זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

הפרוטוקול שלנו מספק שיטות חלופיות לזיהוי ואפיון של גורמים מארחים ויראליים, גרעינים ולא גרעיניים המשמורים על מחזור הזיהום HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליים ומחלות אחרים הדורשים אפיון מסלולים לא מוצהרים. טכניקות לפתרון בעיות מתוארות לשינוי במודלים אחרים של חלבונים.

הדגמת ההליך תהיה Haitang Li ו Pritsana Chomchan, מדענים במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית במכון המחקר בקמן בעיר התקווה, ורוג'ר מור, חברי ליבת פרוטומיקה עיר התקווה והמחלקה לאימונולוגיה מולקולרית. התחל בגידול HLfB המבטא באופן הדוק את תרבות קו התאים של HeLa בשלושה, 100 מילימטרים של צלחות תרבות לצפיפות כפולה של 10 עד שישה תאים למיליליטר. כאשר התאים מגיעים לריכוז המתאים, מערבבים 20 מיקרוגרם של פלסמיד המכילים את לוקליזציה נוקליולרית Rev אות מוטציה דגל שלוש ראשי של עניין עם 1.76 מיליליטר של TE 79/10 בצינור 15 מיליליטר, ואחריו תוספת של 240 microliters של סידן טוחנת, עם ערבוב יסודי.

לאחר מכן, להעביר את התוכן של הצינור dropwise לתוך צינור חדש 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של 2x HBS, ואחריו ערבוב על מכונת מערבולת. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת המשקעים. מוסיפים מיליליטר אחד של ההשעיה dropwise לכל אחד משלושת, 100 מילימטר HLfB צלחות תרבות תוך מערבולת בעדינות את המדיום.

לאחר אינקובציה של שש שעות באינקובטור תרבות התא, החלף את תערובת ההמרה ב-10 מיליליטר של מדיום תרבות טרי, והחזר את התאים לחממה למשך 42 שעות נוספות. 48 שעות לאחר ההטעה, מניחים כל צלחת על מצע קרח בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות ברמה 2. הסר את מדיית תא התרבות, ולשטוף בעדינות את התאים עם 10 מיליליטר של PBS prechilled, מבלי לשבש את שכבות התא.

השלך את ה- PBS לאחר שטיפה של התאים. לאחר מכן, לטפל בתאים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה, בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז, לכל צלחת. הטיית הלוחות כדי לאסוף את התאים לתוך בריכה, להשתמש מגרד תא לשבש באופן ידני את השכבות.

באמצעות מיקרופיפט 1,000 מיקרוליטר, בריכת lysate מכל צלחת לתוך צינור prechilled, 15 מיליליטר עבור דגירה של 15 דקות על קרח, עם מערבולת כל חמש דקות. בסוף הדגירה, aliquot את lysates לתוך שלושה, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, ולאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 15 מיליליטר, ומשיגים את ריכוז החלבון הוויראלי, כמתואר בכתב היד.

עבור coimmunoprecipitation של לוקליזציה נוקליולר Rev אות שלושה ראשים דגל, לשטוף 25 microliters של חנוזי ג'ל זיקה M2 שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ תיזה טרי, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז, לכל לשטוף. בצע שלבים אלה בחדר קר או עם reagents על קרח. לאחר שטיפה האחרונה, מוסיפים ריכוז של מיליגרם למיליליטר של חלבון ויראלי ליסנט לחרוזים שטוף בנפח סופי של חמישה מיליליטר של חיץ תיזה.

הדגירה את התגובה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. בסוף הדגירה, גלולה את החלבון הנגיפי lysate-נדנוד חרוזים על ידי צנטריפוגה. לאסוף את supernatant למדידה של ריכוז חלבון lysate לאחר immunoprecipitation.

עיין בכתב היד לקבלת הוראות אחסון לדוגמה. מוסיפים 750 מיקרוליטרים של חיץ תמוגה לכדור חרוזים ססיד ליסנט חלבון ויראלי, מעבירים את חרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולשטוף את חרוזים על מסובב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את חרוזים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות נוספות על המסובב, כפי שהוכח רק.

לאחר הכביסה האחרונה, השתמשו בקצה צבט, ארוך וטעון ג'ל כדי להסיר עקבות של מאגר תמיסת תמיסה ממתחם חרוז-coimmununoprecipitation. תן שימוש חוזר ב-55 מיקרוליטרים של חיץ טעינה של פי 2. לאחר מכן, להרתיח את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

טען 25 מיקרוליטרים של eluate על ג'ל כתם מערבי אחד וג'ל SDS-PAGE מכתים קומאסי אחד. לאחר השלמת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים ב 25 מיליליטר של מים אולטרה-חוץ במשך 15 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 100 מיליליטר של רגנט כתם קומאסי על הג'ל.

