Name: אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: למדו אלקטרופורזת DNA בטוחה באמצעות Thiazole Orange כחלופה לאתידיום ברומיד. השיטה מאפשרת זיהוי בקרני UV או אור כחול ללא נזק ל-DNA, משפרת הצלחה בניסויים המשך וחוסכת בעלויות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות אתחול כדי TDG מ אוניברסיטת ניופורט כריסטופר.

1. מכינים את הג'ל
הערה: עבור כללי ג'ל אלקטרופורזה פרוטוקולים, ראה גם לי פ, ואח. 14.
<ol><li>לערבב agarose (~ 1% w/v, אחוז יכולים להיות מגוונים להפרדות גודל מסוים) במאגר (כ 70 מ עבור ג'ל מיני (8 x 7 ס מ)). מאגרי הם בדרך כלל טה (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס, אצטט 20 מ מ, 1 מ מ EDTA, pH כ 8.6) או TBE (טריס-בוראט-EDTA, 90 מ מ טריס, בוראט 90 מ מ, 2 מ מ EDTA, pH כ 8.3)).</li>
	<li>להוסיף thiazole כתום ריכוז סופי של 1.3 μg/mL.<ol>
<li>להמיס thiazole תפוזים ב דימתיל סולפוקסיד לעשות 10,000 x מניות פתרון (13 mg/mL). בזמן רגיש לא קלה במיוחד, לאחסן עד מתי כהה אינו בשימוש. פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת החדר במשך ~ חודשים; אחסון לטווח ארוך יכול להיעשות על ידי הקפאת aliquots (דימתיל סולפוקסיד תוקפא מקרר סטנדרטי). ודא שאתה לגמרי להמיס resuspend פתרון קפואה לפני השימוש. הערה: הג'ל יכול גם להיות מוכתם אל לאחר אלקטרופורזה (ראה שלב 2.6). זמן יש פרופיל בטיחות משופרת של אתידיום ברומיד, בטיחות מעבדה ביולוגיה מולקולרית סטנדרט הזהירות צריכים להישמר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>את התערובת של agarose, מאגר agarose thiazole כתום כדי להמיס במיקרוגל (כ 60 s). שלב זה בדרך כלל מתייחסים כאל "נמס". מערבולת (5 s) כדי לסייע התפרקות במידת הצורך. : הערה ניתן להוסיף גם לאחר במיקרוגל אם מועדף.</li>
	<li>לאפשר agarose לתמיסה להתקרר בקצרה לפני לשפוך לתוך מכשיר הליהוק ג'ל המכיל של המסרק המתאים.</li>
	<li>לאפשר את הפתרון agarose לגבש לתוך ג'ל.</li>
</ol>2. טעינת ויפעילו את הג'ל
<ol><li>הכנס המנגנון אלקטרופורזה בג'ל אם לא שכבר קיים.</li>
	<li>להוסיף מאגר הפעלה (טה או TBE כמו לעיל) כדי לכסות את המשטח של הג'ל.</li>
	<li>לטעון דגימות די אן איי (בדרך כלל 10 μL) באמצעות צבע טעינה. כולל סולם הדנ א שנקודות לעיון.</li>
	<li>לצרף את הכיסוי ואלקטרודות (הג'ל אמורה לפעול לכיוון האנודה אדום (חיובי)).</li>
	<li>החל מתח (בדרך כלל ~ 100V עבור ג'ל המצומצמת, למרות בגודל של ג'ל עשויים לדרוש מתח ששונה כדי למנוע פגיעה הג'ל) עד טעינת לצבוע נסעה על המרחק המתאים (כ- 4-7 ס"מ על ג'ל המצומצמת, למרות המרחק עשוי להשתנות בהתאם יישום מדויק). הערה: כמו אתידיום ברומיד רבים צובעת דנ א מחייב אחרים, thiazole כתום טעונה באופן חיובי. כתוצאה מכך, צבעים אלה להעביר בכיוון ההפוך של electrophoresing ה-DNA. לקבלת דוגמאות אשר מופעלים רחוק למטה הג'ל על הפרדה משופרת, בסופו של דבר לצבוע בין שברי DNA קטן יותר, וכתוצאה מכך מכתים חלש. במקרים אלה, הג'ל צריך להיות מוכתם כמו שלב 2.6. מצב זה אינו ייחודי אל, כל טעונה באופן חיובי לצבוע כי הפיכה אינטראקציה עם ה-DNA תערוכת ציורים של התנהגות זו (כולל אתידיום ברומיד, ל, ואחרים).</li>
	<li>אם את לא נוסף לפני ג'ל הליהוק (שלב 1.2), כתם במועט הג'ל במאגר הכולל thiazole התפוזים.<ol>
