מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

תה הוא אחד המשקאות הפופולריים ביותר ברחבי העולם. חומרי הדברה משמשים לעתים כדי להגן על צמחי תה מפני מזיקים. כמה חומרי הדברה מערכתיים עשויים להיעשות על ידי אנזימים בעץ התה.

ולאחר מכן משולב באמצעות חמצון, הידרוליזה, או הפחתת תגובות. תרבות השעיה של תאי צמחים יכולות לשמש, בקלות, כדי לחקור את התנהגות חילוף החומרים של חומרי הדברה. לשיטה זו יש מספר יתרונות.

ראשית, ניתן להפעיל אותו בתנאים של מיקרואורגניזמים חופשיים, ובכך למנוע את ההפרעה של השפלת חומרי ההדברה הנגרמת על ידי מיקרואורגניזמים. שנית, הוא יכול לספק לנו חומר קבוע בכל עת. לבסוף, זה יכול לשמש גם בקלות כדי להשוות תיאוריות של התנהגות חומרי הדברה בניסוי אחד.

במחקר זה, אנו קובעים תרבויות השעיה תא תה מצבים משתנים של עלי תה. מצב התרבויות האופטימליות של השעיות תאים שימש אז להשוואת התנהגות ההתפוגגות של שישה חומרי הדברה. ניסוי זה יתבצע על ידי ג'יאו ויינג וגה גואקין.

אלה צמחי התה הסטריליים שלנו שעובדים כמקור לתה. חותכים לאורך הכנף האמצעית של עלה סטרילי באמצעות מספריים. ואז, לחלק כל חצי לחתיכות קטנות של כ 0.3 פעמים 0.3 ס"מ בצלחת פטרי.

מניחים את המזיקים הסטריליים על גבי מדיום חזותי של MS המכיל 2, 4-D ו- KT. שישה explants ניתן להציב בבקבוק 300 מיליליטר. תרבות העלה מתפוצץ בטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 28 ימים, בחר את הדור הראשון של callus המושרה ולאחר מכן להעביר בקבוק טרי.

לרכוש את callus רופף ומשתנה לאחר שלוש עד ארבע תת תתי תתי. חותכים את הגדולים, יבלות משתנות ומשוחררות מהמדיום המוצק לחתיכות קטנות באמצעות להב כירורגי סטרילי בתנאים סטריליים. אנחנו בערך שלושה גרם של חתיכות קטנות של קאלוס.

מקם את ה Callus לתוך B5 המכיל 2, 4-D ו KT. תרבות השעיית התא הנוזלי בטמפרטורה קבועה באינקובטור הרועד בחושך. לאחר שבעה עד עשרה ימים של פולחן, להסיר את בקבוק התרבות, ולהשאיר אותם לעמוד במשך כמה דקות. קח את העל-טבעי כמעים כאן יאלץ את התרבות למדיום טרי.

הסר את היבלות הגדולות המזרזות. השג את תרבות השעיית התאים המטופחת הסופית לאחר ארבעה עד שלושה מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד. שמור מדגם של תאים חיים ב 100 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות כתם תא הבקרה לפני כתמי הכדאיות.

צנטריפוגה כל תרבות ההשעיה התא במשך שמונה דקות ב 6, 000 G.Remove את supernatant לפני השעיית התאים לתוך 5 מיליליטר של חיץ PBS וללחוץ אותו במשך דקה אחת ביד. הוסף 2.5 מיליליטר של פתרון TTC וללחוץ ביד שוב. דוגרים את התערובת במשך שעה באינקובטור עומד ב 13 מעלות צלזיוס.

הוסף aliquot של ארבע מאות microliters על התצוגה כדי לעקר את פתרון המניות של כל neonicotinoids Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid, ו Imideproxase. הכל לשלב הראשון האורגני. דימתואט ו omethoate לתוך תרבויות השעיית התא בהתאמה.

דגימות תרבות של השעיות תאים עם קוטלי חרקים בטמפרטורה קבועה, ומהירות אינקובטור רועדת. קח את הדגימות בימים שונים. כדי לבדוק את המדגם המכיל neonicotinoid, להסיר aliquot 1 מיליליטר של תרבות התא הומוגנית.

מניחים אותו לתוך צינור צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה אותו ב 4, 000 G במשך שתי דקות. העבר את העל-טבעי דרך קרום מסנן מיקרומטר 0.22 לפני ניתוח על-ידי HPLC-UV ו- UPLC QTOF. כדי לבדוק את הדגימה, המשך בשלב הראשון האורגני.

