אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מהירה ויעילה להשתמש בו זמנית שני assays כדי לסנן כמה מאות תרכובות עבור ההשפעות שלהם על צמיחת התאים. ה- assays יכול לספק לנו מידע על אם תרכובות ספציפיות הן cytotoxic, לעכב את צמיחת התאים, או לשפר את צמיחת התא. על ידי ניצול שתי התרכובות יחד, אנו מסוגלים להגביר את הדיוק ולזהות תרכובות ציטוטוקסיות.

במקרים שבהם התוצאות של שתי הבדיקות מתפצלות, אסטרטגיה זו עשויה לאפשר לנו לזהות תרכובת עם השפעות ייחודיות על התפקוד התאי שניתן לבחון עוד באמצעים אחרים. היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו הוא שהיא מהירה, זולה ואינטנסיבית שאינה עבודה. לאחר השליטה, זה מאפשר לחוקרים לבצע בקלות מסך ראשי של עד 200 תרכובות בשבוע אחד, ולאחר מכן לבצע עקומת תגובה מינון ממצה על 10 עד 15 תרכובות בשבוע אחר.

הדגמת ההליך תהיה אני ורוהיני מניקאם, מדען צוות ועמית פוסט-תואר ראשון מהמעבדה. ראשית, בארון בטיחות ביולוגי, תאי תרבות בבקבוק T75 עם מדיום המל"ל, כך שהם יהיו לפחות 80% confluent בעת תחילת המבחן. ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו-חמצני.

ברגע שהתאים מגיעים ל-80%, מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ושואבים את מדיום המל"ל. מוסיפים שלושה מיליליטר של ניתוב תאים ודגירה במשך חמש דקות באינקובטור. לאחר הדגירה, מוסיפים שבעה מיליליטר של מדיום המל"ל בבקבוקון, ואת פיפטה במרץ כדי להבטיח שכל התאים יתנתקו.

מעבירים את פתרון התא המנותק לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי מהצינור והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום המל"ל. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemocytometer לספור את התאים, ולהוסיף מדיום NSC לתוך הצינור כדי להסתגל מחדש את ריכוז התאים ל 200, 000 תאים למיליליטר.

לאחר מכן, באמצעות שישה מתוך שמונת החריצים של pipettor רב ערוצי שמונה ערוצים כדי צלחת 100 microliters של עמוד תערובת התא בעמודה ב 60 בארות פנימיות של שלוש 96 צלחות היטב כי כבר מצופה מטריצה חוץ תאית. הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום בסיס או בינוני NSC לכל בארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מן בארות החיצוניות המכילות תאים. תחת מיקרוסקופ של תאים, בדקו ויזואלית לפחות 10 בארות בכל אחת משלוש 96 צלחות הבאר כדי לאשר שהתאים יושבים בצפיפות הצפויה.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. הסר את לוחות תרבות התאים מהחרם 16 עד 24 שעות לאחר הפיצול, ושואב את העמודה הבינונית של המל"ל בעמודה אחר עמודה עם צינור רב-תכליתי בן שמונה ערוצים, תוך שימוש רק בשישה מתוך שמונת החריצים מרובי הבאר. הוסיפו 95 מיקרוליטרים של מדיום NSC טרי לכל באר של שלוש הצלחות המשוכפלות, והחזרו את הצלחות לאנקובטור.

עם pipettor רב היטב שמונה ערוצים, להוסיף 49 microliters של מדיום NSC לתוך כל אחד 60 בארות הפנים של U-bottomed ריק, V-bottomed, או עגול תחתית 96 צלחת היטב. בטלו את הריסת צלחת התרכובת הראשית המוכנה. פיפטה מיקרוליטר אחד של המתחם מצלחת האב לכל אחת מ-60 בארות הפנים המכילות את מדיום המל"ל, ומערבבים את המתחם המדולל שלוש פעמים עם צינור עליון ספסל.

לאחר מכן, להסיר את שלוש 96 צלחות באר של NSCs מהאינקובטור ולחלק חמישה microliters של המתחם מדולל לתוך כל באר של שלוש צלחות המכילות תאים להניב דילול אחד עד 1000 עבור הריכוז המורכב הסופי של 10 micromolar עם ריכוז DMSO של 0.1% אינקובט תאים עם תרכובת במשך 72 שעות, ולהמשיך עם assays cytotoxicity. כדי לבצע בדיקת תגובה מינון, להגדיר 96 גם. השתמש בעמודה 2 עבור שישה שכפולים בקרת DMSO, ולבדוק משולשים של עד שלוש תרכובות שונות בדילול סדרתי כפול, בשש מנות, החל במינון גבוה של 10 micromolar.

לדלל ארבעה microliters של 100% DMSO או תרכובת בדיקה ב DMSO לתוך 196 microliters של מדיום NSC בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 או 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטרים של DMSO מדולל לשליטה בארות, ו 50 microliters של תרכובות הבדיקה מדולל הבאר המתאימה שלהם. פיפטה 25 מיקרוליטרים של מדיום המל"ל ל שאר בארות ריקות בחלק הפנימי של צלחת 96 באר.

