Name: אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 s
Description: למד שיטה מהירה ויעילה לסינון תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ורעילות בתאי יונקים. השיטה משתמשת בשני מבחנים בו-זמנית לזיהוי מדויק של תרכובות ציטוטוקסיות ותופעות ייחודיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר של NINDS.

1. תרבות המועצה לבטחון לאומי
הערה: מניפולציה של קו המועצה לבטחון לאומי מתוארת להלן, אך ניתן להשתמש בכל קו תא לפרוטוקול זה. כל העבודות בתרבית תאים מתבצעות בארון בטיחות ביולוגי.
<ol><li>מעיל a 96-צלחת עם מטריצות קרום מרתף/מטריתאי (ECM).<ol>
<li>הפשרה של ECM (טבלת חומרים), שתקל על ההחזקה של המועצה לבטחון לאומי, על הקרח. לדלל ECM לריכוז המתאים (בדרך כלל 1:100) ב 10 mL בינונית בסיס (הטבלה של חומרים) ולהוסיף 50 μl לכל טוב לכל אחד 60 הבארות הפנימיות של צלחת 96-באר (איור 1). השתמש רק הפנים 60 בארות כדי למנוע חפצים שעלולים לנבוע אפקט הקצה16.</li>
		<li>תנו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר או בחממה לתרבות התא (37 ° c, 5% CO2) לפחות 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. תאי גזע עצביים הערה: תאים לשימוש בשיטה זו יש לגדל לפחות 80% זרימה בבקבוקון T75.<ol>
<li>תאי תרבות בבקבוקון T75 בחממה לתרבות התא ב-37 ° c ו-5% CO2 במדיום המועצה לבטחון לאומי המורכב בסיס בסיסי, B27, חומצות אמינו לא חיוניות, גלוטמין 2 מ"מ, ו-10 Ng/mL בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם (FGFb או FGF2).</li>
		<li>להסיר תאים מן החממה ברגע שהם מגיעים 80% המפגש ומוריד את מדיום המועצה לבטחון לאומי. הוסף כמות מתאימה של מגיב הדיסוציאציה של התא (3 מ ל עבור בקבוקון T75; רשימת חומרים) ו הדגירה עבור 5 דקות בחממה.</li>
		<li>לאחר הדגירה, להוסיף 7 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי ב T75 תרמוס ו פיפטה במרץ כדי להבטיח את כל התאים להיות מנותקים. העבר את פתרון התא המנתק ל-15 מ ל שפופרת ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט מהצינור והשהה את התאים מחדש ב-10 מ ל של בינונית ולאחר מכן מונה תאים.</li>
		<li>לקרוא ריכוז של תאים כדי 200,000 תאים/mL עם מדיום המועצה לבטחון לאומי. ודא שהתאים מושעים מחדש באופן מלא לציפוי אחיד לבארות.</li>
		<li>צלחת 100 μL של תערובת התא (20,000 תאים) ב 60 בארות הפנים של 3 96-טוב צלחות כי כבר מצופה כמתואר בסעיף 1.1. השתמש בשישה מתוך שמונת החריצים של משבצות רב-ערוצי בעלת 8 ערוצים לתאי לוח בטור בעמודה.</li>
		<li>הוסף 100 μL של בסיס בינוני או מדיום לבטחון לאומי לכל הבארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מבארות החיצוני.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ של תרבות התא, לבדוק באופן חזותי לפחות 10 בארות על כל אחד 3 96-היטב צלחות כדי לוודא כי התאים הם שנזרע על הצפיפות הצפויה. אל תמשיכו עם המבדק אם התאים מצופים בצפיפות דלילה מדי או צפופה מדי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. טיפול בתאים עם תרכובות
הערה: הספרייה תוצרת בית נבדק בהפגנה זו מכילה תרכובות לווסת את wingless/משולב (Wnt), חומצה retinoic, שינוי גורם הצמיחה-בטא (TGF-β), ו קיפוד קולי מסלולים איתות כמו גם מגוון של טירולי.
<ol><li>
מסך ראשי גישוש עבור רעילות/מספר תאים
	<ol>
<li>מספר 50 ל-100 מ ל של עד 57 תרכובות מבחן (שולחן משלים 1) בריכוז של 10 מ"מ ב 100% diמתיל סולפוקסיד (dmso) לתוך הפנים 60 בארות של U-התחתית, V-תחתית או עגול-התחתית 96-באר צלחת עם שלושה dmso בארות כפקד (לראות איור 1 עבור מפת צלחת). זה ישמש את הצלחת המתחם הראשי עם 25 μL של תרכובת זה יכול להיות קפוא להפשיר מספר פעמים. הערה: לוחות בעלי תחתית שטוחה לא צריך לשמש כפי שיהיה קשה יותר לחלק כמויות קטנות של תרכובות מתוכם עם פיאור ספסל העליון.</li>
		<li>הסר את לוחיות התרבות של התאים מחממה 16-24 h לאחר פיצול כמתואר בסעיף 1 ולאחר שהוא מוריד את המועצה ההמועצה לבטחון לאומי על-ידי עמודה עם שמונה ערוצים רב-ממדי, תוך שימוש בשישה מתוך שמונה משבצות מרובות היטב. הוסף 95 μL של מדיום טרי לבטחון לאומי לתאים בכל אחד משלושת הצלחות לשכפל לוחות למקם בחזרה בחממה עד שלב 2.1.4 למטה הוא הושלם.</li>