<li>הכנת מאגר מספיק (טה או TBE) המכיל thiazole μg/mL 1.3 כתום לגמרי לכסות את הג'ל, להשרות את הג'ל עם עצבנות עדין עד הלהקות באופן מלא זוהה (בערך 20 דקות).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה של ג'ל כתום agarose thiazole (UV transilluminator)
<ol><li>להסיר את הג'ל מכשירי אלקטרופורזה של המקום transilluminator UV. התראה: אור UV מזיק על העור והעיניים. יש להקפיד ללבוש המתאים העין (משקפי מגן) והגנה הפנים (מגן הפנים). הידיים צריך כפפות, שרוולים ארוכים לענידה.</li>
	<li>אם רצונך בכך, לגזור את הרצוי DNA להקות של הג'ל (עבור עיכול נוספות או מצדו, לדוגמה). לחשוף הג'ל לאור UV עבור כמו קצר את משך הזמן ככל האפשר במהלך כריתה. אולטרא סגול (ללא קשר לצבוע דנ א) נזקים הדנ א.</li>
	<li>לחלץ את הדנ א מ הפרוסה ג'ל באמצעות זמינים ערכת או פרוטוקול15.</li>
</ol>4. ויזואליזציה של ג'ל כתום agarose thiazole (transilluminator אור כחול או פנס)
<ol><li>להסיר את הג'ל מכשירי אלקטרופורזה והמקום על transilluminator אור כחול (~ 470 ננומטר אורך גל פליטה המרבי). לחלופין, נורית כחולה (~ 470 ננומטר) פנס יכולים להיות מכוונים את הג'ל (גם מעל או מתחת). הערה: בעוד רגישות נמוכה יותר באמצעות transilluminator של אור כחול עם אתידיום ברומיד, DNA מוכתם אתידיום ברומיד יכול להתגלות באמצעות פרוטוקול זה אור כחול.</li>
	<li>השתמש מסנן פליטה ענבר (~ 560 nm longpass, משקפי מגן או ריבוע) כדי לסנן את האור הכחול, המאפשר ויזואליזציה של קרינה פלואורסצנטית ממתחמי דנ א: thiazole כתום. הערה: ללא המסנן פליטה ענבר, קשה מאוד לזהות להקות DNA עקב האינטנסיביות של מקור אור כחול עירור. התראה: למרות אור כחול חסרה את היכולת בחריפות נזק לרקמות (מנוגדים UV), ממושך חשיפה לאור כחול אינטנסיבי עלול לגרום נזק לעיניים, משקפת הענבר פליטה או מסנן אמור לשמש.</li>
	<li>אם רצונך בכך, לגזור להקות DNA הרצוי של הג'ל לאפליקציות נוספות. הערה: מאז אור כחול אינו גורם נזק דנ א, אין צורך לחתוך במהירות להקות (כגון בעת שימוש UV עירור בשלב 3.2).</li>
	<li>לחלץ את הדנ א מ הפרוסה ג'ל באמצעות זמינים ערכת או פרוטוקול15.</li>
</ol>5. לכידת תמונה
<ol><li>בחר הגדרות המתאימים עירור ופליטה מכשיר הדמיה ג'ל. עירור של פליטה של thiazole כתום (λלשעבר, מקסימום = 510 ננומטר (488 ננומטר, 470 nm גם להראות עירור חזק, בנוסף עירור חזק באורכי גל UV); λem = 527 ננומטר) כמעט זהות לפרסומות כחול-אור – לזיהוי נפוצות צבענים, אז כלי נגינה עשויים מראש הגדרות המסנן יכול לשמש. הערה: כמה הגדרות המסנן עבור צבעי כחול-אור – לזיהוי מסחרי למעשה לשימוש אור UV המזיקות עירור, אז היזהר אם הדמיה לפני חיתוך להקות. השתמש מקור אור כחול עירור במידת האפשר כאשר להקות דנ א להוציא לאחר דימות.</li>
	<li>בהעדר מערכת הדמיה עם המסננים המתאימים, מקום של מסנן ענבר בין המצלמה ואת המקור עירור ג'ל/אור כחול.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אתידיום ברומיד כבר זמן רב כלי תקני במעבדה בביולוגיה מולקולרית, למרות ידועה רעילות. זה גם סובל הדורשים אור UV, אשר פוגעת הדנ א כמו זה להיות מזוהה. Thiazole תפוז מציע אלטרנטיבה זולה אתידיום ברומיד, כמו גם צבע מסחרי שימושי אך יקר.
היתרונות של thiazole תפוז הם לפיכך כפולה. ראשית, ניתן להשתמש thiazole כתום פשוט כתחליף אתידיום ברומיד. ג'לים ניתן להכין באופן זהה כדי EtBr, עם עד שהוחלפו כמו הכתם (שלב 1.2). איתור מגבלות דומות (~ 1-2 ng/ליין)1. אין ציוד נוסף נדרש להחליף צבעים כי ...

