Name: ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: חקור עיכוב מיקרואורנה בתוך גוף החיה כדי להפחית צמיחת גידולי סרטן בלוטת התריס בעכברים. שיטה זו מאפשרת בדיקת טיפולים חדשים מבוססי microRNA במודלים אורתוטופיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לרקל ארצ'ה ריסקו על עזרתה בטיפול ובדאגה לעכברים. אנו מודים ד ר. J. בלאנקו (המכון הקטלוני לכימיה מראש-CSIC) ו ד ר. מאטו (מכון דה Reserca de l ' בית החולים דה לה סנטה Creu אני סנט פאו) ברצלונה (ספרד) עבור gifting של CSIC-גחלילית לוק-IRES-EGFP ו Cal62-לוק תאים, בהתאמה.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק הקהילה האירופי (86/609/EEC) ולחוק הספרדי (ר לוך 1201/2005), באישור ועדת האתיקה של המשרד העליון של Consejo (CSIC, ספרד).
1. מאגף לתאי תאים וטיפול antagomiR מוסרי
<ol><li>הכנה לתאים
	<ol>
<li>מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא (קראסG12R ו p53A161D מוטציות) כדי לבטא את המבנה הטרנסגניים המבטא באופן מוגזם gfp ו לוציפראז (Cmv-ללוק גחלילית-IRES-egfp). בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.</li>
		<li>לגדל את התאים בדולב́s שונה הנשר ́s בינונית (DMEM) שיושלם עם פניצילין, סטרפטומיצין ו 10% סרום בפרה העובר (FBS) ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
		<li>להשעות 1 x 106 תאים ב 50 μl של פוספט מאגור פוספטים (PBS) ב 4 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>תא החיסון לתוך מאגפים של עכברים
	<ol>
<li>מערבבים את התאים עם אותה כמות של מטריצת קרום המרתף. לדוגמה, להוסיף 1 x 106 תאים ב 50 ΜL של PBS כדי 50 μl של מטריצה קרום המרתף (ראה טבלת חומרים) ולערבב בעדינות. הערה</li>
		<li>הכנס 100 μL של המדגם (תאים ב-PBS + המרתף ממברנה הממברנה) תת-עורי לתוך האגף השמאלי של החיסוני 6-שבוע-בן BALB/c נו/נו עכברים באמצעות מזרק 1 מ"ל אינסולין עם 27g 1/2 ' ' (0.4 x13 mm) מחט.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול antagomiR.
	<ol>
<li>השהה את antagomiR (ראה טבלת חומרים) או את השליטה השלילית ב-500 μl של מים מזוקקים חינם RNase.</li>
		<li>לפני ההזרקה, להכין 2 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב (ראה לוח חומרים) עבור כל זריקה.<ol>
<li>ראשית לערבב את הפתרון antagomiR (ראה טבלת חומרים) ואת מאגר complexation (ראה לוח חומרים) ביחס 1:1. לדוגמה, להוסיף 80 μL של הפתרון miRNA-מעכב (16 nmol) ל 80 μL של complexation מאגר (כלול בערכה vivo משלוח משלוחים, ראה טבלת חומרים).</li>
			<li>הביאו את האספקה הvivo. הכימית לטמפרטורת החדר הוסף 160 μL ל שפופרת 1.5-mL ומיד להוסיף 160 μL של פתרון antagomiR מדולל. החזר את התוספת הכימית ל-20 ° c. במקרה הצורך, יש לאחסן את המנה הכימית ב-4 ° צ' למשך שבוע לאחר הפשרה.</li>
			<li>מערבולת מיד (10 s) כדי להבטיח complexation של vivo משלוח מגיב-antagomiR.</li>
			<li>מודטה the vivo משלוח מגיב antagomiR תערובת במשך 30 דקות ב 50 ° c. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לשחזר את המדגם.</li>
			<li>לדלל את מורכבות 6-קיפול על-ידי הוספת 1360 μL של PBS pH 7.4 ומערבבים היטב.</li>
			<li>המשך עם משלוח vivo של מתחם הantagomiR-מגיב (8 עכברים/תנאי), או אחסן את הקומפלקס ב -4 ° צ' עד שבוע לפני ההזרקה. הכנס 200 μL מוסרית לכל גידול (2 nmol של antagomiR). הערה: אמצעי האחסון והכמות של antagomiR אינו תלוי בעוצמת הגידול.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לבצע את הטיפול 3 פעמים בכל שבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך 2 שבועות.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח גידול בגידולים
	<ol>
<li>הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב (ראה טבלת חומרים) תת-עורי בכל נקודת זמן עם מזרק 1 מ ל עם שולחן 27g 1/2 ' ' (0.4 mm x 13 מ"מ) מחט.<ol>
<li>ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן. להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.</li>
			<li>החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>צלם את האות הביולומיאלי עם תוכנת הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים). הערה: אפשר להשתמש גם כדי למדוד את נפח הגידול ואת צמיחת הגידול.
</li>
		<li>לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.</li>
	</ol></li>
	<li>כריתה של הגידול
	<ol>
<li>שבעה ימים לאחר סיום הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בלוטת התריס אורתוטופית של תאים וטיפול antagomiR מערכתי
<ol><li>הכנה לתאים
	<ol>
<li>מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא כדי לבטא מבנה טרנסגניים המבטא באופן מוגזם GFP ו לluciferase. בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.</li>
		<li>לגדל תאים אלה בתוספת DMEM עם אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) ו-10% FBS ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
		<li>להשעות 1 x 105 תאים 5 ΜL של PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>תא החיסון לבלוטת התריס של עכברים
	<ol>
<li>הכנס 100 μL של כאבים (בופרינורפין) ו 100 μL של אנטיביוטיקה (צפלוספורין) תת-עורי לתוך 7-שבוע בן BALB/c נו/נו עכברים. לחטא את אתר ההזרקה. עם אלכוהול</li>
		<li>הכנס 5 μL של פתרון התא לתוך בלוטת התריס של העכברים.<ol>
<li>לשים את העכבר באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ולמקם אותו תחת stereomicroscope בארון זרימה סטרילית.  להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.</li>
