Name: היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: למד שיטת מיסחון חד-שלבית לחלבוני משי עכביש רקומביננטיים במים תוך שימוש בחום ולחץ. שיטה זו מאפשרת ייצור צורות חומר שונות כמו הידרוג'לים, סרטים וסיבים ללא ממסים אורגניים קשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים לקבל בהכרת תודה מימון של יוטה מדע וטכנולוגיה מחקר (USTAR) יוזמה.

1. רקומביננטי עכביש הכנה תערובת מתוך מניות חלבון ליאופ,
<ol><li>לקבוע את הניסוח הדרוש ונפח הנדרש עבור תצורות חומרים מיועדים. מגוון ניסוחים טיפוסיים מ-3% (w/v) עד 15% (w/v). באמצעות בחירה זו, חשב את ה-rSSp, הריכוזים והיחס המתאימים.<ol>
<li>השתמש בניסוחים המתאימים הבאים כדי להכין כל חומר המתואר בפרוטוקול זה: hydrogels/ספוגים/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; סרטים/ציפויים, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; דבקים, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; סיבים, 12.5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2. הערה: למרות שרוב הניסוחים מצוידים טוב יותר עבור טפסים וחומרים ספציפיים, יש מגוון רחב של ניסוחים שיכולים לעתים קרובות חפיפה. בנוסף, ניתן להתאים את חומרי ה-rSSp הסופיים גם במהלך היווצרות ועיבוד כדי להפיק את המאפיינים הרצויים. באופן כללי, כל חלבון ידרוש חקירה בפרמטרים מתאימים או שימושיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר בבקבוקון נקי וחדש של 8 מ ל, בקבוקון של תרבות זכוכית סיליקט עם כובע גומי מרופד.</li>
	<li>הסר את המכסה ומניחים את הבקבוקון הריק על איזון אנליטי. מסרק את המסה של הבקבוקון הריק כך שהאיזון יקרא מסה אפס.</li>
	<li>הוסיפו את אבקת ה-Ssp הרצויה לבקבוקון הריק עבור כל חומר ספציפי.<ol>
<li>השתמש אלה מיסות ספציפיות של כל סוג חלבון עבור כל חומר, בעת הכנת 2 מ ל של פתרון: הידרוג'לים/ספוגים/lyogels, 60 mg של MaSp1 ו 60 mg של MaSp2; סרטים/ציפויים, 80 מ ג של MaSp1 ו -20 מ"ג של MaSp2; דבקים, 120 מ ג של MaSp1 ו 120 mg של MaSp2; סיבים, 200 מ ג של MaSp1 ו 50 mg של MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את הכמות הרצויה של מים באולטרטהורים, לפחות 2 מ ל, לבקבוקון שכבר מכיל את אבקות rSSp משוקלל. הערה: כמות מינימלית של 2 מ"ל מומלצת לכל תהליכי השיבציה.</li>
	<li>אטום את כובע המבחנה ומערבולת בזריזות את התוכן כדי ליצור תערובת מפוזרת, ו הומוגנית, rSSp, כי הוא כעת מוכן הליך שימור. גישות הומוקות נוספות כגון ערבוב sonication או מדחף יכול להיות מועסק עם, או בנוסף, מערבולת ערבוב.</li>
</ol>2. רקומביננטי עכביש משי שימור
התראה: מחמם ולחצים גבוהים נוצרים במהלך תהליך הטיפול הסולארי. ציוד הגנה אישי נאות, בעיקר משקפי מגן, שרוולים ארוכים וכפפות עמידות בחום נדרשים לתהליך זה.
<ol><li>לבצע בדיקה סופית של המבחנה, או כלי, כובע כדי להבטיח כי היה הידק בחוזקה ובבטחה. ואז להעביר את התערובת rSSp מושעה לתנור מיקרוגל קונבנציונלי. הערה: יחידות מיקרוגל בטווח הכוח של 700 עד 1,500 וואט, בעל קיבולות פנימיות קטנות יותר, ופלטפורמות מסתובבות מומלץ לספק תנאי שימור טובים יותר.</li>
