המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

האפשרות לייצר תת-סוגים שונים של נוירונים מוטוריים רלוונטית במיוחד למודל של מחלות נוירונים מוטוריים מודרניים כגון טרשת נפוצה צידית אמיוטרופית. שיטה זו מאפשרת רכישה של אוכלוסיות תאים נוקשות מאוד עבור נוירונים מוטוריים עם זהות עמוד השדרה או הגולגולת בתוך פרק זמן קצר וללא שלב הטיהור. הדור של נוירונים מוטוריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה או iPSC במצב תרבות פשוטה עשוי להקל על הקרנת סמים למחלות נוירון מוטורי.

הביטוי הבלתי ניתן לעיכול של גורם שעתוק תכנות יכול לשמש ליצירת סוגי תאים אחרים כגון נוירונים, שרירי השלד ותאי גליה ממחזר iPSC. עבור NIL ו NIP iPSC קו הדור, לשטוף את התרבות האנושית iPSC עם PBS ללא סידן ומגנזיום לפני טיפול בתאים עם דיסוציאציה התא reagent במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים החלו להתנתק מהמיכל התרבותי, השתמש בפיפט P1000 כדי לנתק בעדינות את התאים שלוש עד ארבע פעמים.

מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר ומביאים את הנפח הסופי עד 10 מיליליטר עם PBS טרי ללא סידן ומגנזיום לספירה. לאסוף פעם אחת 10 לתאים השישיים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 100 microliters של מאגר R מתוך ערכת אלקטרופורציה. הוסף 4.5 מיקרוגרם של דנ"א פלזמה וקטורי transposable ו 0.5 מיקרוגרם של DNA פלזמה transposase piggyBac עבור transfection.

לשנות עם מערכת אלקטרופוזיה התא בהתאם להוראות היצרן עם הפרמטרים שצוינו. לאחר מכן, זרע את התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת 10 מעכבי רוק micromolar Y-27632 בצלחת מצופה מטריצה שישה מילימטר. יומיים לאחר ההשתנות, מוסיפים 5 מיקרוגרם למיליליטר של blasticidin למדיום התרבות שמירה על התאים באנטיביוטיקה לפחות שבעה עד 10 ימים כדי לבחור את התאים שלא שילבו את הטרנסג'נים.

בסוף הדגירה, לשמור על התאים המרובים היטב כאוכלוסייה מעורבת המורכבת מתאים עם מספר שונה של טרנסג'נים ואתרי אינטגרציה שונים או לבודד שיבוטים בודדים. הכן מנה נוספת כדי לאפשר את הביטוי היעיל של המשדרים על מיקרוגרם אחד למיליליטר של אינדוקציה דוקסיציקלין להיות מוערך על ידי RT-PCR עם פריימרים ספציפיים לטרנסג'ין עבור neurogenin-2 כפי שתואר קודם לכן. בשלב זה, מניות של קווי NIL ו- NIP iPSC הרומן צריך גם להיות קפוא בינוני הקפאה עבור iPSCs אנושי.

עבור בידול נוירון מוטורי, נתק את תרבות התאים המותנות היטב עם ניתוב מחדש כפי שהוכח כדי לאפשר לתאים להיאסף בצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה כרכים של מדיום DMEM/F12. לאחר צנטריפוגה, resuspend התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת מעכבי רוק micromolar לספירה. זרע את התאים על כלים מצופים מטריצה ב 6.25 פעמים 10 התאים הרביעיים צפיפות בריבוע סנטימטר.

ביומיים הבאים, החליפו את העל-טבעיים במדיום ההידול הטרי בתוספת דוקסיציקלין. ביום השני, לשנות את המדיום כדי neurobasal B27 בינוני בתוספת מעכב גמא secretase, מעכב קולטן גורם גדילה אנדותל כלי הדם, דוקסיצילין. ביום החמישי, נתק את התאים כפי שהוכח ולחץ מחדש על התאים המנותקים בארבעה מיליליטר של מדיום DMEM/F12 לספירה.

Pipetting חשוב עבור דיסוציאציה מלאה של התאים. להקפיא aliquot של הנוירון המוטורי progenitors במדיום הקפאת תאים על פי הוראות היצרן ולאסוף את שאר התאים על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה במדיום עצבי בתוספת 10 מעכבי רוק micromolar.

זרע את התאים על microslide מצופה למינין פוליאורניתין תומך עם מחליק כיסוי פולימר באחת פעמים 10 לתאים החמישיים לצפיפות בריבוע סנטימטר. ביום השישי, בזהירות להחליף את המדיום עם מדיום עצבי טרי ללא מעכב לתרבות עד ניתוח במורד הזרם מבלי לנתק את התאים מפני השטח תמיכה. ביטוי אחיד של סמן pluripotency אוקטמר מחייב גורם שעתוק ארבע או OTC4 ניתן לראות בהבחנת תרבויות התא ביום אפס בהיעדר סמן עצבי פאן נוירון ספציפי מחלקה שלוש חיוביות בטא-tubulin TUJ1.

ביום השלישי ניכרת ירידה חזקה במספר התאים החיוביים OCT4. זה משתקף על ידי הביטוי של TUJ1 בקבוצה משנה של iPSCs מנוידים. ביום החמישי, אין ביטוי של OCT4 נצפתה באוכלוסייה אשר מראה ביטוי עקבי של TUJ1 ומורפולוגיה עצבית נרכשת.

ניתוח immunostaining שבעה ימים לאחר replating של תאי הנוירון המוטורי מגלה ביטוי אחיד של TUJ1 ואת סמן נוירון מוטורי בוגרת כולין אצטילטרנספראז. נוירונים שמקורם ב- IPSC NIL מציגים בהצלחה זרמי נתרן תלויי מתח וזרמים תלויי מתח של אשלגן. 80% מהנוירונים המוטוריים שמקורם ב-iPSC NIL מהודקים במודאליות המהדקת הנוכחית מסוגלים להפעיל רכבות ספייק כאשר מוזרק להם פולס נוכחי של פלוס 60 פיקואמפים או יותר.

הזרם המינימלי הנדרש כדי להפיק ירי חוזר ביותר מ -50% מהתאים המוקלטים הוא בתוספת 40 פיקואמפים עם סף ספייק של מינוס 38 מילי-וולט ותדירות ירי ממוצעת של פלוס 40 פיקואמפ של כשמונה הרץ, מה שמרמז על כך שתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה שמקורם ב- IPSC NIL מציגים תכונות תפקודיות אופייניות לנוירונים בוגרים. נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה ובגולגולת יכולים להיגזר מ- iPSCs מבוקרים או iPSCs הנושאים מוטציות פתולוגיות ושתאים אלה יכולים לשמש מודלים של תזה או להקרנת סמים. השיטה שלנו יכולה לשמש כדי לעזור להבין מדוע יחידות נוירון מוטוריים שונים מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי ALS.