		<li>הוסף 49 μL של המדיום המועצה לבטחון לאומי לכל אחד הפנים 60 בארות של התחתית הריקה U, V-בתחתית או התחתית העגולה 96-באר עם שמונה ערוצים multi-היטב פיפטורים. בטל את החותם של צלחת המתחם הראשי ולהשתמש בצינורות העליון הספסל או מכשיר שווה ערך לפיילט 1 μL של תרכובת מלוחית הבסיס לתוך 49 μL של המועצה לבטחון לאומי בכל אחד הפנים 60 בארות.</li>
		<li>מערבבים את מתחם 3x מדולל עם הספסל העליון מושב צינורות.</li>
		<li>הסר את 3 96-צלחות הבאר של NSCs מן החממה, פיפטה 15 μL של כל מתחם מדולל עם פיאור הספסל העליון ולוותר 5 μL ליטר של תרכובת לתוך כל אחד משלושת הצלחות. הערה: זה 1:20 דילול של תרכובת לתוך התאים בשילוב עם הראשונית 1:50 דילול בשלב 2.1.3 תשואות 1:1000 לדילול כזה את הריכוז הסופי של תרכובות על NSCs יהיה 10 μM עם ריכוז DMSO של 0.1% ואת הסופי ריכוז עבור שולטת DMSO יהיה 0.1%.</li>
		<li>התאים דגירה עם תרכובת עבור 72 h ולהמשיך עם הרעלת ציטוזה. מרווחי זמן קצרים יותר ניתן להשתמש אבל תקופת הדגירה של 72 שעות צריך למקסם את ההשפעות הפוטנציאליות ציטוטוקסיים של תרכובות נבדק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
שיטת התגובה של המינון הערה: ההגדרה עבור 96-השימוש הטוב במינון-תגובה מוצגת באיור 2.
	<ol>
<li>השתמש בעמודה 2 עבור שישה משכפל בקרת DMSO ולבדוק טריליטים של עד שלושה תרכובות שונות בשתי מנות טוריות מתקפלות בשישה מינונים החל במינון גבוה של 10 μM.</li>
		<li>לדלל 4 μL של DMSO או מתחם בדיקה ב DMSO לתוך 196 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 25 μL של DMSO לעמודה של בארות מ-B2-G2 ו-50 μL של תרכובות הבדיקה לשורה מ B3-B11 עם שלושת התרכובות נבדק 10 מ"מ מטריפליטים בשורות B3-B5, B6-B8, ו B9-B11.</li>
		<li>פיפטה 25 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי לעמודות הריקות שנותרו בחלק הפנימי של צלחת 96-ובכן. הסרת 25 μL של תרכובת מבארות B3-B11 עם פיפטורים רב-ערוצית, להוסיף בארות C3-C11, ולערבב לפחות חמש פעמים. חזור על התהליך עבור השורות הנותרות כדי ליצור מטריליטים בשתי מנות מתקפלות עבור סכום כולל של שישה מינונים עבור כל אחד מהתרכובות.</li>
		<li>צור NSCs עבור תגובת המינון בדיוק כפי שמתואר עבור המסך הראשי בסעיף 2.1. תרכובות עבור תגובת המינון מתווספים ו מודבטים על התאים בדיוק כפי שמתואר בשלבים 2.1.5 ו 2.1.6. הערה: שלושה משכפל ביולוגי של שיטת המענה המינון מתבצעים על-ידי חזרה על הNSCs במעברים שונים בימים נפרדים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה של תאים בקורא לוחית
<ol><li>לאחר התאים כבר מודבטים עם תרכובות עבור הזמן המוקצב, התמונה בתאי על הקורא צלחת לקבוע את מספר התא טרום הטיפול לכל טוב. הערה: הוראות לתאי דימות הן ספציפיות לקורא, אך בדרך כלל מעקב אחר אסטרטגיה דומה. ההנחיות שלהלן חלות על הקורא המשמש בהפגנה זו (טבלת חומרים).</li>
	<li>להסיר את הצלחת מן החממה ולמקם אותו בתוך קורא לוחית. פתח את תוכנת צמידה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים עבור המחקר. עבור למצב ידני Imager על מנהל המשימות ולחץ על לכידת כעת....</li>
	<li>בחר 96-צלחת הבאר כסוג כלי, בחר 10x עבור ההגדלה, ו חלבון פלורסנט אדום (RFP) 531 ו 593 עבור הדמיה tdTomato. בחר באר, ולאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, ו לחשוף אוטומטית לזמן חשיפה נאותה. התאם ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.</li>
	<li>לאחר ההתמקדות הנכונה וחשיפה הושגו, לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על תהליך/לאנלאזי מעל התמונה כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול ובחר בכרטיסיה ניתוח.</li>
	<li>לחץ על ניתוח סלולארי בשלב הוספת ניתוח לימין התמונה ולחץ על START (התחל). התמונה תציג תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. ניתן ללחוץ על בחירת האפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור בתאים טובים יותר בהתבסס על סף הזריחה או על גודל התא. אם הצמידה סופר כראוי את התאים, ולאחר מכן לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך.</li>
