Name: CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למד עריכת גנום מולטיפלקס ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מערך crRNA יחיד ללא שיבוט. שיטה זו מאפשרת יצירת זני שמרים מייצרי קרוטנואידים ואמנות פיקסל ביולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה קיבל מימון של אופק 2020 האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק no. 686070 (DD-נטול) ו 764591 (SynCrop), ומתוך תוכנית המחקר בניית אבני החיים עם מספר הפרויקט 737.016.005 על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO). T.E.G. היה נתמך על ידי החברה המלכותית (גרנט UF160357) ו BrisSynBio, BBSRC/EPSRC מחקר ביולוגיה סינתטי מרכז (הענק BB/L01386X/1). אנו מודים Zi Di וג ואן וייק עבור תרומתם שמרים האיתור ניסויים ליצירת אמנות פיקסל שמרים.

<ol><li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688(2017).</li>
<li>Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li>
<li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
<li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601(2018).</li>
<li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR%2FCas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li>
<li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+versus+Cas12a%2FCpf1%3A+Structure%E2%80%93function+comparisons+and+implications+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481(2018).</li>
<li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li>
<li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li>
<li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li>
<li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li>
<li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647(2008).</li>
<li>Yeast Art project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.yeastart.org">http://www.yeastart.org</a> (2018).</li>
<li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li>
<li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li>
<li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li>
<li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries%2C+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li>
<li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoubos%2C+JA+%22Cloning+Method%22">Cloning Method</a>. , WO2013144257 (2013).</li>
<li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li>
<li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791(1991).</li>
<li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li>
<li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li>
<li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FnCpf1%3A+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li>
<li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li>
<li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+%28SBOL+Visual%29+Version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שקיים ניגוד אינטרסים. המחברים הגישו IP הקשורים שיטות שהוצגו.

