שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

התמונה מבוססת מיקרונוקלוס בדיקה יכול להתגבר על מספר מגבלות של שיטות כגון מיקרוסקופ אוטומטי ציטומטריית זרימה קונבנציונלית, כולל תפוקה נמוכה וחוסר אישור חזותי של אירועים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שכל האירועים הנדרשים כדי לקבוע genotoxicity ו cytotoxicity ניתן באופן אוטומטי תמונה, מזוהה, הבקיע ללא צורך ליצור שקופיות מיקרוסקופ. לחשיפה לתאים לקלסטוגנים ו/או אנוגנים, יש להוסיף מילימטר אחד של הכימיקל בעל העניין ל-7 עד 8 פעמים 10 לחמישית מתאי הניסוי בתשעה מיליליטר של מדיום תרבות התאים המתאים בבקבוק T25 ומיליליטר מים אחד לתרבות הבקרה.

הדגירה את הבקבוקים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות לפני העברת התאים אחד 15 צינור פוליפרופילן מיליליטר לכל בקבוק. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 10 מיליליטר של תרבות טרייה בינוני לכל צינור עבור זריעה חדש T25 תרבות flasks. לאחר מכן להוסיף 150 microliters של ריכוז המלאי של cytochalasin B לכל בקבוקון כדי להשיג ריכוז סופי של שלושה מיקרוגרם למיליליטר.

החזירו את הבקבוקים לאנקובטור לזמן החלמה השווה ל-1.5 עד 2 פעמים הכפלה, כפי שהומלץ על ידי הארגון לשיתוף פעולה כלכלי והנחיות פיתוח. בסוף תקופת ההחלמה, להעביר את התרבות לתוך צינורות פוליפרופילן 15 מיליליטר בודדים עבור צנטריפוגה ו resuspend כדורי בחמישה מיליליטר של 75 מילימולר אשלגן כלורי. מערבבים בעדינות על ידי היפוך שלוש פעמים ודגירה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.

בסוף הדגירה, מוסיפים שני מיליליטר של ארבעה אחוזים פורמלין לכל מדגם ומערבבים בעדינות עם שלושה היפוכים. מחזירים את הדגימות לארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני איסוף התאים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר כדורי ב 100 microliters של פורמלין ארבעה אחוז טרי במשך 20 דקות.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים הקבועים בחמישה מיליליטר של חיץ לשטוף לכל צינור על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי ב 100 microliters של חיץ לשטוף לכל צינור. לאחר מכן, להעביר את הדגימות לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר לסמוך על hemocytometer. הוסף חמישה מיקרוליטרים של 100 מיקרוגרם למיליליטר Hoechst 33342 לכל 1.0 x 10 לששים תאים למיליליטר ו -10 מיקרוליטר של 500 מיקרוגרם למיליליטר RNase לכל 100 מיקרוליטר של מדגם לצינור.

לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני, צנטריפוגה הדגימות במיקרוצנטריפוגה ולהסיר את כל מלבד 30 microliters של על טבעי מכל צינור. ואז בזהירות resuspend את הדגימות, דואג לא לגרום היווצרות בועה. אם בועות מופיעות על ההתכוונות מחדש, בעדינות להעיף את הצינור כדי להסיר אותם.

כדי להפעיל את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימת הדמיה רב-ספקטרלית, הפעל תחילה את לייזר 405 ננומטר והגדר את כוח הלייזר ל-10 מילי-וואט. השבת את כל הלייזרים האחרים, כולל לייזר פיזור הצד, והגדר את השדה הבהיר לערוצים 1 ו-9. ודא שמחוון ההגדלה מוגדר ל- 60x, שנבחר מצב הרגישות הגבוהה, ושתושאי ערוץ אחד, שבע ותשע בלבד מוצגים בגלריה התמונות.

לחץ על חלקת פיזור ובחר את כל האוכלוסיה ואת האזור M01 בציר X. בחרו 'יחס גובה-רוחב M01' בציר Y ולחצו על אזור ריבועי כדי לצייר אזור מסביב לתאים הבודדים. תן שם לאזור זה תאים בודדים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ההתוויה כדי לבחור אזורים.