	<li>התחל פעולת המיקרוגל עם התפרצויות של 5 s במלוא העוצמה. אחרי כל התפרצות לפתוח בקצרה את הדלת בזהירות לערבב/מערבולת הבקבוקון כדי למנוע להתיישב ולשמור על התערובת מושעה.</li>
	<li>חזור על תהליך המיקרוגל עד שהתערובת ו/או התמיסה השיגו טמפרטורה של לפחות 130 ° c, כאשר נמדד עם מדחום אינפרא אדום ישירות כנגד הפתרון המכיל חלקים מהבקבוקון. חזור על תהליך זה עד שכל החלקיקים המוצקים התפרקה לחלוטין ואינם גלויים עוד. הערה: הוא הציע לאפשר את המבחנה ואת הפתרון קריר מדי פעם, במיוחד אם הניסוח יש ריכוז גבוה של rSSp הנוכחי. הטמפרטורות מעל 200 ° צ' מגדילות את הסיכון לכשל במבחנה. תשומת לב מיוחדת חייבת להינתן גם כדי למנוע את התערובת המחוממת/פתרון מלגעת בחותם, אשר תגרום גם לכשל בבלימה של בקבוקון.</li>
	<li>לאחר בהצלחה solvating תערובת rSSp לתוך פתרון לאפשר את הטמפרטורה של הפתרון ואת כובע המבחנה להתקרר מתחת 100 ° צ' (נקודת רתיחה) לפני הפתיחה.</li>
</ol>3. הידרו-ג'ל
<ol><li>הכינו הידרוג'ל מהפתרון לאחר הסרתם מהמייקרוגל והתרת האפשרות לקרירות ולהגדרה. השליכו את ההידרוג'ל לתוך גיאומטריות מסוימות לפני שהוא מאפשר לו להתקרר באופן מלא. הערה: rSSps שונה ידרוש כמויות מגוונות של פעמים למעבר להידרוג'ל. לדוגמה, רצפים כמו MaSp2 נוטים ליצור הידרוג'ל במהירות רבה יותר בהשוואה לרצפים כמו MaSp1. ריכוזי חלבון, מליחות ו-pH משפיעים גם ישירות על שיעור המעבר להידרוג'ל.</li>
</ol>4. ספוגים
<ol><li>להכין ספוגים rSSp על ידי לראשונה לאפשר את הפתרון הראשוני ליצור הידרוג'ל.</li>
	<li>מניחים את ההידרוג'ל באמבט מים, מניחים את האמבט במקפיא ב-20 ° c, ומחכים עד שהאמבטיה קפואה לחלוטין.</li>
	<li>השלימו את תהליך היווצרות הספוג על-ידי הסרת ההידרוג'ל הקפוא ומרחץ המים מהמקפיא והיפנפו ב -25 ° c. הספוג העשוי כעת ניתן להסירו מן המים המופשרים.</li>
</ol>5. ליאוג'ל
<ol><li>הכן rSSp ליאוג'ל על ידי הקפאת הידרוג'ל באופן ישיר, עם או בלי אמבט מים, והעברת דגימת הידרוג'ל קפואה לליאופליזר (הקפאת מייבש).</li>
	<li>הסירו את החומר הסופי ג'ל מהספינה כי סובלימציה הלחות התרחשה.</li>
</ol>6. סרטים וציפויים
<ol><li>השתמש באחת משלוש השיטות הבאות: יציקת תמיסה, ריסוס פתרונות או ציפוי מטבל להפקת סרטים או ציפויים של rSSp.<ol>
<li>השליכו את פתרון המשי מסיסות לתוך/אל צורות PDMS של הצורה הרצויה.</li>
		<li>יוצקים ולהפיץ 200 μL של פתרון הסרט ולאפשר זאת להתייבש לפני לקלף אותם מתוך המצע PDMS לבדיקה או טיפול.</li>
		<li>לאחר שאפשר אלה יבשים, להסיר את הסרטים הקימו לבדיקה מכנית או לאחר לטפל בסרטים כדי לשפר את התכונות המכאניות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להכין ציפוי, או סרט שלא ניתן להסירו מהמצע, השתמשו בתרסיס או בציפוי טבילה כדי ליצור שכבת סרט דקה. הערה: כדי לרסס מעיל, פרוטוקול זה מצא הצלחה עם מרסס מאסטר airbrush צביעה מודל.<ol>
<li>ליצור ציפוי לטבול על ידי פשוט שוקע יזוג המצע של בחירה אל מסיסות rssp ולחזור לאחר ייבוש כדי להשיג את העובי הרצוי.</li>
		<li>לבצע מעיל תרסיס הראשונית לפני החלת מעיל לטבול כדי להגדיל את העקביות ואת האפקטיביות של הציפוי הסופי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. דבקים