			<li>החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.</li>
			<li>עבור כל עכבר, לחטא את הצוואר עם שפתי-העין ולעשות חתך של המשוער 2 ס מ בעור עם מספריים. לפתוח פעם, לחשוף את הצוואר על ידי העקירה של בלוטות הרוק.</li>
			<li>לנתח את שרירי הרצועה באמצעות מלקחיים ו/או מספריים לחשוף את קנה הנשימה ואת בלוטת התריס. באמצעות הזרקת מזרק מיקרולויטר 10 μL 5 μL של פתרון התא לתוך כדורית בלוטת התריס הימנית, ממוקם בצד של הסחוס cricoid.</li>
			<li>למקם מחדש את בלוטות הרוק ולתפור את החתך עם משי באמצעות התפר קלוע, מצופה, לא נספגים תפרים.</li>
			<li>הוסף שפתי-על לאזור הפצע ולמקם את העכבר על שמיכה תרמיים בזמן שהוא מתאושש מן ההרדמה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>למחרת לאחר ניתוח, להזריק תת-עורי משכך כאבים (buprenorphine) ולהוסיף 3 מ ל איבופרופן נוזלי (40 mg/mL) לתוך 250 mL של מי שתייה במשך 1 שבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>AntagomiR מערכתית טיפול הערה: בצע שלב זה 2-3 שבועות לאחר הזרקת התא, כאשר האות הביולומיאלי נמצא בזיהוי.<ol>
<li>השהה את antagomiR או את השליטה השלילית במים מזוקקים RNase-free.</li>
		<li>לפני הזריקה, להכין 7 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב עבור כל זריקה.<ol>
<li>עבור antagomiR ו ב vivo מסירה הכנה הפתרון מגיב לראות שלב 1.3 אבל להוסיף 7 nmol של מעכב miRNA לכל עכבר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מנהל את הפתרון באופן מבוקר על ידי הזרקה רטרו מסלולית של הסינוס ורידים של העכבר. בסדר. הערה: להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (צביטה הבוהן המשרד).</li>
		<li>פנקו את העכברים 3 פעמים בשבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך שבועיים.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח גידול בגידולים
	<ol>
<li>לקבוע את אות הגידול הביולומיאלי פעמיים בשבוע כדי לחשב את צמיחת הגידול.<ol>
<li>הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב בכל נקודת זמן באמצעות הזרקה תת עורית.</li>
			<li>ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ותמונה האות ביולומינטיום עם תוכנת דימות vivo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.</li>
	</ol></li>
	<li>כריתה של הגידול
	<ol>
<li>שבעה ימים לאחר סיום תקופת הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Thyroid+Cancer+Incidence+and+Mortality+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).</li>
<li>Landa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+hallmarks+of+poorly+differentiated+and+anaplastic+thyroid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).</li>
<li>Gregory, R. I., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis and cancer.</a> Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).</li>
<li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li>
<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as oncogenes.</a> Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Reserch Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+characterization+of+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma.</a> Cell. 159 (3), 676-690 (2014).</li>
<li>Li, Z., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+microRNAs%3A+current+status+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).</li>
<li>Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+microRNA+expression+in+thyroid+neoplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+thyroid+development%2C+function+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Deregulation+in+Anaplastic+Thyroid+Cancer+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 743450(2014).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+Tumours%3A+Advances+in+the+molecular+pathogenesis+of+thyroid+cancer%3A+lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome.</a> European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-146b-3p%2FPAX8%2FNIS+Regulatory+Circuit+Modulates+the+Differentiation+Phenotype+and+Function+of+Thyroid+Cells+during+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis.</a> Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).</li>
<li>Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-146b-5p+upregulates+migration+and+invasion+of+different+Papillary+Thyroid+Carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 16, 108(2016).</li>
<li>Lee, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-222+and+microRNA-146b+are+tissue+and+circulating+biomarkers+of+recurrent+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer.</a> Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-146b-5p+promotes+metastasis+and+induces+epithelial-mesenchymal+transition+in+thyroid+cancer+by+targeting+ZNRF3.+Cellular+Physiology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry.</a> International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-146b+promotes+PI3K%2FAKT+pathway+hyperactivation+and+thyroid+cancer+progression+by+targeting+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN.</a> Oncogene. , (2018).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , In press (2019).</li>
<li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