בעזרת צינור רב-ערוצי, מעבירים 25 מיקרוליטרים של התרכובת מ-10 בארות המיקרומולרים לחמש בארות המיקרומולריות, ומערבבים לפחות חמש פעמים. החלף את טיפים פיפטה, ולחזור על התהליך על ידי ערבוב השורות הנותרות כדי ליצור משולשים בדילול כפול עבור סך של שש מנות עבור כל אחת מהתרכובות. מעבירים חמישה מיקרוליטרים של כל דילול לצלחת חדשה עם תאי תרבות שנבדקים.

מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. לאחר התאים כבר דגירה במשך 72 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה למקם אותו בתוך קורא הלוח. פתח את תוכנת התמונה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים למחקר.

עבור אל מצב ידני של Imager במנהל המשימות ולחץ על לכוד כעת. בחר 96 גם צלחת כמו סוג הכלי. בחרו 10 פעמים להגדלה, וחלבון פלואורסצנטי אדום 531 ו-593 להדמיית tdTomato.

לחץ על באר. לאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, וחשוף אוטומטית לזמן חשיפה מתאים. התאימו ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.

לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על נתח תהליך לעיל כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול. ובחר בכרטיסיה ניתוח.

מימין לתמונה, לחצו על 'ניתוח תאי' ב'הוסף שלב ניתוח' ולחצו על 'התחל'. התמונה מציגה תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. לחץ על הבחירה אפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור טוב יותר תאים בהתבסס על סף הפלואורסצנטיות או גודל התא.

אם התמונה סופרת כראוי את התאים, לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך. לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות. ובחלון הפתוח, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול.

לאחר מכן, בחלון החדש שנפתח, בחר קרא. לחץ על לוח מלא כדי לבחור רק את 60 הבאר המכילות את התאים. לחץ על אישור כדי לשמור שינויים.

לאחר מכן לחץ על אישור בחלון פרוצדורה. לחץ על סמל הפעל כדי להפעיל את הלוח. בבקשה, שמרו את הקובץ ולאחר מכן, בבקשה 'טען לוח', לחצו על הלחצן 'אשר'. עם השלמת ההדמיה, הורד את נתוני ספירת התאים מתוכנית הדמיה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.

בתוך שעתיים מהשלמת הדמיית tdTomato, להתחיל את ההקדמה MTT. לשקול 25 מיליגרם של MTT ולהשעות אותו מחדש בחמישה מיליליטר של מדיום NSC כדי להפוך חמישה מיליגרם לכל פתרון מלאי MTT מיליליטר. Vortex הפתרון במשך כמה דקות, עד שאין משקעים גלויים של MTT.

הסר צלחות תרבות תאים מהחרם ושואב את מדיום תרבות התא. לדלל MTT אחד עד 10 במדיום NSC טרי, ולהוסיף 100 microliters של MTT מדולל לכל באר של תאים. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.

משקעים גרגריים גלויים בערך ביחס למספר התאים באר. שאפו את פתרון MTT מהצלחות, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של 100% DMSO לכל באר. מניחים את הצלחות על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 400 סל"ד.

לאחר מכן, להעביר את הצלחת לקורא צלחת. קרא את הספיגה של כל באר באורך הגל המוגדר מראש של 595 ננומטר, וייצא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח, בדיוק כמו עבור נתוני ספירת התאים. בדיקה של תמונות פלואורסצנטיות tdTomato גילה שתי בארות צורם רעילות בין MTT וספירת תאים בדיקה.

עבור באר אחת, נתוני ספירת תאים לא הראו רעילות. אבל נתוני MTT עשו. באר אחרת העריכה יתר על המידה את ספירת התאים על ידי MTT ביחס לספירת tdTomato, ונראה שיש לה תאים גדולים יותר, ואילו בארות שבהן MTT לא העריך כראוי את ספירת התאים ביחס ל- tdTomato, התאים נראו קטנים יותר.

לסיכום, tdTomato assay מסווג 11 תרכובות רעיל, 11 כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 34 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. בדיקת MTT מסווג 13 תרכובות רעיל, שניים כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 41 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. הגרף של תאים קיימא עבור WP1066 המתחם מראה עקומה שטוחה יחסית ללא רעילות עבור ארבעת הריכוזים הנמוכים ביותר.

העקומה נופלת במהירות במינון של חמישה מיקרומולרים, ויורדת לרעילות כמעט מלאה ב-10 מיקרומולרים, מה שמוביל למינון הקטלני 50 כ-4.4 ו-6.0 מיקרומולר לצורך בדיקת TdTomato וההתמדה של MTT. זה קריטי כי תרכובות מדוללים כראוי במסך התגובה מינון, כך עקומת התגובה המינון הנכון נוצר. תרכובות שזוהו על ידי הליך זה כדי להשפיע על צמיחת תאים יכול להיות מאופיין עוד יותר על ידי בדיקות תפקודיות כדי לזהות מסלולי איתות פוטנציאליים חדשניים לשלוט צמיחת תאים.

תרכובות רעילות לתאי גזע עצביים נבדקו כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים לסרטן המוח, כגון גליובלסטומה ונוירובלסטומה. תמיד ללבוש כפפות ומעיל מעבדה בעת טיפול בתאי יונקים, DMSO, ו MTT. השלך DMSO ו- MTT בהתאם להנחיות הפסולת הכימית של המוסד שלך.