ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

אנו מבצעים את הטיפול הראשון, המבוסס על מעכב microRNA במודל סרטן בלוטת התריס. טיפולים מתפתחים אלה מראים הבטחה לטיפול במחלה זו. סוג זה של מודל אורתוטופי, באמצעות מסלול מערכתי של אספקת טיפול, מקל על אימות של תרופות מבוססות microRNA חדש.

למרות שאנו משתמשים במודל אורתוטופי להשתלת תאים סרטניים בבלוטת התריס האנושית לתוך בלוטת התריס של העכבר, מודלים אלה יכולים להיות כל מערכתית עבור סוגים אחרים של סרטן. הדגמת ההליך עם יוליה רמירז-ויה ואדריאן אקונה תהיה רקל ארושה ריסקו. היא טכנאית מהמכון שלנו.

לאחר הקמת CAL-62 קו תאים סרטן בלוטת התריס האנושית בינוני שלם, להשעות 1 פעמים 10 כדי aliquot התא השישי ב 50 microliters של PBS ב 4 מעלות צלזיוס, ומערבבים את התאים עם נפח שווה של מטריצת קרום מרתף. לטעון את התאים לתוך מזרק 1 מיליליטר, מצויד במחט 27 gage חצי אינץ ', ולהזריק תת עורית 100 microliters של המדגם לתוך האגף השמאלי של 6 שבועות שסתום immunodeficient C עכבר עירום. שבועיים לאחר ההזרקה, להוסיף את antagomiR או פתרון חיץ טיפול מבוקר 160 microliters של טמפרטורת החדר ב vivo משלוח reagent בצינור 1 נקודה 5 מיליליטר.

ומיד מערבולת הפתרון במשך 10 שניות כדי להבטיח את המורכבות של התערובת. להחגירה את פתרון הטיפול במשך 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ואחריו צנטריפוגה קצרה בצנטריפוגה מיקרו. לאחר מכן, לדלל את מתחם הטיפול המשום פי שישה עם PBS טרי ערבוב יסודי.

ולהזריק את כל נפח 200 microliter של הטיפול ישירות לתוך הגידול. להזריק 50 microliters של 40 מיליגרם לליטר D-לוציפרין מצע פתרון תת עורית 2 פעמים בשבוע, לתוך כל חיה ניסיונית. הקפד לאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן לאחר הרדמה isoflurane.

מניחים את החיה בתא של מערכת הדמיה bioluminescence in vivo, ותמונה אות bioluminescence עם תוכנת הדמיה in vivo על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ואז לנתח את הגידול. השוואת שני הטיפולים וקביעת המשמעות והבדלי הצמיחה באמצעות בדיקת T.

עבור חיסון תאים גידול בלוטת התריס orthotopic להשעות aliquot של תאי CAL-62 ב 5 microliters של PBS, והזרקת תת עורית 100 microliters של משכך כאבים ו 100 microliters של אנטיביוטיקה לתוך 7 שבועות שסתום C עכבר עירום. לאחר אישור תגובה חסרה לצביטת בוהן, מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ ניתוח וחיטוי הצוואר של החיה עם iodopovidone. לאחר מכן, לעשות חתך של כ 2 ס"מ בעור, ולעקור את העטרה הרוק לחשוף את הצוואר.

השתמש מדחפי ניתוח, ו / או מספריים, כדי לנתח את שרירי הרצועה כדי לחשוף את קנה הנשימה ובלוטת התריס, ולהשתמש 10 מיקרוליטר מזרק, כדי להזריק את נפח 5 microliter של תאים סרטניים לתוך אוני בלוטת התריס הימנית, הממוקם בצד של הסחוס cricoid. כאשר כל התאים נמסרו, למקם מחדש את העטרה הרוק, ולהשתמש משי קלוע, מצופה, תפרים שאינם נספגים כדי לסגור את החתך. לאחר מכן להחיל iodopovidone על אזור הפצע, ולהחיל את העכבר על שמיכה תרמית עם ניטור עד החלמה מלאה.

שבועיים עד שלושה שבועות לאחר הזרקת התאים האינטרתתירואידיים, הכינו את פתרון הטיפול כפי שהוכח, ומסרו את הפתרון דרך הווריד על ידי הזרקת רטרו-מסלולית של הסינוס הווריד של החיה נושאת הגידול בבלוטת התריס. בניסוי מייצג זה, הצמיחה של גידולים מוזרק דרך הפה ללא מעכב microRNA 146B, דוכא באופן משמעותי ביחס לשליטה השלילית. רמות ביטוי תוך-טבעי של כמה סמני התפשטות נצפו גם ברמות נמוכות, גידולים שטופלו antagomiR, בהשוואה לגידולים בשליטה.

בנוסף, ניתן ללמוד את ההתאוששות של מטרות המיקרו-רנ"א באמצעות ניתוח של RNA המופק מגידול, או חלבון. באופן קולקטיבי חושף כי עיכוב in vivo של RNA מיקרו בודדים יעיל, ניתן לנצל טיפולית לטיפולים בסרטן בלוטת התריס. ניתוח היסטולוגי של גידולים בבלוטת התריס שהוקמו בעכברים כפי שהוכח, מאפשר כתמים לתאי האפיתל המקיפים את הגידול, חושף את ארכיטקטורת זקיק בלוטת התריס של רקמת הגידול.

יש לציין כי הזרקה תוך וריד של מעכב microRNA 146B לעכברים, עם גידול מבוסס, גורמת לירידה משמעותית בנפח הגידול בהשוואה לבעלי חיים שטופלו בשליטה. כמו כן, הביטוי של microRNA שתואר לאחרונה 146B היעד DICER1 בגידול העיקרי, עולה לאחר טיפול אנטי RNA 146B, עוד יותר מדגיש את הפוטנציאל של עיכוב של ביטוי מיקרו-רנ"א indogenous ולכן שחזור של גנים היעד של זה כטיפול בסרטן בלוטת התריס. טכניקה זו, ואת תוצאות השפתיים הבאות, לפתוח את האפשרות של לחקור טיפולים חדשים המבוססים על RNA שאינו מרפא לטיפול בסרטן בלוטת התריס.