נייר זה מתאר שיטה ללמוד בפונקציה vivo של miRNA כדי להבין טוב יותר את תפקידה בייזום הגידול והתקדמות, ואת הפוטנציאל שלה כיעד טיפולית בסרטן בלוטת התריס. מודלים מבע הגידול כאן מבוססים על השימוש בתאים שניתן מעקב על ידי האות הביולומינציה שלהם, המתיר את המדידה של גידול בגידול בvivo תחת השפעת הטיפול. בנוסף, אנו מתארים את השימוש בטיפול miRNA מבוסס על סרטן בלוטת התריס, אשר כרגע בשלבים המוקדמים.
בדקנו לראשונה את הכדאיות של miRNA כיעד טיפולית באמצעות מודל השתלת תת עורית, שבו תאים סרטניים בבלוטת התריס הוזר...

סרטן בלוטת התריס הוא ממאירות אנדוקרינית עם שכיחות הולך וגובר, למרות במונחים כלליים יש תוצאה טובה1. עם זאת, חלק מהחולים לפתח צורות אגרסיביות של המחלה כי הם ללא טיפול ובסיסים מולקולריים הבינו בצורה עלובה2.
miRNAs הם 22-נוקלאוטיד ארוך שאינו קידוד RNAs כי לווסת ביטוי גנים ברקמות רבות, בדרך כלל על ידי כריכת זוג בסיס ל 3 ' אזור untranslational (3 ' UTR) של שליח היעד RNAs (mRNAs), הפעלה של השפלה או הדיכוי הטרנסאפילי של Mrnas מיכל שלוש , 4. יש ראיות הגוברת הוכחת כי רגולציה של הביטוי מיקרואורנה הוא סימן ההיכר של סרטן, כמו אלה מולקולות לווסת איתות מתרבים, הגירה, הפלישה גרורות, והוא יכול לספק התנגדות אפופטוזיס 5,6. בשנים האחרונות, מחקרים רבים זיהו miRNAs כמו סמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, כמו גם מטרות טיפוליות7, מתן ממד חדש להערכת סרטן וטיפול.
mirnas לקחו את הבמה במרכז האונקולוגיה האנושית כמו נהגים מרכזיים של האדם בלוטת התריס נחיים8,9,10,11,12. בין miRNAs מוסדר, מיר-146b הוא מבוטא מאוד בבלוטת התריס קרצינומה (PTC) גידולים והוכח באופן משמעותי להגדיל את התפשטות התא, ולהיות משויך אגרסיביות ופרוגנוזה עגומה6, מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. יתר על כן, מיר-146b מסדיר מספר גנים בלוטת התריס המעורבים בבידול12, וגם גנים חשובים מדכא הגידול כגון PTEN16 ו DICER117. למרות החשיבות שלהם בביולוגיה של סרטן, miRNA מבוססי טיפול בסרטן עדיין בשלבים המוקדמים שלה, ומחקרים מעטים מאוד התייחסו לסרטן בלוטת התריס-התכופים ביותר של גידולים האנדוקרינית18. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שני דגמי העכבר השונים עם האדם הנגזר גידולים, שבו המינהל של מירנה סינתטי מעכבי (antagomiR) כי מעכב באופן ספציפי miRNA הסלולר יכול לחסום את צמיחת הגידול. השתמשנו לראשונה במודל משותף של מבע, ואת intratumor המקומי הממשל של antagomiR ירד גידול הגידול נמדד כירידה בביולומילומינציה הגידול16. בגלל הקמתה של דגמים חזקים של העכבר מחקה התקדמות הגידול האנושי חיוני כדי לפתח גישות טיפוליות ייחודי, אורתודהשרשה של גידולים אנושיים העיקרי היא פלטפורמה יקר יותר עבור אימות קליני של תרופות חדשות מאשר דגמים השרשה תת-עורית. כך, על מנת להעריך טוב יותר את הפוטנציאל התרפויטי של antagomiR, השתמשנו מודל העכבר אורתוטופית עם משלוח מערכתי בזרם הדם, קבלת תוצאות זהות.