הערה: היווצרות הדבקים מושגת באמצעות אחת מהשיטות הבאות.
<ol><li>ישירות להוסיף את rSSp מסיסות אל מצע ולאחר מכן להחיל מצע שני מעל החלק העליון של הפתרון. מלחציים בחוזקה את החלקים ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בתנור בטמפרטורה מינימלית של 25 ° c לפחות 16 שעות.</li>
	<li>לחלופין, לרסס את שני משטחי המצע עם ציפוי ספריי ולאחר מכן להדק את המצעים יחד.</li>
	<li>החלת rSSp באמצעות שיטת הטבילה של ציפוי מצעים ולתקוע את מצעים יכול לשמש גם כדי להכין ודבק.</li>
</ol>8. סיבים רטובים
<ol><li>טען את הפתרון סם מסיסות לתוך מזרק קונצנטריים עם Luer-Lok עצה באמצעות מחט הגלישה 19 G. להוציא בועות אוויר ולתת הסמים לשבת בקצה של Luer-Lok של המזרק.</li>
	<li>הוסף לפחות 25 מ"מ של אבובים הצצה, פנימי קוטר 0.01 אינץ ', לתוך צינורות מבט אחד האצבעות הדוק של אבובים עבור 1/16 סנטימטר OD ו-10/32 חרוט. הצמד התאמה זו לצינורות הצצה למתאם הנשי Luer-Lok.<ol>
<li>החלף את המחט למדוד 19 עם זה להגדיר על המזרק טעון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ממלאים אמבטיה גבוהה, זכוכית ברורה עם 99% האיזופנול טהור לשימוש עבור קרישת דם.<ol>
<li>ממלאים את האמבטיות למתוח, הממוקם מתחת godets למתוח. לאלה יהיו 80:20 איזופנול: מים מזוקקים באמבט המתיחה הראשון, ו20:80 איזופנול: מים מזוקקים באמבט המתיחה השני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להגדיר את מערכת למתוח godet כזה כי הראשון לאחר האמבט קרישה הראשון godet באמבטיה למתוח הראשון מסתובבים באותו מהירות.<ol>
<li>להתחיל את המתיחה הראשונה על ידי התאמת מהירויות של הgodet הסופי באמבטיה למתוח 1, הגודט העליון באמצע, ואת הראשון באמבטיה למתוח 2 לאותו מהירות. מהירות זו תהיה 2x מהר כמו מהירות הסרת סיבים הראשונית.</li>
		<li>להתחיל את המתיחה השנייה על ידי התאמת מהירויות של הgodet הסופי באמבטיה למתוח 2, האחרון העליון, ואת מנחיל באותו מהירות. מהירות זו תהיה 2x מהר כמו המהירות המשמשת למתוח הראשון או 4x הראשונית מהירות ההסרה של הסיבים.</li>
		<li>מניחים כפפות מניטריל על החלק החיצוני של הגודטים ביניים כדי לשמור על הסיבים מחליקים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התחל להאט לאט את הפתרון לתוך אמבטיית קרישת הדם. במערכת אוטומטית להגדיר את שיעור ההבלטה כדי להתאים את מהירות ההסרה של 10 מ"מ/s.<ol>
<li>אפשר שחול הסיבים להפוך אחיד לפני משיכת סיבים מתוך האמבט באמצעות וו מתכת דק או מלקחיים. הסרת הסיבים מהאמבטיה יצרה לולאה בין הקצה של הצינור הצצה לבין הנתיב של הסיבים העוזבים את האמבטיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מדריך את הסיבים המאוחזרים דרך הסדרה של godets כגון סיבים שקוע באמבטיות למתוח, אבל ייבוש באוויר בין אמבטיות למתוח לפני לעלות על סליל. ייבוש זה מושגת על ידי godets ביניים גבוה יותר ממוקם. הערה: קצב הסרת הסיבים ו/או שיעור ההבלטה יצטרכו להיות מותאמים בהתאם לריכוז החלבון, התוספים וסוג החלבון כדי לאפשר זמן קרישה מספיק ללא הסבת סיבים בתחתית אמבטיית הקרישה.</li>
	<li>הצמד את הסיבים הנמתחים במלואו לסליל על מנגנון ההדבקה באמצעות הקלטת.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