מטרת שיטה זו היא לזהות את הדנ א של ג'לים agarose באמצעות thiazole כתום (כדי) לגילוי קרינה פלואורסצנטית. עקב פרופיל בטיחות בעלות נמוכה מאהדה שלה, thiazole כתום עשויים לראות תועלת מסוימת הוראה לתואר ראשון מעבדות, מעבדות מחקר, ביצוע בביולוגיה מולקולרית, בעיקר ligations ו שיבוט.
אתידיום ברומיד נשאר הצבע הנפוץ ביותר עבור זיהוי ה-DNA agarose ג'ל. זה בעיקר כי ניתן להשיג בזול מאוד, רק דורש עירור עם אור UV לצורך זיהוי. שניהם אתידיום ברומיד, thiazole כתום זולים, עם זיהוי נמוך מגבלות (1-2 ng/ליין)1. שני חסרונות עיקריים אתידיום ברומיד, עם זאת, המשפר thiazole כתום על.
ראשית, אתידיום ברומיד הוא מוטגן2 עם טיפול מיוחד, משלוח ודרישות סילוק, ואילו thiazole כתום הוא פחות מוטגן (3-4 x פחות כגורמי מוטציה במבחן איימס)3,4 , ניתן באופן כללי להמית עם פסולת כימית נפוצות.
שנית, אתידיום ברומיד דורש אור UV לצורך זיהוי. Thiazole כתום באופן דומה ניתן להשתמש אור UV אם רצונך בכך, אך ניתן לזהות גם עם אור כחול. אור UV, בעוד בשימוש נפוץ, יש כמה חסרונות הבולטות. ראשית, הוא נחשב כמזיק עור ועיניים. בעוד אור UV ניתן להשתמש בבטחה על ידי אנשי מקצוע מיומנים, העור או עין נזק מקרי (בדומה פונקציונלית כוויות שמש) ממעבדה UV אור אינן נדירות במיוחד עם מדענים לא מנוסים. שנית, אור UV מזיק מאוד ל- DNA דגימות5, אשר מפחית את ההצלחה של ניסויים במורד הזרם (כגון מצדו טרנספורמציה)1,6,7. אל מאפשר זיהוי עם אור כחול (λלשעבר, מקסימום = 510 ננומטר (488 ננומטר, 470 nm גם להראות עירור חזק)), אשר אינו גורם נזק לעור או DNA נזק (למרות כל אור אינטנסיבי עשוי עדיין להיות מזיקה לעיניים), להקטין באופן משמעותי את הסיכונים להם שני המדען את הדגימה.
היא לא החלופה רק הפלורסנט אתידיום ברומיד; היתרון שלו הוא העלות. כדי התגלה בשנות ה-80 כמו כתם רטיקולוציט8, מצא השירות במספר של זריחה מבוסס DNA ניסויים9,10,11,12,13. הוא נמכר כעת על-ידי ספקים מרובים. כדי הוא מתחם הורים נוספים, יקר יותר, צבע כחול-אור – לזיהוי מסחרי, מתנהג בדומה במהלך אלקטרופורזה, באמצעות UV או אור כחול עבור זיהוי1. יתר על כן, בעוד צבעים אחרים רגישים נמוך מאוד ריכוזי ה-DNA יותר EtBr או אל, לניסויים אלקטרופורזה כלליים, כגון צבעי הם לחדשו בהקשרים רבים.