<table><tbody><tr><td>AntagomiR: mirVana miRNA מעכב</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464088</td><td>In Vivo</td></tr><tr><td>Ready Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>High Concentration Corning</td><td>#354248</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן DICER</td><td>Abcam</td><td>ab14601</td><td>IHQ: 1/100</td></tr><tr><td>In vivo מגיב משלוח: Invivofectamine 3.0 Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>IVF3005</td><td></td></tr><tr><td>In vivo תוכנת הדמיה: IVIS-Lumina II Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקרה שלילית: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464077</td><td>In Vivo Ready</td></tr><tr><td>PCNA נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab92552</td><td>WB: 1/2,000</td></tr><tr><td>PTEN נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7974</td><td>WB: 1/1,000</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - מצע ביולומינסנט מלח K+</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>מדולל ב-PBS</td></tr></tbody></table>

ב vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) הם הרגולטורים חשובים של ביטוי גנים דרך היכולת שלהם לערער את היציבות mRNA ולעכב את התרגום של Mrna היעד. מספר גדל והולך של מחקרים זיהו miRNAs כסמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, וגם כמו מטרות טיפוליות, הוספת ממד נוסף להערכת סרטן וטיפול. בהקשר של סרטן בלוטת התריס, התוצאות tuמוריגנזה לא רק מוטציות בגנים חשובים, אלא גם מהבעת היתר של miRNAs רבים. בהתאם, התפקיד של miRNAs בשליטה של ביטוי גנים בלוטת התריס מתפתחת כמנגנון חשוב בסרטן. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעות של משלוח miRNA-מעכבי כמו מודאליות טיפולית בסרטן בלוטת התריס באמצעות השתלת הגידול האנושי מודלים אורתוקפית העכבר. לאחר בלוטת התריס יציבה הנדסה מוסרי תאים המבטא GFP ו לluciferase, תאים מוזרק לתוך עכברים ערומים לפתח גידולים, אשר ניתן לאחר מכן ביולומינסנציה. בעיכוב vivo של miRNA יכול להפחית את צמיחת הגידול ו upregulate miRNA מטרות גנים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את חשיבותו של miRNA נחושה בvivo, בנוסף לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

השתמשנו שני מודלים עכברים שונים כדי לקבוע אם נטרול של miRNA יכול לדכא את צמיחת הגידול. לכן, הגידול האנושי בלוטת התריס Cal62-לוק תאים היו תת-עורי וזרק לתוך מאגפים של עכברים ערומים כדי ליצור דגם xenograph. לאחר שבועיים הוקמו גידולים וניתן למדוד אותם בעזרת מחוגות. בשלב זה, עכברים הוזרקו מבחינה מוסרית עם מיר-146b-מעכבי, או שליטה מתאימה, ואת נפח הגידול היה בעקבות שבועיים נוספים (איור 1A). כפי שמוצג באיור 1B, הצמיחה של גידולים intratumorally מוסרית הוזרק עם מיר-146b-מ...