לאחר רקומביננטי החלבונים משי עכביש מטוהרים הם צריכים אז להיות מוכנים בפתרון כי ניתן להשתמש עבור היווצרות חומר. על-ידי ערבוב חלבון המשי של קורי העכביש עם מים וחשיפת תערובת זו להקרנה מיקרוגל, כדי ליצור חום ולחץ, ניתן להכין פתרון rSSp. ניתן להפיק מגוון רחב של צורות חומריות משיטה פשוטה ויעילה זו של פתרונות rSSp. כל חומר צריך להיות מוכן ומעובד באופן ייחודי כדי להשיג את התוצאות והמאפיינים הרצויים. עם שינויים קלים הניסוחים הראשונית, תנאי היווצרות, ו/או מעבד פרמטרים, כל חומר ניתן להתאים בקלות באמצעות שיטה זו. יש יותר צורות מאשר ...

משי עכביש צברה לטובת מדענים חומריים על השילוב המרשים שלהם של חוזק, אלסטיות, ו biocompatibility. משחזר סיבים היתה באופן מסורתי הדחף של המחקר. מאמץ זה הושפע חלבון רקומביננטי עכביש משי (rSSp) חוסר מסיסות במים, כמו גם חוסר יכולת של טכניקות שימור מסורתי (סוכנים chaotropic וחומרי ניקוי) כדי להשיג שימור מימית. עוד, טכניקות שפותחו עבור גירסאות solvating של rssp לא לעבוד על כל משתני rssp וגם דורשים מניפולציה משמעותית זמן שלעיתים קרובות תוצאות אובדן חלבון1,2. זה הביא בעיקר בתחום ניצול 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroגנול (HFIP) כממס שממנו ליצור סיבים, וצורות חומרים מוגבלים אחרים. היתרון הוא כי כל rSSp ידוע מסיסים ב HFIP, מתן אחידות נתונים בין כל קבוצת מחקר. החיסרון הוא כי HFIP היא הממס הרעיל כי הוא יקר ומעשי לקנה מידה עקב חששות בריאותיים ושיקולים סביבתיים.
הגישה הרומן של rSSp שימור פותחה כי גישור את הפער הטכנולוגי בין הממס האורגני הקשה HFIP וטכניקות אחרות שעבדו באופן סלקטיבי עבור rSSp שימור. השילוב של מחמם ולחצים ספציפיים הוחל על השעיות של rSSp ומים. התוצאות היו בקרבת 100% שימור והתאוששות של rSSp, כמו גם ריכוזי חלבונים גבוהים; מגוון של צורות חומרים היו נחושים להיות אפשריים מניסוחים אלה שלא היו כל השגה באמצעות hfip או ממיסים אורגניים אחרים3,4,5,6. המטרה של גישה זו היא ביעילות ובקלות מסיסות מטוהרים ומיובשים רקומביננטי spider חלבונים בפתרון מימית כי יכול להיות מנוצל לייצור של מגוון צורות חומרים.
סיבים, סרטים, ציפויים, דבקים, הידרוג'לים, lyogels, microspheres, וחומרי ספוג הם כל בקלות accomplishable מתוך הפתרון rSSp מימית אותו באמצעות שיטה זו. המשך האבולוציה של שיטה זו, לא רק עם rSSp נוספים אלא עם חלבונים אחרים, יכול להוביל לצורות חומר חדשות ולטיהור חלבון אלטרנטיבי ושדרות מסיסות.