	<li>לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות, אשר יפתח חלון עם הניסוי. לאחר פתיחה, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול ובחלון החדש שנפתח בחר קרא, ואז בחלון החדש לחץ על הצלחת המלאה כדי לבחור רק את 60 בארות המכילות את התאים (B2... G11). לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים ולאחר מכן לחץ על אישור בחלון השגרה.</li>
	<li>הצלחת יכול כעת להיות בתמונה על ידי פרוטוקול זה ואת הקובץ ניסיוני ניתן לשמור. לחץ על סמל המחזה כדי להפעיל את הצלחת. לאחר שלוחית הרישוי הראשונה הייתה מהתמונה, התמונה של שני הצלחות האחרות. עם סיום ההדמיה, הורד את הנתונים של ספירת התאים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. לקחת את כל התמונות בהגדלה 10x.</li>
</ol>4. שיטת הרעילות מטרמינל MTT
הערה: הפעל את שיטת MTT בתוך שעתיים של השלמת הדמיה tdTomato.
<ol><li>לעשות 5 מניות mg/mL MTT פתרון על ידי שקילה החוצה 25 מ"ג של MTT ולהשעות אותו ב 5 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי. וורטקס הפתרון עד שלא יהיו מאיצים גלויים של MTT, אשר יכול להימשך מספר דקות.</li>
	<li>הסר את לוחיות התרבות של התאים מהאינקובטור ושרטט את מדיום תרבות התא. לדלל MTT 1:10 בינונית תרבות התא ולהוסיף 100 μL של MTT כל טוב של תאים.</li>
	<li>התאים הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 2 h. מזרז ארגמני צריך להיות גלוי בערך בפרופורציה למספר התאים בבאר. או מוריד את פתרון MTT את הצלחות או להפוך את הצלחת במהירות כדי לחבוט פתרון מתוך הצלחת.</li>
	<li>הוסף 50 μL של 100% DMSO לכל היטב ולנענע צלחות בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות ב 400 rpm. קראו את ספיגת הבאר ב595 nm בקורא צלחות והיצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>בצע ניתוח של ספירות תאים של tdTomato וספיגת התוכנה עם התוכנות המתאימות (גיליון אלקטרוני מסחרי, R). חישוב ממוצעים לספיגה או ספירת תאים של שלושה משכפל DMSO על כל צלחת לצורך נורמליזציה, לאחר מכן לחלק את הערך עבור ספירת תאים או ספיגה של כל הבאר על הצלחת על ידי ממוצע זה ולהמיר לאחוזים. הדבר מניב את ספירת התאים המנורמלת או הספיגה ביחס ל-DMSO עבור כל צלחת.</li>
	<li>חשב את הספירה המנורמלת או הספיגה וסטיית התקן עבור שכפול בארות על שלושת הלוחות. הערה: בשלב זה אמורות להיות ארבע סדרות שונות של ערכים מנורמל: אחד עבור כל אחד מהלוחות וממוצע אחד עבור שלושת לוחיות השכפול.</li>
	<li>להיות שמרני ולהשתמש בערך מנורמל בתוך או מתחת 25% עבור הממוצע על פני שלושה לוחות לשכפל לסווג תרכובת כמו רעילים. גם, כי רק טיפול יחיד לכל מתחם מבוצע על כל צלחת, רק התווית תרכובות ליפול מתחת לסף זה על כל שלושת לוחיות לשכפל כמו רעיל. לבחון תמונות פלורסנט של כל התרכובות כי ניתוח זה מסננים רעילים כדי לאשר חזותית רעילות. הערה: הזיהוי של תרכובות עם אפקט של המשך צמיחה או שיפור הצמיחה קשה יותר להעריך את הערך הניסויי של סוג זה עקב חוסר שכפול על כל צלחת. עם זאת, להלן דרך מהירה לזהות תרכובות שעשויות להאט או לשפר את הצמיחה התאית.</li>
	<li>חשב את סטיית התקן עבור שלושת שכפול הפקדים DMSO על כל צלחת ולאחר מכן לסנן עבור כל התרכובות בעלי ערכים ממוצעים לפחות שתי סטיות סטנדרטיות מעל או מתחת לפקד DMSO. תרכובות שנופלות ממסנן זה על כל אחד משלושת הלוחות רשאים לבצע חקירה נוספת.</li>
	<li>השתמש באותה אסטרטגיית ניתוח למענה המינון כמסך הרעילות העיקרי. חשב את הממוצעים עבור בקרת DMSO עבור כל שכפול ביולוגי והשתמש בערכים אלה כדי לנרמל את אחוז התאים החיים או אחוזי הספיגה של אחוזים עבור כל שילוב של תרכובת/מינון. חשב את האמצעים ואת השגיאה הסטנדרטית של האמצעים עבור כל שילובי התרכובת/מינון עבור שלושת המשכפלת הביולוגית.</li>
	<li>הפוך את הריכוז לערך יומן הרישום שלו, צור עקומת מינון עבור יומן הריכוז לעומת יכולת הקיום המנורמלת, והתאם את העקומה באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארי (ניתן לבצע ניתוח ב-R או במספר סטטיסטי מסחרי חבילות). לחשב את המינון הקטלני 50 (או מבחינה טכנית במקרה זה מינון קיימא 50) או ריכוז של תרכובת שתוצאתה 50% רעילות מהמשוואה של עקום זה. חבילות תוכנה רבות יחושבו באופן אוטומטי איור זה.</li>
</ol>