פרוטוקול זה מתאר מבע ו אורתובנושא מודלים העכבר של בלוטת התריס האנושית tumorigenesis כפלטפורמה לבדוק טיפולים מעכבי מבוססי-אורנה. גישה זו אידיאלית כדי ללמוד את הפונקציה של RNAs ללא קידוד והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות חדשות.

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

אנו מבצעים את הטיפול הראשון, המבוסס על מעכב microRNA במודל סרטן בלוטת התריס. טיפולים מתפתחים אלה מראים הבטחה לטיפול במחלה זו. סוג זה של מודל אורתוטופי, באמצעות מסלול מערכתי של אספקת טיפול, מקל על אימות של תרופות מבוססות microRNA חדש.למרות שאנו משתמשים במודל אורתוטופי להשתלת תאים סרטניים בבלוטת התריס האנושית לתוך בלוטת התריס של העכבר, מודלים אלה יכולים להיות כל מערכתית עבור סוגים אחרים של סרטן. הדגמת ההליך עם יוליה רמירז-ויה ואדריאן אקונה תהיה רקל ארושה ריסקו. היא טכנאית מהמכון שלנו.לאחר הקמת CAL-62 קו תאים סרטן בלוטת התריס האנושית בינוני שלם, להשעות 1 פעמים 10 כדי aliquot התא השישי ב 50 microliters של PBS ב 4 מעלות צלזיוס, ומערבבים את התאים עם נפח שווה של מטריצת קרום מרתף. לטעון את התאים לתוך מזרק 1 מיליליטר, מצויד במחט 27 gage חצי אינץ ', ולהזריק תת עורית 100 microliters של המדגם לתוך האגף השמאלי של 6 שבועות שסתום immunodeficient C עכבר עירום. שבועיים לאחר ההזרקה, להוסיף את antagomiR או פתרון חיץ טיפול מבוקר 160 microliters של טמפרטורת החדר ב vivo משלוח reagent בצינור 1 נקודה 5 מיליליטר.ומיד מערבולת הפתרון במשך 10 שניות כדי להבטיח את המורכבות של התערובת. להחגירה את פתרון הטיפול במשך 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ואחריו צנטריפוגה קצרה בצנטריפוגה מיקרו. לאחר מכן, לדלל את מתחם הטיפול המשום פי שישה עם PBS טרי ערבוב יסודי.ולהזריק את כל נפח 200 microliter של הטיפול ישירות לתוך הגידול. להזריק 50 microliters של 40 מיליגרם לליטר D-לוציפרין מצע פתרון תת עורית 2 פעמים בשבוע, לתוך כל חיה ניסיונית. הקפד לאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן לאחר הרדמה isoflurane.מניחים את החיה בתא של מערכת הדמיה bioluminescence in vivo, ותמונה אות bioluminescence עם תוכנת הדמיה in vivo על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ואז לנתח את הגידול. השוואת שני הטיפולים וקביעת המשמעות והבדלי הצמיחה באמצעות בדיקת T.עבור חיסון תאים גידול בלוטת התריס orthotopic להשעות aliquot של תאי CAL-62 ב 5 microliters של PBS, והזרקת תת עורית 100 microliters של משכך כאבים ו 100 microliters של אנטיביוטיקה לתוך 7 שבועות שסתום C עכבר עירום. לאחר אישור תגובה חסרה לצביטת בוהן, מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ ניתוח וחיטוי הצוואר של החיה עם iodopovidone. לאחר מכן, לעשות חתך של כ 2 ס"מ בעור, ולעקור את העטרה הרוק לחשוף את הצוואר.השתמש מדחפי ניתוח, ו / או מספריים, כדי לנתח את שרירי הרצועה כדי לחשוף את קנה הנשימה ובלוטת התריס, ולהשתמש 10 מיקרוליטר מזרק, כדי להזריק את נפח 5 microliter של תאים סרטניים לתוך אוני בלוטת התריס הימנית, הממוקם בצד של הסחוס cricoid. כאשר כל התאים נמסרו, למקם מחדש את העטרה הרוק, ולהשתמש משי קלוע, מצופה, תפרים שאינם נספגים כדי לסגור את החתך. לאחר מכן להחיל iodopovidone על אזור הפצע, ולהחיל את העכבר על שמיכה תרמית עם ניטור עד החלמה מלאה.שבועיים עד שלושה שבועות לאחר הזרקת התאים האינטרתתירואידיים, הכינו את פתרון הטיפול כפי שהוכח, ומסרו את הפתרון דרך הווריד על ידי הזרקת רטרו-מסלולית של הסינוס הווריד של החיה נושאת הגידול בבלוטת התריס. בניסוי מייצג זה, הצמיחה של גידולים מוזרק דרך הפה ללא מעכב microRNA 146B, דוכא באופן משמעותי ביחס לשליטה השלילית. רמות ביטוי תוך-טבעי של כמה סמני התפשטות נצפו גם ברמות נמוכות, גידולים שטופלו antagomiR, בהשוואה לגידולים בשליטה.בנוסף, ניתן ללמוד את ההתאוששות של מטרות המיקרו-רנ"א באמצעות ניתוח של RNA המופק מגידול, או חלבון. באופן קולקטיבי חושף כי עיכוב in vivo של RNA מיקרו בודדים יעיל, ניתן לנצל טיפולית לטיפולים בסרטן בלוטת התריס. ניתוח היסטולוגי של גידולים בבלוטת התריס שהוקמו בעכברים כפי שהוכח, מאפשר כתמים לתאי האפיתל המקיפים את הגידול, חושף את ארכיטקטורת זקיק בלוטת התריס של רקמת הגידול.יש לציין כי הזרקה תוך וריד של מעכב microRNA 146B לעכברים, עם גידול מבוסס, גורמת לירידה משמעותית בנפח הגידול בהשוואה לבעלי חיים שטופלו בשליטה. כמו כן, הביטוי של microRNA שתואר לאחרונה 146B היעד DICER1 בגידול העיקרי, עולה לאחר טיפול אנטי RNA 146B, עוד יותר מדגיש את הפוטנציאל של עיכוב של ביטוי מיקרו-רנ"א indogenous ולכן שחזור של גנים היעד של זה כטיפול בסרטן בלוטת התריס. טכניקה זו, ואת תוצאות השפתיים הבאות, לפתוח את האפשרות של לחקור טיפולים חדשים המבוססים על RNA שאינו מרפא לטיפול בסרטן בלוטת התריס.