<table><tbody><tr><td>מזרק 3 מ"ל עם Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309657</td><td>ניתן להשתמש במזרקים בגודל אחר אך כדי לשמור על הקצוות, מומלץ להשתמש בקצות luer-lok</td></tr><tr><td>בקבוקון תרבית 4 מ"ל, שקוף עם מכסה מרופד גומי</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>נפח סמים מינימלי הוא 1 מ"ל, מקסימום הוא 2 מ"ל</td></tr><tr><td>בקבוקון תרבית 8 מ"ל, שקוף עם מכסה מרופד גומי</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>נפח סמים מינימלי הוא 2 מ"ל, מקסימום הוא 4 מ"ל</td></tr><tr><td>99% אלכוהול איזופרופיל, מגיב ACS/USP דרגת</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Freeze</td></tr><tr><td>Dryer Luer Adapter נקבה Luer x 10-32 נקבה, טפזל (ETFE)</td> <td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 וואט; קיבולת 1.1 רגל מעוקב; עם שולחן</td></tr> <tr><td>מסתובב מזכוכיתמקשה אחת Fingertight 10-32 Coned, עבור 1/16 אינץ' OD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>צינורות הצצה 1/16 אינץ' OD x 0.010 אינץ' ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>מרסס: מברשת אוויר</td><td>מאסטר מברשת אוויר מאסטר</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית solvation באמצעות חום ולחץ

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

עכבישים רבים מייצרים. שבעה סוגי משי שישה מבדי המשי הם סיבים בצורה כאשר מופק על ידי העכבישים. הסיבים האלה אינם מסיסים במים. על מנת לשכפל את תכונות מכני יוצא דופן של משי עכביש, הם חייבים להיות מיוצר הטרוולוגי מארחים כמו עכבישים הם טריטוריאליים ו קניבאלי. האנלוגיות הסינתטית של משי העכביש נוטות גם הם להיות מסיסים בפתרונות מימית. כך, אחוז גדול של מחקר בדי משי רקומביננטי עכביש להסתמך על ממיסים אורגניים כי הם מזיקים ייצור בקנה מידה גדול של חומרים. שיטת הקבוצה שלנו מאלצת את הרקומביננטי של משי העכביש למים. באופן מדהים, כאשר חלבונים אלה מוכנים באמצעות שיטה זו של חום ולחץ, מגוון רחב של צורות חומר ניתן להכין מאותו פתרון של חלבונים משי רקומביננטי עכביש (rSSp) כולל: סרטים, סיבים, ספוג, הידרוג'ל, lyogel, ו דבקים. מאמר זה מדגים את הייצור של rSSp וצורות חומרים באופן שניתן להבינו בקלות רבה יותר מאשר חומרים כתובים ושיטות בלבד.

מתוך השיטה המתוארת של מסיסות rSSp, ניתן להשיג מגוון של צורות חומר כפי שנראה באיור 1. שיטת הפתרון היא להחיל חום ולחץ, שנוצר על ידי מיקרוגל קונבנציונאלי, להשעיה של rSSp ומים. כאשר הטמפרטורות והלחצים הקריטיים מושגת, החלבון יהיה מסיסות. מתוך פתרון rSSp מסיסות זה, התנאים הנדרשים מוצגים עבור שבעה צורות חומרים: הידרולים, lyogels, ספוג, דבקים, ציפויים, סרטים, וסיבים. הידרולים מוכנים על ידי מתן rSSp מסיסות כדי מגניב וטבעי שותף עצמי. ליאוג'ל מוכן על ידי ליאופליזינג ההי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מסיסים במים רקומביננטי עכביש משי פתרונות חלבון וצורות חומרים שניתן ליצור מאותם פתרונות.