סמן את אזור התאים הבודדים ושנה את קואורדינטות X ל- 100 ו- 900 וקואורדינטות Y ל- 0.75 ואחד. הגדר את פרמטרי הרכישה וציין את שם הקובץ ואת תיקיית היעד. לאחר מכן שנה את מספר האירועים ל- 20,000, בחר את האוכלוסיה החיובית של הדנ"א והפעל את הדגימה הראשונה.

כדי לפתוח קובץ נתונים ב- IDEAS, לחץ על התחל ניתוח כדי להפעיל את אשף פתיחת הקבצים, ודפדף כדי לבחור את קובץ התמונה הגולמי הרצוי. לאחר מכן לחץ על הבא ו אתר תא במחסן בגלריה התמונות. ליצירת מסיכה, לחצו לבחירת התמונה המעניינים ופתיחת לשונית הניתוח.

לחץ על מסיכות, חדש ופונקציה כדי לבחור LevelSet. תחת מסיכה, בחר M07 ומסכה ברמה בינונית והגדר את קנה המידה של פרטי מיתאר לשלושה. לאחר מכן לחץ על אישור פעמיים.

כדי לזהות תכונות תאים במחסן, פתח את הכרטיסיה ניתוח ובחר תכונות וחדש. בתיבה 'סוג תכונה', בחרו 'ספירת ספוט'. בתיבה 'מסיכה', בחרו את המסיכה המקוצרת הסופית והגדירו את החיבור לארבעה, לאחר מכן שנו את השם ל- Spot Count BNC ולחצו על הלחצן 'אשר' ו'סגור' לחישוב ערכי התכונות.

עבור היסטוגרמת תאים במונקלציה של ספוט, לחץ על היסטוגרמה ובחר לא אפופוטופי כאוכלוסיית האב. לתכונה ציר X, בחרו 'ספירת ספוט BNC' ולחצו על 'אשר' ו'אזור ליניארי', ולאחר מכן ציירו אזור לאורך Bim Two ותנו שם לאזור זה 2N. ליצירת מסיכת מיקרונוקלוס, בחרו תא מחוסם המכיל מיקרונוקלאוס מגריית התמונות, ופתחו מסיכות בכרטיסיה 'ניתוח'.

ליצירת מסיכת זיהוי ספוט, לחצו על 'חדש' ו'פונקציה' ובחרו 'ספוט'. ודא שלחצן הפתגם הבהיר נבחר ובחר M07 תחת מסיכה. הגדר את יחס הרקע בין ספוט לתא ואת הרדיוס המינימלי לשניים והגדר את הרדיוס המרבי לשישה.

לחץ על אישור ועל אישור כדי להוסיף את המסיכה לרשימה משמאל ולאחר מכן לחץ על חדש כדי ליצור מסיכה נוספת. לחץ על ערוץ ספוט M07 שבע בהיר שתיים שתיים מסיכה ולחץ על החץ למטה כדי להוסיף אותו להגדרת המסיכה ולחץ על האופרטורים וגם לא. לחצו על החץ למטה כדי להוסיף מסיכת טווח רחבה להגדרת המסיכה.

כדי ליצור מסיכת אוכלוסיה רב-גרעינית, לחץ על ניתוח, מסיכות, חדש ותפקוד. תחת פונקציה, בחר טווח. תחת מסיכה, בחר 'ערכת קו פרשת מים' M07 Channel07, אמצע, שלוש, שתיים והגדר את התמונה כך שתוצג לערוץ 07.

הגדר את ערכי השטח המינימלי והמקסימום ל- 135 ו- 5000, בהתאמה, והגדר את ערכי יחס הגובה-רוחב המינימלי והמקסימום ל- 0.4 ואחד, בהתאמה. לחץ על אישור וב בשדה השם, שנה את הטקסט כך שיקרא מסיכת POLY ולאחר מכן לחץ על אישור וסגור. כדי ליצור תצוגה מותאמת אישית, לחץ על לחצן מאפייני גלריית תמונות, פתח את הכרטיסיה שילובים ולחץ על חדש.