הסר aliquot 500 microliter של תרבות התא וממקום לתוך צינור צנטריפוגה 35 מיליליטר או צינור צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מיליליטר. הוסף 0.1 גרם של נתרן כלורי וחמישה מיליליטר לחלץ ממס לתוך צינור צנטריפוגה 35 מיליליטר של 500 דגימות microliter. מערבולת את התערובת לדקה אחת.

ואז לאפשר להם לנוח במשך 10 דקות. קח 2.5 מיליליטר של על טבעי לתוך צינור זכוכית 10 מיליליטר להתאדות כמעט יובש באמצעות אידוי חנקן ב 14 מעלות צלזיוס. ממיסים את השאריות עם אצטון מיליליטר אחד.

מערבולת למשך דקה אחת, להעביר אותו דרך קרום מסנן מיקרומטר 0.22 לפני ניתוח על ידי GC-FPD. שים חמישה צמחים בארבעה סירי פלסטיק ליטר במשך חמישה עשר ימים. הוסף אפס מיקרוגרם למיליליטר או 100 מיקרוגרם למיליליטר של Thiamethoxam או dimethoaxe לתוך סירי פלסטיק, בהתאמה.

הכן את דגימת הצמח שלם על פי השיטה הקודמת, למעט השרייה מראש ולאחר מכן לנתח על ידי ספקטרומטריית מסה Orbitrap. השתמש HPLCUV כדי לזהות את התוכן ואת המוצרים המטבוליים של Thiamethoxam ו Acetimoprid באורך גל של 254 ננומטר, של Imidacloprid ו Imideproxase ב 270 ננומטר. זהה את התוכן של דימתוט ו omethoate על ידי GC-FPD באמצעות עמודה צינורית.

לזהות את המטבוליטים של קוטלי חרקים בתרבות התא באמצעות QTOF UPRC עם טור פחמן-18. לזהות את המטבוליטים של קוטלי חרקים בתמצית צמח הבדיקה באמצעות ספקטרומטריית מסת UPLC Orbitrap. ה callus של צמח סטרילי אחד יש זיהום נמוך יותר השחמה אבל אינדקטיביות גבוהה יותר כי זה של callus מעלי תה הרים.

ה callus נגזר עלים סטריליים היה תמיד צהבהב בהיר, בעוד callus נגזר עלים הרים היה לבן עם כתמים חומים. כאשר ריכוז KT היה 0.1 מיליגרם לליטר, callus היה צהבהב בצבע רופף במרקם. קצב הגידול של קאלוס היה הגבוה ביותר, עד 61.5% כאשר הריכוז של 2, 4-D היה מיליגרם אחד לליטר עם ריכוז של KT היה 0.5 מיליגרם לליטר.

נתוני הצמיחה של callus היה הטוב ביותר ואת קצב הצמיחה של callus היה הגבוה ביותר הגיע 46.9%לכן, השילוב הטוב ביותר של צמח homent היה מיליגרם אחד לליטר של 2, 4-D ו 0.1 מיליגרם לליטר של KT לצמיחה callus תה. ה Callus כיסה לחלוטין את העלים על ידי תת תרבות הרביעית, וכאשר מחזור תת תרבות היה 28 ימים. ה Callus גדל במרץ עם צבע צהבהב ומרקם רופף ללא השחמה.

לאחר השוואת הנתונים ברוטו של callus ואת הצבע של השעיית התא, המדיום נוזלי B5 היה מתאים יותר לתרבות השעיית התא. ערך ה- OD של תרבות המתלים של התא שימש לייצוג כמות צמיחת התאים. במהלך 75 ימי הטיפוח, היחס של 15 גרם לכל 40 מיליליטר היה בעל ערך OD גבוה משמעותית מזה של שני היחסים האחרים.

כדאיות התא בתוך תרבות ההשעיה של תא התה נבדקה על ידי כתמי TTC. תרכובת TTC חסרת צבע ניתן להמיר formadin אדום על ידי דהידרוגנאז במיטוכונדריה של תאים חיים, אבל הצבע לא ניתן לשנות בתאים מתים. וזה כל התהליך של הקמת תרבות השעיית תא תה.

זהו המחקר ההשוואתי הראשון של חילוף החומרים של חומרי הדברה שונים בתה באמצעות טכניקת תרבות השעיית תא. זוהו מספר מטבוליטים של חומרי הדברה, וחלקם נחקרו עוד יותר בצמחי תה שמורים. שיטה חדשה זו יכולה לשמש כמודל למחקרים מטבוליים חומרי הדברה בתה או צמחים אחרים.