<ol><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academies Press. Washington DC. (2007).</li>
<li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity%3A+to+Test%2C+to+predict%2C+and+how+to+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes%3A+interference+with+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+activator-like+effector+nuclease+%28TALEN%29-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+%28iPSC%29+and+neural+stem+cell+%28NSC%29+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li>
<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).</li>
<li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay%3A+assessment+of+chemosensitivity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li>
<li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro%3A+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li>
<li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li>
<li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins%3A+photography%2C+and+scanning+for+high-throughput+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

המטרה העיקרית של מאמר זה הייתה לתאר אסטרטגיה שיכולה ביעילות ובזול לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים בהקרנה נמוכה עד בינונית תפוקה. שתי טכניקות אורתוגונאליות נוצלו להערכת מספר התאים כדי להגביר את האמון במסקנות ולהציע תובנות נוספות שלא יהיו זמינות אם נעשה שימוש באחד בלבד. אחד הבחני אומר השתמשו תא פלורסנט צמידה כדי לספור ישירות tdtomato-חיוביים תאים השני היה תלוי היכולת המאופיינת היטב של המיטוסים כדי לדבוק mtt כדי formazans ובכך משמש proxy עבור תא מספר10. סך של 57 תרכובות מבחן העריכו בהפגנה זו למר...

