המשמר את הכדאיות שלהם.
בניגוד אינטואיטיבי, אנו מראים כי הרחבת דגירה פרוטאז לפני resuspending ו replating מניב הישרדות עצבית משופרת. תאי עצב אנושיים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים רלוונטיים יותר ויותר בתחומים של מחקר בסיסי, פיתוח תרופות ורפואה ניוונית. ניתן להשתמש בשיטת טיטורציה עדינה זו כדי לעכל מחדש כל שכבה מונו-שכבתית גדולה של תאים שיש להם רשת עבה של תהליכים.
בנוסף iPSCs אנושי, זה יכול לשמש כדי להתגמש תרבות של נוירונים ראשוניים או כדי resuspend אותם עבור מיון עובדות או רצף תא יחיד. חשוב לעקוב אחר שלבי הפרוטוקולים בזהירות ולעתים קרובות לפקח על הניתוק מתווך פרוטאז של הנוירונים מהצלחת. זמן הדגירה האופטימלי עשוי להשתנות, בהתאם לתרבות.
הדגמה חזותית מאפשרת אפילו לחוקרים לא מנוסים לשחזר הליך זה. התחל על ידי שטיפה עדין את הצלחת של נוירונים מובחנים עם PBS. לפזר את PBS במורד הקיר של הצלחת ולא ישירות על התאים, כדי למנוע שיבוש אותם.
שאף את ה- PBS מקצה המנה תוך כדי הטיה, תוך כדי שהוא דואג לא לגעת בתאים. יש למרוח לפחות מיליליטר אחד של אנזים פרוטאוליטי לכל צלחת של 10 ס"מ. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך 40 עד 45 דקות.
במהלך הדגירה, לבדוק נוירונים על מיקרוסקופ ניגודיות בשלבים ולהמשיך את הטיפול פרוטאז עד הרשת העצבית מתנתק לחלוטין מהצלחת ומתחיל להתפרק. כאשר הנוירונים התנתקו, להפסיק את העיכול על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיה DEMEM טרי עבור כל מיליליטר אחד של פרוטאז. השתמש פיפטה סרולוגית בעדינות titrate התאים נגד הצלחת חמש עד שמונה פעמים, הקפדה לא להחיל יותר מדי לחץ.
מסננים את התאים דרך רשת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, טיפה אחר טיפה. ולשטוף את מסננת עם חמישה מיליליטר נוספים של מדיה DMEM טרי. השתמש בצנטריפוגה ספסל העליון לסובב את התאים למטה ב 1000 פעמים G במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, להחזיר את הצינור חרוט לארון biosafety ושואף את רוב התקשורת, עוזב 250 microliters כדי לשמור על התאים לחים. בעדינות resuspend התאים בשני מיליליטר של מדיה DMEM טרי ואז להעביר אותם דרך הסוף של פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר. לבסוף, להפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים.
השתמש בהמוציטומטר וכחול טריפן כדי לספור את התאים קיימא. ואז DMEM לריכוז הרצוי. הוסף תוספי תזונה מתאימים לצינור, בהתאם לדרישות של קו התא הספציפי בעדינות לערבב את התאים על ידי הטיית הצינור חרוט פעמיים עד שלוש פעמים.
שאפו ציפוי למינין מצלחת של 24 באר ושטוף אותו פעם אחת עם PBS. שאף PBS. ולהחיל פתרון תא על כל באר בתנועה איור שמונה כדי למנוע גושים.
בסיום ציפוי התאים, החזירו את הלוחית לאנקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בקצרה מערבולת פתרון המניות של כתב מוות התא מוקדם ולהוסיף אותו ל בארות על פי הוראות כתב היד. חכה 20 דקות.
ואז תדמיין את התאים החיים והמתים על בארות מרובות תחתיות זכוכית. הארכת הדגירה פרוטאז מאפשר התרופפות של הרשת העצבית בתוך גיליון הרים של תאים. התוצאה היא מוות תאי מופחת בזמן הדיסוציאציה, כמו גם תוצאות התאוששות יעילה יותר בימים הבאים.