ראה את כתב היד לפרוטוקול הכתמים המלא. לעיכול רצועות הג'ל, יש להשתמש תחילה בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את רצועות הג'ל מכל נתיב הג'ל, המייצג כל מוטציה, לקוביות של כחמישה מילימטרים. מניחים כל רצועה בצינור מיקרוצנטריפוג נקי של 0.5 מיליליטר.

מכסים את הרצועות פעמיים עם 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט בתסומה של אחד לאחד אצטוניטריל למים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, לייבש את חתיכות ג'ל במשך חמש דקות בצנטריפוגה ואקום. כדי להפחית את החלבונים, לכסות את חתיכות ג'ל מיובש עם 10-מילימול dithiothreitol ב 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט עבור דגירה של שעה אחת ב 56 מעלות צלזיוס, ואחריו אלקילציה ב 100 מילימולאר iodoacetamide במים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן, לכווץ מחדש את חתיכות ג'ל פעמיים עם אצטוניטריל, ואחריו 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט, שניהם עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר ההתייבשות השנייה, ייבשו את חתיכות הג'ל במשך חמש דקות בצנטריפוגה ואקום. להתנפח חתיכות ג'ל עם 50 ננוגרם למיקרוליטר של טריפסין שונה כיתה רצף ב 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט.

לאחר חמש דקות, מכסים את חתיכות הג'ל עם 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט, ולאפשר להם לחזור לחלוטין, הוספת 100 מילימולר נוסף אמוניום ביקרבונט כך חתיכות ג'ל נפוח מכוסים לחלוטין. לאחר מכן, הדגירה חתיכות ג'ל לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם 1/10 של נפח הדגימות עם 10% חומצה formic במים למחרת בבוקר, ולאסוף את supernatant מכל צינור. אות לוקליזציה של נוקליולרית של Rev ניתן לגילוי תחת שלושה תנאי מאגר תיזה שונים המכילים ריכוזים שונים של נתרן כלורי.

B23 ניתן לגילוי גם במאגר תזה המכיל את ריכוז המלח התחתון, בקושי ניתן לגילוי במאגר תזה המכיל את ריכוז המלח הבינוני, ובלתי ניתן לגילוי במאגר תזה המכיל ריכוז מלח גבוה. זיהוי B23 הוא אופטימלי במאגר תיזה המכיל את ריכוז נתרן כלוריד נמוך עם סוג פראי Rev שלושה ראש דגל ומאבד זיקה עם אות לוקליזציה נוקליולר Rev M1 שלושה ראשים דגל. זיקה B23 עם סוג פראי Rev שלושה ראש הדגל גם פוחתת עם ריכוז מלח גבוה יותר, ואת השליטה השלילית pcDNA אינו מניב immunodetection לא ספציפי לאחר immunoprecipitation בשני תנאי מאגר תזה.

אות לוקליזציה של נוקליולר של Rev דגל תלת-ראשי ניתן לגילוי ביותר לאחר אלוטציה באמצעות רתיחה במאגר טעינה לדוגמה של 2x, בעוד ש- B23 ניתן לזיהוי הן בתנאי הדגירה של מאגר מדגם 37 ו- 95 מעלות צלזיוס. לאחר immunoprecipitation וכתמי כסף, כפי שהוכח, סוג פראי Rev ו Rev לוקליזציה אותות M2, M6, ו M9 ניתנים לגילוי ב 18 קילודלטונים. להקות המתאימות לחלבון B23 נצפו גם בסמן 37 קילודלטון.

כתמים עם רגנט קומאסי מדגים עוד יותר את יכולת האיתור של לוקליזציה נוקליולרית Rev אות דגל שלושה ראש בנוכחות והיעדר מוטציות ב 18 קילודלטונים. השתמש בפקדים רבים, חיוביים ושליליים, לפי הצורך עבור הפניות הנוגעות למודל המחלה שלך במהלך תהליך פתרון הבעיות וההקרנה עבור גורמים מחייבים פוטנציאליים. כל מוטציות מחיקה ונקודה אחת ניתן לבחון עבור פעילות דומיננטית שלילית באמצעות multimerization עם Rev מסוג פראי מנוצל במעצר של HIV-1 שכפול.