אחד המאפיינים החשובים ביותר שצריך להיקבע עבור תרכובת כימית כי יש פוטנציאל טיפולי הוא רעילות שלה לתאי בעלי חיים. מאפיין זה יקבע אם הסם הוא מועמד טוב למחקר מקיף יותר. ברוב המקרים, תרכובות עם רעילות מינימלית מבוקשים אך ישנם מצבים בהם מתחם בעל יכולת להרוג סוגי תאים ספציפיים הוא עניין, למשל, תרופות אנטי-מוריגניות. למרות בעלי חיים שלמים הם מערכות מודל הטובה ביותר כדי לקבוע רעילות מערכתית, העלות והעבודה מעורבים הוא מונע כאשר כמה תרכובות צריך להיבדק. כגון תרבות תא של היונקים משמש בדרך כלל כחלופה היעילה ביותר1,2. מסכי הסמים קטנים עד בינוניים הם מודאליות חשוב שדרכו רעילות ניתן להעריך בתרבות התא. מסכי אלה ניתן להשתמש כדי לחקור ספריות מסומן מיקוד מסלולים בודדים איתות. הפורמט הכללי של מסך כזה הוא בתחילה לבדוק את כל התרכובות בספרייה במינון אחד (בדרך כלל 10 μM) במסך רעילות העיקרי גישוש, ולאחר מכן לבצע מינון מעמיק התגובה במינון המסך כדי לאפיין במלואו את רעילות פרופיל של כניסות מהמסך הראשי. השיטות ליישום אסטרטגיה זו יתואר כאן ויספקו דרך מהירה, יעילה וזולה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות.
פותחו מספר שיטות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות קטנות וננו בתאי מיונקים3,4. יש לציין כי חומרים מסוימים יכולים לקיים אינטראקציה עם הספקות המספקים תוצאות מטעות, ואינטראקציות כאלה יש לבדוק כאשר מדובר במאפיינים של מסכי רעילות4. רעילות ציטודיטוקסין כוללת טריפן כחול5, לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התשובה6, alamar שיטת כחול7, מתיל אסתר (AM)8, ואת שיטת ATP9. כל אלה בחני למדוד היבטים שונים של מטבוליזם התא אשר יכול לשמש proxy עבור מספר התא. בעוד שכולם מציעים יתרונות, aszo, מלח מבוסס על מלחים כגון 3-(4, 5-diמתילthizol-2-yl)-2, 5-דיפנפניזויום ברומיד (MTT), 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfopheny)-2H-טטרזויום-5-carboxyande מלח פנימי (XTT)-1, ו-4-(3-[4- שפתי-על-2-[4-ניטרוגליצרין)-2H-5-טטרזוליו-1, 3-בנזין דיסולולאט (WST-1)10, 11 לספק דיוק טוב וקלות השימוש בעלות נמוכה. MTT, אשר ישמשו בהפגנה זו, הוא הופחת לתוך בלתי מסיסים על ידי מיטוכונדריאלי ושיעור ההמרה הזאת באופן מאוד מתאים למספר התא. מקרה זה נוצל באופן שגרתי הן בקנה מידה קטן והן לסינון ספריות עם עד 2,000 תרכובות12. ספירה ישירה של תאים על-ידי סמן המסומן בתווית מציעה שיטה נוספת להערכת המספר הסלולרי, ובשונה מהזמינותו של MTT היא יכולה לספק מידע נוסף על הדינמיקה של צמיחת הסלולר. מספר אלגוריתמים זמינים לציבור זמינים לביצוע ניתוחים אוטומטיים של ספירת תאים וקיימים גם אלגוריתמים קנייניים המהווים חלק מחבילות תוכנה לקוראי תמונות13,14. בתיאור שיטה זה, קו גזע הגוף האנושי (למועצה לבטחון לאומי) שנערך באופן גנטי כדי להשוות את תוצאות הכדאיות התאית בין שיטת mtt וספירת תאים אוטומטיים הערכה במסך הערכת רעילות של 57 תרכובות מבחן. למרות שהמטרה העיקרית של האסטרטגיה הזאת הייתה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות, יש לה יתרון נוסף של הפוטנציאל לזיהוי מעכבות צמיחה ושיפור תרכובות הצמיחה וכך מספקת שיטה יעילה לזיהוי סמים שיכולים לווסת את הצמיחה התאית.

<table><tbody><tr><td>B-27 (50X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>רכיב בינוני של תאי גזע עצביים.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>פיפטור BenchTop</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>73990</td><td>מספק יכולת להחדיר ספריית תרכובות לתוך צלחת של 96 בארות במכה אחת.</td></tr><tr><td>BioLite 96 באר רב-תכליתית</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td>כל צלחת תרבית תאים 96 באר תעבוד.&nbsp; אנו משתמשים בהם בעבודתנו.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרבית תאים</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>בדיקה ויזואלית של תאים כדי להבטיח צפיפות נאותה.</td></tr><tr><td>ציטציה 5 / קורא הדמיה</td><td>BioTek</td><td>CYT3MFV</td><td>משמש להדמיית תאים וקריאות ספיגה.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>610420010</td><td>ממס לתרכובות המשמשות במסך. ממיס משקעי MTT כדי להקל על מדידות הספיגה.</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>רכיב בינוני של תאי גזע עצביים.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>GelTrex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>מטריצת ממברנת בסיס של תאי גזע עצביים.&nbsp; מאפשר לתאים להיצמד ללוחות תרבית תאים.</td></tr><tr>תוכנת ניתוח <td>BioTek</td><td></td> <td>Gen5 3.04</td><td>לקביעת ספירת תאים עבור תאים המבטאים tdTomato.</td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>רכיב בינוני של תאי גזע עצביים.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microtest U-Bottom</td><td>Becton Dickinson</td><td>3077</td><td>אחסון ספריות מורכבות.</td></tr><tr><td>MTT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M6494</td><td>מגיב בדיקה פעיל לקביעת כדאיות תאית.</td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית</td><td>Rainin</td><td>E8-1200</td><td>תוספת עמודה אחר עמודה של מדיום תרבית תאים, MTT או DMSO.</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>מדיום בסיס תאי גזע עצביים.</td></tr><tr><td>קוביית מסנן RFP</td><td>BioTek</td><td>1225103</td><td>מסנן ב-Cytation 5 המשמש להדמיית תאים מבטאים tdTomato.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605036</td><td>מגיב דיסוציאציה של תאים.</td></tr></tbody></table>