<table><tbody><tr><td>סולם DNA 2-log</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (דרגת ניתוח גנטי)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>פנס אור כחול</td><td>WAYLLSHINE (אמזון)</td><td>WAYLLSHINE ניתן להרחבה כחול LED</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>פישר</td><td>BP1302-10</td><td>לשם השוואה, לא הכרחי לפרוטוקול</td></tr><tr><td>מכשיר ג'ל (ינשוף יצוק קל)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick ערכת מיצוי ג'ל Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>משקפי צפייה בטוחים</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>הכרחי לשימוש בפנס אור כחול.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (טרנסמאייטור אור כחול)</td><td>פנס אור כחול Invitrogen</td><td>G6600</td><td>עשוי לשמש כחלופה</td></tr><tr><td>ל-SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>לשם השוואה, לא הכרחי לפרוטוקול</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Thiazole orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*משקפיים כלולים גם ב-Invitrogen G6600</td></tr></tbody></table>

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

דנ א בג'ל באמצעות agarose הוא כלי נפוץ במעבדות בביולוגיה מולקולרית, המאפשר הפרדה בין שברי DNA לפי גודל. לאחר ההפרדה, ה-DNA הוא מדמיין מאת מכתים. מאמר זה מדגים כיצד להשתמש DNA thiazole כתום כתם. Thiazole תפוז משווה לטובה לשיטות מכתימים נפוצות, בכך שהוא רגיש, זול, להתרגש עם UV או אור כחול (כדי למנוע נזק לדוגמה), ובטוחה יותר אתידיום ברומיד. מעבדות מצוידים כבר להפעלת ה-DNA אלקטרופורזה ניסויים באמצעות אתידיום ברומיד יכול לעבור בדרך כלל צבעי ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים, באמצעות אור UV לגילוי. בנוסף ניתן להשיג גילוי אור כחול כדי למנוע נזק מדגם עם מסנן המקור, פליטת אור כחול. מעבדות מצוידים כבר לגילוי אור כחול ניתן לעבור פשוט צבע ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים.

Thiazole תפוז מאפשר זיהוי של ה-DNA, ללא שימוש אתידיום ברומיד, ולא באמצעות אור UV מזיקות-DNA. אתידיום ברומיד ידוע להיות מוטגן, כך ולהוצאתה מהמעבדה עשוי להיות יתרון. אור UV מזיקה דנ א, מוריד את יעילות ההמרה באופן משמעותי, בעוד אור כחול אינו גורם נזק הדנ א. איתור מגבלות דומות בין אתידיום ברומיד, כתום thiazole משותף, כחול-אור – לזיהוי מסחרי DNA צבע (איור 1, ראה טבלה של חומרים), עם מגבלת זיהוי עבור כל צבע שלוש להיות ~ 1-2 ng/ליין ג'ל מיני 1.
<p class="...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