באמצעות הליך הדגירה המורחב של האנזים, התרבויות מציגות הכפלה משוערת של הכדאיות התאית בימים שלאחר ההתחדשות וצפיפות נמוכה יותר של תאים מתים או גוססים. שלב המעבר של הבידול העצבי מתרחש במשך מספר ימים, שבמהלכם התאים מבטאים בהדרגה סמנים עצביים בשלב מאוחר. סמנים אלה מזוהים מיד בתרבויות שהתרבו לאחר ארבעה שבועות של התברואה מוקדמת.
פרוטוקול הפרוטאז המורחב גם משפר במתינות את הצמיחה של הנוירידים. הן אורך neuride הכולל ואת הצמיחה דנדריט משופרים. Replating שימושי גם ללימוד סינפסות.
שבוע בלבד לאחר ההצבה, נצפו סמנים לחלבונים לפני ואחרי הסינפטיה. יתר על כן, פעילות חשמלית של דפולריזציה ספונטנית וארמים מונעים סינפטית ניתנת לגילוי באמצעות הדמיית סידן או מערכים רב-חשמליים. הליך חזור זה יכול להיות מותאם לסוגים רבים של יישומים.
בנוסף סינון תוכן גבוה כדי לזהות תרכובות טיפוליות פוטנציאליות, זה יכול לשמש הדמיה קונוסים צמיחה או הקלטות מערך multielectrode. דיסוציאציה מכנית של נוירונים שכבר יצרו תהליכים ארוכים היא מלחיצה. דגירה אנזימטית מוארכת וגירוי עדין של תאים הם צעדים חיוניים להצלחת הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר נוהל לחידוש השעיה ולגידול נוירונים שמקורם בתאי גזע אנושיים שהתבדלו in vitro. השיטה מאפשרת מבחני הדמיה של נוירונים, סינפסות ומרכיבי נוירונים, המתאימים ליישומי סינון תוכן גבוה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות תרבית תאים
רקע
- נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הם קריטיים לחקר סינפסות.
- נוירונים אלו דורשים תקופות תרבית ארוכות להתבגרות.
- שיפור חיוניות הנוירונים במהלך התרבות הוא חיוני למבחנים מדויקים.
- הנוהל משפר את התאוששות התאים ואת חיוניותם לאחר ההשעיה מחדש.
מטרת המחקר
- ליצור שיטה אמינה לגידול נוירונים שמקורם בתאי גזע אנושיים.
- להדגים השעיה מחדש יעילה לסינון תוכן גבוה.
- לייעל את זמן הדגירה של הפרוטאז לבריאות תאים משופרת.
שיטות ששימשו
- שיטת תרבית תאים שכוללת נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
- השתמשו בטיפול פרוטאז מפורט לניתוק עדין של התאים.
- שילבו בדיקות חזותיות כדי לפקח על ניתוק הנוירונים במהלך הפרוטוקולים.
- עקבו אחר לוח זמנים קפדני לתהליכי דגירה והשעיה מחדש.
- השיטה היא מתאימה לסוגים אחרים של נוירונים ויישומים.
תוצאות עיקריות
- דגירה ממושכת של פרוטאז שיפרה את הישרדות הנוירונים והפחיתה את מוות התאים.
- הוכחה צמיחה משופרת של הנוירונים וחיוניותם בימים רבים לאחר ההשעיה מחדש.
- מרכיבי חלבונים סינפטיים נצפו תוך שבוע מההשעיה מחדש.
- פעילות חשמלית הייתה ניתנת לזיהוי, מה שמצביע על רשתות נוירונים תפקודיות.
מסקנות
- המחקר מספק פרוטוקול ניתן לשיחזור לתרבית נוירונים וליישומים של מבחנים.
- הישרדות משופרת וצמיחת נוירונים מאפשרים מחקר נוסף על תפקודיות נוירונים.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנונים נוירונים ודרכים טיפוליות אפשריות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