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

רעילות ציטוזה הוא פרמטר קריטי שצריך לכמת כאשר לימוד תרופות שעשויות להיות בעלי הטבות טיפוליות. בגלל זה, הרבה סמים הקרנת התרופה לנצל את הרעילות בתור אחד המאפיינים הקריטיים להיות פרופיל עבור תרכובות בודדות. תאים בתרבות הם מודל שימושי כדי להעריך את הרעילות לפני שתמשיך לעקוב אחר תרכובות עופרת מבטיח יקר יותר, עבודה אינטנסיבית בעלי חיים מודלים. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ב tdTomato ביטוי בתאי גזע האדם העצבי (המועצה לבטחון לאומי) קו. האסטרטגיה משתמשת בשני משלים משלימים להערכת מספר התא. שיטת עבודה אחת פועלת באמצעות הפחתה של 3-(4, 5-diמתילתיול-2-yl)-2, 5-diפנילטיזויום ברומיד (MTT) כדי formazan כמו פרוקסי עבור מספר התא והשני במישרין סופרת את tdTomato המבטאת NSCs. שתי הדרישות יכולות להתבצע בו זמנית בניסוי אחד ואינן העבודה האינטנסיבית, המהירה והזולה. האסטרטגיה המתוארת בהפגנה זו נבדקה 57 תרכובות במסך ראשי מנוסה לרעילות בפורמט 96-באר הצלחת. שלוש מהתצפיות הוגדרו עוד יותר בתגובה למינון של שש נקודות, תוך שימוש באותה מערכת הערכה כמסך הראשי. בנוסף למתן אימות מעולה עבור רעילות, השוואה של תוצאות שתי בחני עשוי להיות יעיל בזיהוי תרכובות המשפיעות על היבטים אחרים של צמיחת תאים.

הנתונים האוטומטיים ספירת תאים זיהה אחד-עשר תרכובות עם פחות מ -25% כדאיות כאשר מנורמל לפקד DMSO בעוד נתוני MTT זיהה אותם תרכובות ועוד שני אחרים (טבלה 1 ושולחן 2, מוצל אדום). שני תרכובות נמצאו רעילים רק בתוך שיטת MTT (בארות F3 ו G10) היו 31% ו 39%, בהתאמה, מספר תאים tdTomato-חיוביים כפקד ועל ידי סדר הדירוג היו שני תרכובות רעילות ביותר הבאה בספריה זו לאחר אלה שנחשבו רעילים. ערכי סטיית התקן עבור שתי הבארות האלה לא הציעו שתהיה הבחנה בין שלושת הצלחות שמסטנות את הממוצע, וכאשר בודקים את המספרים ...