in-vivo-inhibition-of-microrna-to-decrease-tumor-growth-in-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

סרטון זה מדגים את העברת in vivo של מעכבי miRNA כסוכנים טיפוליים נגד צמיחת הגידול במודלים אורתוטופיים של עכברים. מתן תוך-גידולי של מעכבי miRNA סינתטיים או אנטגומירים מאפשר להם לקשור ולעכב miRNA אנדוגניים, ובכך לגרום להגברת הרגולציה של mRNA ולדיכוי צמיחת הגידול.

מידול טיפול תוך גידולי עם מעכבי miRNA: שיטה לניתוח ההשפעה של מעכבי miRNA על צמיחת הגידול במודל Murine

סרטון זה מתאר את הליך החיסון האורתוטופי של תאי סרטן בלוטת התריס לבלוטת התריס של מודלים עכבריים, אשר עשוי לשמש פלטפורמה רבת ערך להערכת סרטן וגילוי אסטרטגיות טיפול פוטנציאליות.

חיסון אורתוטופי של תאי סרטן בלוטת התריס לתוך בלוטת התריס מורין: הליך להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן בלוטת התריס

עיכוב רקמות ספציפיות microRNA היא טכנולוגיה זה לא מפותח בתחום microRNA. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול לעכב ממשפחת מיר-181 microRNA בתאים myoblast בהצלחה מכל הלב. טכנולוגיית Nanovector משמש כדי לספק microRNA ספוג המדגים משמעותי ויוו אירובי ספציפיים מיר-181 משפחה עיכוב.

אין ויוו Nanovector מסירת MicroRNA ספציפי הלב-ספוג

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לאספקה in vivo של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטיים הנושאים אוליגומרים של RNA לסרטן שד גרורתי במודלים של בעלי חיים, ומספקים גישה בת קיימא מבחינה קלינית להשתקה טיפולית של חומצות גרעין אונקוגניות.

ניטור הצטברות ננו-תרופות בגרורות סרטן השד בעכברים

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

חקור עיכוב מיקרואורנה בתוך גוף החיה כדי להפחית צמיחת גידולי סרטן בלוטת התריס בעכברים. שיטה זו מאפשרת בדיקת טיפולים חדשים מבוססי microRNA במודלים אורתוטופיים.

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

גלה סרטונים נוספים