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

שיטה זו של מינון משי עכביש רקומביננטי מייצרת צורות חומר שאינן אפשריות באמצעות ממיסים אורגניים קשים מסורתיים. יתר על כן, התהליך הוא דגנים, וכתוצאה מכך פתרון חלבון פשוט במים. על ידי שימוש בשיטה זו, החומרים שנוצרו או יוצרו לשמור על המאפיינים הרצויים של חלבוני משי עכביש.טכניקת מינון זו עבור משי עכביש רקומביננטי מאפשרת מינון של משי עכביש רקומביננטי בתהליך צעד אחד. זה רצוי כי אלה ידוע לשמצה קשה לייצר חלבונים לא הולכים לאיבוד באמצעות עיבוד נרחב. כמו כן, מאז הפתרונות הם רק חלבון במים, תרכובות פעילות ביולוגית אחרות ניתן להוסיף אם זה רצוי עבור היישום.במיוחד, מערכת היחסים תפקוד מבנה החלבון, מערכת זו היא memetic איך עכביש עושה סיבים גם כי הוא מנצל מים וחלבונים בריכוז גבוה. על ידי שימוש בשיטת מינון זו ובהיווצרות חומרים עוקבת, יש להבין את החומרים שנוצרו ואת המבנים האחראים עליהם. הוא חשב שזה יכול להיות, השתמשנו בטכניקה זו עבור מתבודד פפטידים סינתטיים שאחרת ידרוש סביבה בסיסית או חומצית לפתיר.זה יכול להיות יתרון ביישומים במורד הזרם עבור פפטידים אלה. יתר על כן, מספר חלבונים ידועים כאשר בא לידי ביטוי לאכסון נוטים בסופו של דבר בשבר מסיס. Resolubilizing, ולאחר מכן refolding חלבונים אלה הוא לעתים קרובות תהליך מייגע שתוביל להפסדים גדולים.על ידי שימוש בטכניקה זו, ייתכן שניתן יהיה להגביר את היעילות של תהליכי התאוששות עבור חלבונים מסיסים. הצבת בקבוקון אטום במיקרוגל היא קצת מרתיעה נותן את הסיכון של התחממות יתר ובכך מעל לחץ על הבקבוקון. הבנת הגישה המבוימת להחלת חום ולחץ היא קריטית.שנית, עבור משי עכביש רקומביננטי בפרט, לאחר מלח נוכח לא יאפשר את הטכניקה לעבוד או לעבוד ביעילות בהתאם כמה מלח קיים. הסרת מלח היא המפתח. היו סבלניים וזהירים, עקבו מקרוב אחר זמני המיקרוגל והטמפרטורות בתוך הבקבוקון.זה קריטי כי יש מספר חלקים נעים לפעולה כי הם לעתים קרובות קשה להעביר באמצעות חומרים כתובים מסורתיים וקטעי שיטה. בהתחשב בכך שיש חלבונים רבים שיש להם בעיות מבודדות המונעות מחקר הולם, שיטה זו יש פוטנציאל להיות מיושם על פני מגוון רחב של מרחבי חלבון כדי לשפר, או אפילו לאפשר טכניקות אנליטיות ואפיון. כדי להתחיל, בחר בקבוקון תרבות זכוכית אוטומטית 8 מיליליטר נקי וחדש עם כובע בורג מצופה גומי, והצב את הבקבוקון הריק על איזון אנליטי.לקרוע את המסה של הבקבוקון הריק כך האיזון קורא אפס מסה. מוסיפים את אבקת חלבון משי עכביש רקומביננטי lyophilized הרצוי לבקבוקון הריק עבור החומר הספציפי. לאחר מכן, מוסיפים את הכמות הרצויה של מים טהורים במיוחד, לפחות שני מיליליטר, לבקבוקון.לאטום את כובע הבקבוקון, ומערבולת בזריזות את התוכן כדי ליצור תערובת חלבון משי עכביש מפוזר הומוגני. בצע בדיקה סופית של מכסה הבקבוקון כדי לוודא שהוא התהדק בתקיפות ובבטחה. לאחר מכן, להעביר את תערובת חלבון משי עכביש רקומביננטי מושעה למיקרוגל קונבנציונלי עם טווח כוח של 700 עד 1500 וואט.התחל בהפעלה של המיקרוגל עם חמישה צרורות שניות להגדיר כוח מלא על ידי הפעלה והפעלה ידנית. לאחר כל פרץ, פותחים בקצרה את הדלת ומערבבים בזהירות את הבקבוקון כדי למנוע התיישבות, ושומרים על התערובת התלויה. מדי פעם לאפשר את הבקבוקון ואת הפתרון להתקרר, ולמנוע את הפתרון מחומם יתר על המידה מלגעת החותם.השתמש מדחום אינפרא אדום כדי למדוד את הטמפרטורה של הפתרון המכיל חלק של הבקבוקון. חזור על תהליך המיקרוגל עד שהטמפרטורה מגיעה לפחות ל -130 מעלות צלזיוס, וכל החלקיקים המוצקים הומסו לחלוטין. לאחר מכן, לאפשר את הטמפרטורה של הפתרון ואת כובע הבקבוקון להתקרר מתחת 100 מעלות צלזיוס.לפני פתרון זה להיות מקורר לחלוטין, השליך אותו מן הבקבוקון לתוך גיאומטריות ספציפיות כדי ליצור הידרוג'ל. לאחר ההידרוגל נוצר, מניחים אותו באמבט מים, ומעבירים אותו למקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. חכה עד האמבטיה קפואה לחלוטין.השלם את תהליך היווצרות הספוג על ידי הסרת הידרוג'ל קפוא ואמבט מים מהמקפיא, והפשרה ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הספוג שנוצר מהמים המופשרים. כדי להכין ליוגל, להעביר דגימת הידרוג'ל קפואה lyophilizer.