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מהירה ויעילה להשתמש בו זמנית שני assays כדי לסנן כמה מאות תרכובות עבור ההשפעות שלהם על צמיחת התאים. ה- assays יכול לספק לנו מידע על אם תרכובות ספציפיות הן cytotoxic, לעכב את צמיחת התאים, או לשפר את צמיחת התא. על ידי ניצול שתי התרכובות יחד, אנו מסוגלים להגביר את הדיוק ולזהות תרכובות ציטוטוקסיות.במקרים שבהם התוצאות של שתי הבדיקות מתפצלות, אסטרטגיה זו עשויה לאפשר לנו לזהות תרכובת עם השפעות ייחודיות על התפקוד התאי שניתן לבחון עוד באמצעים אחרים. היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו הוא שהיא מהירה, זולה ואינטנסיבית שאינה עבודה. לאחר השליטה, זה מאפשר לחוקרים לבצע בקלות מסך ראשי של עד 200 תרכובות בשבוע אחד, ולאחר מכן לבצע עקומת תגובה מינון ממצה על 10 עד 15 תרכובות בשבוע אחר.הדגמת ההליך תהיה אני ורוהיני מניקאם, מדען צוות ועמית פוסט-תואר ראשון מהמעבדה. ראשית, בארון בטיחות ביולוגי, תאי תרבות בבקבוק T75 עם מדיום המל"ל, כך שהם יהיו לפחות 80% confluent בעת תחילת המבחן. ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו-חמצני.ברגע שהתאים מגיעים ל-80%, מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ושואבים את מדיום המל"ל. מוסיפים שלושה מיליליטר של ניתוב תאים ודגירה במשך חמש דקות באינקובטור. לאחר הדגירה, מוסיפים שבעה מיליליטר של מדיום המל"ל בבקבוקון, ואת פיפטה במרץ כדי להבטיח שכל התאים יתנתקו.מעבירים את פתרון התא המנותק לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי מהצינור והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום המל"ל. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemocytometer לספור את התאים, ולהוסיף מדיום NSC לתוך הצינור כדי להסתגל מחדש את ריכוז התאים ל 200, 000 תאים למיליליטר.לאחר מכן, באמצעות שישה מתוך שמונת החריצים של pipettor רב ערוצי שמונה ערוצים כדי צלחת 100 microliters של עמוד תערובת התא בעמודה ב 60 בארות פנימיות של שלוש 96 צלחות היטב כי כבר מצופה מטריצה חוץ תאית. הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום בסיס או בינוני NSC לכל בארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מן בארות החיצוניות המכילות תאים. תחת מיקרוסקופ של תאים, בדקו ויזואלית לפחות 10 בארות בכל אחת משלוש 96 צלחות הבאר כדי לאשר שהתאים יושבים בצפיפות הצפויה.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. הסר את לוחות תרבות התאים מהחרם 16 עד 24 שעות לאחר הפיצול, ושואב את העמודה הבינונית של המל"ל בעמודה אחר עמודה עם צינור רב-תכליתי בן שמונה ערוצים, תוך שימוש רק בשישה מתוך שמונת החריצים מרובי הבאר. הוסיפו 95 מיקרוליטרים של מדיום NSC טרי לכל באר של שלוש הצלחות המשוכפלות, והחזרו את הצלחות לאנקובטור.עם pipettor רב היטב שמונה ערוצים, להוסיף 49 microliters של מדיום NSC לתוך כל אחד 60 בארות הפנים של U-bottomed ריק, V-bottomed, או עגול תחתית 96 צלחת היטב. בטלו את הריסת צלחת התרכובת הראשית המוכנה. פיפטה מיקרוליטר אחד של המתחם מצלחת האב לכל אחת מ-60 בארות הפנים המכילות את מדיום המל"ל, ומערבבים את המתחם המדולל שלוש פעמים עם צינור עליון ספסל.לאחר מכן, להסיר את שלוש 96 צלחות באר של NSCs מהאינקובטור ולחלק חמישה microliters של המתחם מדולל לתוך כל באר של שלוש צלחות המכילות תאים להניב דילול אחד עד 1000 עבור הריכוז המורכב הסופי של 10 micromolar עם ריכוז DMSO של 0.1% אינקובט תאים עם תרכובת במשך 72 שעות, ולהמשיך עם assays cytotoxicity. כדי לבצע בדיקת תגובה מינון, להגדיר 96 גם. השתמש בעמודה 2 עבור שישה שכפולים בקרת DMSO, ולבדוק משולשים של עד שלוש תרכובות שונות בדילול סדרתי כפול, בשש מנות, החל במינון גבוה של 10 micromolar.לדלל ארבעה microliters של 100% DMSO או תרכובת בדיקה ב DMSO לתוך 196 microliters של מדיום NSC בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 או 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטרים של DMSO מדולל לשליטה בארות, ו 50 microliters של תרכובות הבדיקה מדולל הבאר המתאימה שלהם. פיפטה 25 מיקרוליטרים של מדיום המל"ל ל שאר בארות ריקות בחלק הפנימי של צלחת 96 באר.בעזרת צינור רב-ערוצי, מעבירים 25 מיקרוליטרים של התרכובת מ-10 בארות המיקרומולרים לחמש בארות המיקרומולריות, ומערבבים לפחות חמש פעמים. החלף את טיפים פיפטה, ולחזור על התהליך על ידי ערבוב השורות הנותרות כדי ליצור משולשים בדילול כפול עבור סך של שש מנות עבור כל אחת מהתרכובות. מעבירים חמישה מיקרוליטרים של כל דילול לצלחת חדשה עם תאי תרבות שנבדקים.מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. לאחר התאים כבר דגירה במשך 72 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה למקם אותו בתוך קורא הלוח. פתח את תוכנת התמונה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים למחקר.