תחת שם, הזן ערוץ 01 לערוץ 07. לחצו על 'הוסף תמונה', ותחת 'תמונה', בחרו 'ערוץ 01' והגדירו את האחוז ל-100. לחצו שוב על 'הוסף תמונה', ותחת תמונה, בחרו ערוץ 07 והגדירו את האחוז ל-100.

לחץ על הכרטיסיה תצוגה, לחץ על חדש ותחת שם, הזן מסיכות BNC ו- MN. לאחר מכן לחצו על 'הוסף עמודה', ותחת 'סוג תמונה', בחרו 'ערוץ 01' ותחת 'מסיכה', בחרו 'ללא'. לחצו על 'הוסף עמודה', ותחת 'סוג תמונה', בחרו 'ערוץ 07' ותחת 'מסיכה', בחרו 'ללא'.

לחץ על הוספת עמודה, לחץ על לחצן הפתגם ללא הפרדות צבע ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להשלים את התצוגה המותאמת אישית. לחצו על התפריט הנפתח 'תצוגה' ולחצו על התצוגה 'מסיכות BNC ו- MN'. לחצו על הלחצן 'הצג הסתר מסיכות'.

כדי למנות אירועי מפתח, פתח את הכרטיסיה דוחות ולחץ על הגדרת דוח סטטיסטיקה ולאחר מכן, בחלון החדש, לחץ על הוסף עמודות. כדי להוסיף את הסטטיסטיקה של ספירת תאים במחסן, תחת סטטיסטיקה, בחר ספירה ותחת אוכלוסיה נבחרת, בחר את אוכלוסיית BNC ולאחר מכן לחץ על הוסף סטטיסטיקה כדי להוסיף את הסטטיסטיקה לרשימה ולשמור את התבנית. לאחר הוספת כל הנתונים הסטטיסטיים לרשימה, לחץ על סגור ולאחר מכן לחץ על אישור ולאחר מכן שמור את תבנית ניתוח הנתונים.

לעיבוד אצווה של הקבצים הניסיוניים, בתפריט כלים, לחצו על 'קובצי נתונים באצווה' ולחצו על 'הוסף אצווה' בחלון החדש. לחץ על הוסף קבצים כדי לבחור את קבצי הניסוי להוספה לאצווה ולחץ על לחצן פתח תיקיה תחת האפשרות בחר תבנית או קובץ ניתוח נתונים. אתר את התבנית שנשמרה זה עכשיו ופתח אותה.

לחץ על אישור כדי לסגור את החלון הנוכחי. לאחר מכן לחצו על 'שלח אצוות' כדי להתחיל בעיבוד האצווה של כל הקבצים. כאן מוצגות ארבע חלוניות שנבחרו לזיהוי תאים בינקלים.

חלקות והיסטוגרמות bivariate אלה מאפשרות בחירה של תאים בינוקלציה, כמו גם זיהוי של תאים אלה שיש להם שני גרעינים עם מעגליות דומה, אזורים, וימות, כי הם מופרדים היטב זה מזה. תמונות אלה של ברייטפילד והוצ'סט, כמו גם מסכות התאים והמיקרונוקלוסים המינוקלים, מאפשרות זיהוי והרשמה של תאים בינקלים ומיקרונוקלי. היישום של תכונת ספירת הספוט משתמש במסכה רב-גרעינית כדי לזהות תאים מונונוקליאריים, טרינוקלאריים ומרובעים.

לאחר מכן ניתן לסכם את מספר התאים המשולשים והמרובעים כדי להשיג את המספר הסופי של תאים רב-גרעיניים הדרושים לחישוב הציטוקסיקיות. כאן, ערכי גנוטוקסיות וציטוקסיות מייצגים מוצגים עבור הקולצ'ין אנדוגן, מיטומיצין C קלסטוגן, ושליטה שלילית, מניטול, כדי להדגים את תוקף הפרוטוקול. תיוג התאים עם ריכוז מתאים של כתם DNA הוא קריטי כדי להבטיח לכידת תמונה באיכות גבוהה, המאפשר את כל האירועים העיקריים להיות מזוהה בקלות הבקיע.

טכניקות אלה חלות גם על בדיקה micronucleus עבור ביודוסימיטריה קרינה, המאפשר הערכת מינון אצל אנשים שאולי נחשפו לקרינה.