לאחר 24 שעות, להסיר את החומר הסופי ג'ל lyophilized מה כלי. כדי להפיק סרטים של חלבון משי עכביש רקומביננטי, יצוק 200 microliters של חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוזל חם מן הבקבוקון על צורת PDMS של הצורה הרצויה. לאחר שהוא מיובש, לקלף אותו מצע PDMS לבדיקה או טיפול.כדי להכין ציפוי שלא ניתן להסיר מהמצע, השתמש מרסס מברשת אוויר כדי להחיל את חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוכר לבצע ציפוי ספריי ראשוני על המצע של בחירה. לאחר שהוא מיובש, להטביע את המצע מצופה לתוך חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוכר כדי ליצור ציפוי לטבול. חזור על ציפוי המטבל כדי להשיג את העובי הרצוי.כדי ליצור דבקים, השתמש בפיפטה כדי להוסיף את חלבון משי העכביש המבודד על מצע, ולאחר מכן להחיל מצע שני על החלק העליון של הפתרון. בחוזקה להדק את החלקים יחד, ולאחר מכן לייבש את הדגימות בתנור עם טמפרטורה מינימלית של 25 מעלות צלזיוס לפחות 16 שעות. כדי ליצור סיבים סובבים רטובים, השתמש מחט להחליק 19 מד, טען את פתרון סמים מסיסים לתוך מזרק קונצנטרי עם קצה מנעול לור.להוציא בועות אוויר, ולתת את הסמים לשבת בקצה מנעול לולר של המזרק. הכנס לפחות 25 מילימטרים של צינורות PEEK לתוך אביזרי אצבע אחת של PEEK עבור קוטר חיצוני אחד מעל 16 אינץ ', ו 10 מעל 32 מסרק. החלף את המחט 19 מד עם התקנה זו על המתאם נקבה מנעול לולר של המזרק.לאחר מכן, מניחים כפפות ניטריל בצד החיצוני של godets ביניים, כדי לשמור על הסיבים להיווצר מחליק, כדי למנוע פגיעה במנועים. קבל אמבטיית זכוכית צלולה גבוהה עם 99% isopropanol טהור להשתמש כאמבט קרישה. ממלאים את אמבטיית המתיחה הראשונה ביחס של 80 עד 20 של isopropanol ומים מזוקקים.באמבט המתיחה השני, ממלאים יחס של 20 עד 80 של isopropanol ומים מזוקקים. הגדר את מערכת מתיחת godet במחשב. כדי להתאים את המהירות העיקרית של הסרת הסיבים, להתאים את סרגל ההזזה עבור godet שלישייה מהירות A לערך בין 10 ל 14 מילימטרים לשנייה, תלוי כמה טוב ובמהירות הסיב נוצר.ליזום מתיחה ראשונה על ידי הזזת בר הזזה של godet משולש B למתוח יחס לשניים עבור godet הסופי באמבט למתוח אחד, godet העליון באמצע, ואת godet הראשון באמבט למתוח 2. ליזום את המתיחה השנייה על ידי הזזת בר הזזה של godet משולש C למתוח יחס לשניים עבור godet הסופי באמבט למתוח 2, godet העליון האחרון, ואת הרוח. התקנה זו מבטיחה כי godet הראשון לאחר אמבט קרישה, ואת godet הראשון באמבט מתיחה הראשונה מסתובבים באותה מהירות.לאחר מכן, לטעון את פתרון המשי במזרק של מכשיר קו ספין מותאם אישית. במערכת האוטומטית, להגדיר את שיעור ההבלטה ל 10 מילימטרים לשנייה, על מנת להחצין את תספורת המשי לתוך אמבט קרישת זכוכית מלא isopropanol. אפשר שבלט סיבים להיות אחיד, לפני משיכת הסיבים מהאמבטיה עם וו מתכת דק.ודא שהסרת הסיבים מהאמבטיה יוצרת לולאה בין קצה צינורות PEEK לנתיב הסיבים היוצאים מהאמבטיה. מדריך סיבים מאוחזרים דרך הסדרה של godets, כך הסיבים שקועים באמבטיות למתוח, אבל ייבוש באוויר בין אמבטיות למתוח, ולפני הולך על סליל. בפרוטוקול זה באמצעות מינון של חלבון משי עכביש רקומביננטי, ניתן להשיג מגוון צורות חומר.שבע צורות חומריות מוצגות כאן. הידרוג'לים, ליוגלים, ספוג, דבקים, ציפויים, סרטים וסיבים. סיבים דורשים את העיבוד הנרחב ביותר על ידי הבלטה לאמבט קרישה, ולאחר מכן מתיחה סדרתית של הסיבים הגולמיים באמבטיות מתיחה לאחר סל.בהתחשב בכך שפתרונות החלבון והמים מחוממים לטמפרטורה ולחץ גבוהים יחסית, הניסיון שלנו היה שהפתרונות סטריליים בנקודה שבה החלבון פתיר. זה מאפשר לכל אחד מהצורות החומריות המוצגות כאן להילקח לתרבות התאים, כל עוד הם מטופלים כראוי, כדי ללמוד את התגובה התאית לחומרים. אין ספק שטכניקה זו הובילה לגילוי צורות חומר חדשות, כולל דבקים וחומר ספוג.צורות חומר כי הם לא בהכרח אוריינטציה לקראת היווצרות סיבים, אם כי היווצרות סיבים הוא אחד התחומים כי גם ראה שיפור באמצעות הפיתוח של טכניקה זו. יצירת חום ולחץ בתוך בקבוקון אטום יש סכנה אינהרנטית. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליכים אלה.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