עבור אל מצב ידני של Imager במנהל המשימות ולחץ על לכוד כעת. בחר 96 גם צלחת כמו סוג הכלי. בחרו 10 פעמים להגדלה, וחלבון פלואורסצנטי אדום 531 ו-593 להדמיית tdTomato.לחץ על באר. לאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, וחשוף אוטומטית לזמן חשיפה מתאים. התאימו ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על נתח תהליך לעיל כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול. ובחר בכרטיסיה ניתוח.מימין לתמונה, לחצו על 'ניתוח תאי' ב'הוסף שלב ניתוח' ולחצו על 'התחל'. התמונה מציגה תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. לחץ על הבחירה אפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור טוב יותר תאים בהתבסס על סף הפלואורסצנטיות או גודל התא.אם התמונה סופרת כראוי את התאים, לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך. לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות. ובחלון הפתוח, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול.לאחר מכן, בחלון החדש שנפתח, בחר קרא. לחץ על לוח מלא כדי לבחור רק את 60 הבאר המכילות את התאים. לחץ על אישור כדי לשמור שינויים.לאחר מכן לחץ על אישור בחלון פרוצדורה. לחץ על סמל הפעל כדי להפעיל את הלוח. בבקשה, שמרו את הקובץ ולאחר מכן, בבקשה 'טען לוח', לחצו על הלחצן 'אשר'. עם השלמת ההדמיה, הורד את נתוני ספירת התאים מתוכנית הדמיה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.בתוך שעתיים מהשלמת הדמיית tdTomato, להתחיל את ההקדמה MTT. לשקול 25 מיליגרם של MTT ולהשעות אותו מחדש בחמישה מיליליטר של מדיום NSC כדי להפוך חמישה מיליגרם לכל פתרון מלאי MTT מיליליטר. Vortex הפתרון במשך כמה דקות, עד שאין משקעים גלויים של MTT.הסר צלחות תרבות תאים מהחרם ושואב את מדיום תרבות התא. לדלל MTT אחד עד 10 במדיום NSC טרי, ולהוסיף 100 microliters של MTT מדולל לכל באר של תאים. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.משקעים גרגריים גלויים בערך ביחס למספר התאים באר. שאפו את פתרון MTT מהצלחות, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של 100% DMSO לכל באר. מניחים את הצלחות על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 400 סל"ד.לאחר מכן, להעביר את הצלחת לקורא צלחת. קרא את הספיגה של כל באר באורך הגל המוגדר מראש של 595 ננומטר, וייצא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח, בדיוק כמו עבור נתוני ספירת התאים. בדיקה של תמונות פלואורסצנטיות tdTomato גילה שתי בארות צורם רעילות בין MTT וספירת תאים בדיקה.עבור באר אחת, נתוני ספירת תאים לא הראו רעילות. אבל נתוני MTT עשו. באר אחרת העריכה יתר על המידה את ספירת התאים על ידי MTT ביחס לספירת tdTomato, ונראה שיש לה תאים גדולים יותר, ואילו בארות שבהן MTT לא העריך כראוי את ספירת התאים ביחס ל- tdTomato, התאים נראו קטנים יותר.לסיכום, tdTomato assay מסווג 11 תרכובות רעיל, 11 כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 34 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. בדיקת MTT מסווג 13 תרכובות רעיל, שניים כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 41 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. הגרף של תאים קיימא עבור WP1066 המתחם מראה עקומה שטוחה יחסית ללא רעילות עבור ארבעת הריכוזים הנמוכים ביותר.העקומה נופלת במהירות במינון של חמישה מיקרומולרים, ויורדת לרעילות כמעט מלאה ב-10 מיקרומולרים, מה שמוביל למינון הקטלני 50 כ-4.4 ו-6.0 מיקרומולר לצורך בדיקת TdTomato וההתמדה של MTT. זה קריטי כי תרכובות מדוללים כראוי במסך התגובה מינון, כך עקומת התגובה המינון הנכון נוצר. תרכובות שזוהו על ידי הליך זה כדי להשפיע על צמיחת תאים יכול להיות מאופיין עוד יותר על ידי בדיקות תפקודיות כדי לזהות מסלולי איתות פוטנציאליים חדשניים לשלוט צמיחת תאים.תרכובות רעילות לתאי גזע עצביים נבדקו כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים לסרטן המוח, כגון גליובלסטומה ונוירובלסטומה. תמיד ללבוש כפפות ומעיל מעבדה בעת טיפול בתאי יונקים, DMSO, ו MTT. השלך DMSO ו- MTT בהתאם להנחיות הפסולת הכימית של המוסד שלך.

a-strategy-to-identify-compounds-that-affect-cell-growth-survival

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

כאן, אנו מתעדים את השימוש בבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים פפטידילרגינין דימינאז (PADI), BB-Cl-amidine, על גידול סרטן השד במבחנה.

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

למד שיטה מהירה ויעילה לסינון תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ורעילות בתאי יונקים. השיטה משתמשת בשני מבחנים בו-זמנית לזיהוי מדויק של תרכובות ציטוטוקסיות ותופעות ייחודיות.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

גלה סרטונים נוספים