פרוטוקול זה הוא חלופה קלה וזולה לשימוש באתידיום ברומיד לגילוי DNA במהלך אלקטרופורזה. על ידי הסרת אתידיום ברומיד, אור UV או אור כחול יכול לשמש לגילוי. אור כחול אינו מזיק לדנ"א, מה שמגדיל את הסיכוי להצלחה בניסויים במורד הזרם.זה ממש קל לנסות את זה. אתה רק צריך להחליף את האתידיום ברומיד בג'ל שלך עם תפוז תיאזולה. ראשית, הכינו 1%mini-gels על ידי ערבוב של כ-0.7 גרם אגרוז ב-70 מיליליטר של מאגרי טריס-אצטט-אדטה או טריס-בוראט.לאחר מכן, להמיס כתום thiazole ב DMSO כדי להפוך את פתרון 10, 000X מניות. אמנם לא רגיש לאור במיוחד, לאחסן כתום thiazole בחושך כאשר לא בשימוש. לאחסון לטווח ארוך, הכינו אליקוטים מתערובת התיאזול הכתום-DMSO והקפיאו אותם.לאחר מכן, מוסיפים כתום תיאזול לריכוז סופי של 1.3 מיקרוגרם למיליליטר, ומכניסים במיקרוגל את התערובת של חיץ אגרוז ותפוז תיאזולה כדי להמיס אגרוז במשך כ -60 שניות. יוצקים את תערובת אגרוז לתוך מנגנון יציקת ג'ל המכיל מסרק מתאים, ולאפשר את הפתרון agarose להתגבש לתוך ג'ל. כדי לטעון את הג'ל, ראשית למקם את הג'ל במנגנוני אלקטרופורזה, אם לא כבר נוכח.לאחר מכן הוסיפו את מאגר הריצה TAE או TBE לכיסוי פני השטח של הג'ל. לאחר מכן, באמצעות צבע טעינה, לטעון 10 microliters של דגימת DNA. כלול סולם שינוי גודל DNA לעיון.חבר את הכיסוי ואת האלקטרודות, ולהפעיל את מיני ג'ל ב 100 וולט עד צבע הטעינה נע כארבעה עד שבעה סנטימטרים עבור מיני ג'ל. אם תפוז תיאזולה לא הוחל לפני יציקת ג'ל, הכתם את הג'ל על ידי טבילתו במאגר המכיל תפוז תיאזולה עם תסיסה עדינה במשך כ -20 דקות או עד שהרצועות מזוהות במלואן. כדי לדמיין את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור UV, הסר את הג'ל ממנגנוני האלקטרופורזה והצב אותו על טרנסילומינטור UV.כדי לדמיין את הג'ל באמצעות transilluminator אור כחול או פנס, מניחים את הג'ל על transilluminator אור כחול או לכוון את פנס LED כחול על הג'ל מלמעלה או מתחת. השתמש במסנן פליטת ענבר כדי לסנן את האור הכחול, המאפשר הדמיה של פלואורסצנטיות מתסביך כתום תיזול DNA ולהגן על צבעים. לעיכול נוסף או קשירה, לגזור רצועות DNA הרצוי מן הג'ל ולהמשיך לחלץ DNA באמצעות ערכה זמינה או פרוטוקול.בחר את הגדרות העירור וההפלה המתאימות במנגנוני הדמיית הג'ל. בהיעדר מערכת הדמיה עם מסננים מתאימים, מקם מסנן ענבר בין המצלמה למקור העירור של האור הכחול. מגבלות הגילוי דומות בין אתידיום ברומיד, תפוז תיאזול וצבע דנ"א מסחרי נפוץ לגילוי אור כחול, כאשר מגבלת הגילוי של כל שלושת הצבעים היא ננוגרם אחד עד שניים לכל נתיב במיני ג'ל.ג'ל אגרוז מוכתם בכתום של תקציר הגבלה ניתן לגילוי כאשר הוא מתרגש עם UV או טרנסילומינטור אור כחול או עם פנס אור כחול. בעוד כתום thiazole נראה פחות מסוכן מאשר ברומיד אתידיום, ציוד מגן אישי סטנדרטי כגון כפפות ומ המשקפיים עדיין צריך להיות משוחק.

dna-electrophoresis-using-thiazole-orange-instead-ethidium-bromide-or

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית כדי לזהות אינטראקציות חלבון-דנ"א באמצעות בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית אינפרא אדומה. כאשר החלבון נקשר לבדיקת הדנ"א, הוא יוצר קומפלקס גדול הנודד באיטיות ומופיע כרצועה מוסטת על הג'ל.

בדיקת Electrophoretic Mobility Shift לזיהוי קומפלקסים של פקטור שעתוק-DNA

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי קולורימטרי של E. coli באמצעות בדיקת לקמוס שונה המנצלת DNAzyme, אוראז וחרוזים מגנטיים.

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

למדו אלקטרופורזת DNA בטוחה באמצעות Thiazole Orange כחלופה לאתידיום ברומיד. השיטה מאפשרת זיהוי בקרני UV או אור כחול ללא נזק ל-DNA, משפרת הצלחה בניסויים המשך וחוסכת בעלויות.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

גלה סרטונים נוספים