סיבי משי עכביש להציג תכונות מכאניות יוצאות דופן. תכנון...

התקנים כוללים מסנן אוויר משתלב לא ארוג של חלבונים קורי עכביש רקומביננטי electrospun

מיזוג הוא גישה יעילה ליצירת חומרים ביולוגיים עם מגוון רחב של מאפיינים ותכונות משולבות. על ידי חיזוי האינטראקציות מולקולריות בין חלבוני משי טבעי השונים, פלטפורמות סגסוגת חלבון חדשות משי משי עם גמישות מתכונן מכאנית, תגובה חשמלית, שקיפות אופטית, processability הכימי, פריקות ביולוגית, או יציבות תרמית יכולות להיות מתוכננות.

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

פרוטוקול microfluidic ספינינג, מיקרו אפיון מחדש fibroin משי monofilament מוצג.

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

פרוטוקול זה מדגים את היכולת להשתמש בהדפסת הזרקת דיו תגובתית כדי להדפיס מיקרו-שטירים עצמאיים וידידותיים לסביבה ידידותי לשימוש ביישומים רפואיים וסביבתיים.

הדפסת הזרקת דיו וניתוח הנעה של משי מבוסס עצמית הנעה מיקרו-שטירים

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

אנו מדווחים על טכניקות לסרטים באמצעות הדפסת סטנסיל וphotolithography, כמו גם שיטות לתאי תרבות על דפוסי microfabricated הדקים זהב nanoporous micropattern. בנוסף, אנו מתארים שיטות ניתוח תמונה למאפיינות מורפולוגיה של החומר ואת התאים בתרבית באמצעות אלקטרונים סורקים וטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

למד שיטת מיסחון חד-שלבית לחלבוני משי עכביש רקומביננטיים במים תוך שימוש בחום ולחץ. שיטה זו מאפשרת ייצור צורות חומר שונות כמו הידרוג'לים, סרטים וסיבים ללא ממסים אורגניים קשים.

היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

גלה סרטונים נוספים