הפרוטוקול המסופק מתאר את עריכת הגנום מולטיפלקס של ס. cerevisiae ס באמצעות Cas12a מחיידק הND2006 בשילוב עם מערך crrna יחיד ו-DNA תורם. עיצוב של מערך crRNA יחיד ו-DNA התורם מוסבר בפרוטרוט. בניגוד היטב מערכת crispr/Cas9, crispr/Cas12a יש את היכולת הייחודית הנוספת של עיבוד crrnas מרובים ביטא מערך crrna אחד13,33. הודות לתכונה זו, ניתן לבצע עריכה בו של מספר מטרות מרובות וניתנת להשגה בטרנספורמציה אחת. זו גישה מערך crRNA יחיד הוכח בעבר על ידי זצ'ה ואח'. 34 אשר בו העריכה עד ארבעה גנים בתאי היונקים באמצעות AsCas12a, ועל ידי swiat ואח'. 35 מי הציג ארבעה שברי DNA לתוך הגנום שמרים באמצעות FnCas12a. לידיעתך, מספר גבוה יותר של שינויים גנוביים בו באמצעות מערכת Cas12a לא דווחו ואת המגבלה המקסימלית של מטרות לכל מערך בודד עבור Cas12a עדיין נקבע. מחקר נוסף ניצול מערכים crrna יחיד בשילוב עם Cas12a כולל בקרת מולטיטרסקריפט במגוון רחב של אורגניזמים33,36,37.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המוצג. עיצוב בקפידה את כל רצפי ה-DNA כי הם מעורבים בניסוי Cas12a הגנום עריכת, במיוחד במקרה כאשר רצפי DNA הרומן מוצגים. לקבוע את הפונקציונליות של רצפים הרווח החדש חלק של crRNA, למשל על ידי ניסוי הגנום בלבד לערוך כמתואר על ידי Verwaal ואח'. 19 לפני שילוב אותם לתוך מערך crrna יחיד. בצע את ההמלצות להכנת פתרונות מאגר טרנספורמציה בשימוש בניסוי עריכת Cas12a כדי להשיג יעילות שינוי טוב של שמרים.
ישנם כמה שינויים אופציונליים של הטכניקה. מומלץ להשתמש 1 μg של כל ה-DNA של התורם, pRN1120 או יחיד crRNA מערך ביטוי הקלטת בטרנספורמציה, למרות השימוש בסכום ה-DNA נמוך צפוי גם לגרום ליעילות שינוי משביע רצון. בצע שינוי בדיקה כדי לקבוע אם ניתן להשתמש בכמויות DNA נמוכות. הטרנספורמציה של ה-S. cerevisiae ס עשויה להתבצע בשיטה שונה מזו המתוארת בפרוטוקול זה, למשל הפרוטוקול המתואר באמצעות gietz et al. (2007) 38. the מדריך RNA הנמען פלמיד pRN1120 מתאים לביטוי של crrna בודד ומערך crrna יחיד של משתניםCas12a שונים (למשל, מ-"מוחמץ" . BV3L6 או פרנסיז'לה novicida U112) כמו גם לביטוי של sgRNA בשילוב עם Cas919. ה-DNA התורם אינו צריך להיות מוגבל לתוך הביטוי גנים קרוטנאיד בתוך האזורים האגפים היעד ה-DNA התורם המתואר INT1, INT2 ו INT3 אתרים ב-DNA גנומית. כל ה-DNA של עניין יכול להיות הציג, באופן מדומה, ל-DNA גנומית של המארח על ידי עקרונות העיצוב המתוארים בפרוטוקול זה, או לחילופין DNA תורם יכול לשמש כדי למחוק DNA מן הגנום המארח. המבנה המודולרי של מערך crRNA יחיד מקל על התאמה קלה של מרווח ורצפים חוזרים ישירים. שינוי רצפי מרווח מאפשר שינוי של לוקוס שילוב מיועד אשר יכול להיות מעוצב על ידי אחד הכלים לזיהוי של אתר יעד גנומית, לדוגמה תוכנת הנחיה 1.039. במקום להשתמש ברצפי אגפים גדולים המכילים רצפי מחברים, 50-bp של האזור האגף ניתן לכלול ברצפי ה-DNA של התורם על ידי שילוב רצפי האזורים האלה 50 bp האגפים בצבעי היסוד בשימוש ב-PCR. במקרה זה, בסך הכל רק שלושה במקום תשעה שברי דנ א התורמים נדרשים לניסוי מוצלח של הגנום בקולנוע.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק הוראות צעד אחר צעד כדי לבצע עריכת הגנום מולטיפלקס ב- S. cerevisiae ס באמצעות Cas12a בשילוב עם גישה אחת מערך crrna. הפרוטוקול הוכח על ידי עריכת הגנום מולטיפלקס באמצעות 9 שברי ה-DNA תורם וקוד מערך crRNA יחיד עבור שלוש gRNAs. אנו מציגים תדרים גבוהים עריכה הכוללת בין 50% ו 94% עבור שלושת העיצובים הזנים שדווחו כאן. מסכם, התכונה הייחודית של Cas12a היא היכולת לעבד מערך crRNA יחיד לתוך crRNAs בודדים בתא, מה שהופך Cas12a כלי מצוין כדי לאפשר הגנום מולטיפלקס עריכת ולפתח מודולים רגולציה מיקוד מרובים קלטות ביטוי באחד הולכים. בסופו של דבר, שלושה זנים הושגו הפקת קרוטנואידים ברמה שונה וצבעים בגוונים בין צהוב וכתום. עם אלה זנים וזן פראי, הראנו כיצד מטפל נוזלי אקוסטי יכול לשמש ישר לעשות אמנות פיקסל שמרים – זה לכבוד רוזלינד פרנקלין שתרמו לגילוי של מבנה ה-DNA 65 לפני שנים על ידי צילום המפורסם שלה 5123 < /c1 >.

האנזימים crispr/Cas יש ללא ספק מהפכה בביולוגיה מולקולרית והיה אימץ באופן נרחב כלים עבור גנום הנדסה במהירות שהיתה בעבר לא ריאלי1. השינוי הראשון של מערכת הגנום הסרביסים על ידי CRISPR/Cas9 הגנום המערכת העריכה דווחה על ידי dicarlo ואח '. 2, הוכחת גן מוצלח מעלף וביצוע מוטציות הנקודות באמצעות הציג מבחוץ oligונו, מו, הזרמים. עוד שמרים ההתפתחויות בארגז הכלים של CRISPR כללו: רגולציה בתקנה על ידי היתוך של מCas9 בלתי פעיל לזרז מתים (dCas9) עם הטרנססקריפט התחומים כדי לאפשר הפעלה והשתקה של שעתוק3, בקשה עבור שניהם עריכת הגנום ופונקציות רגולציה עבור הנדסת מסלול מטבולית על ידי הפעלה בו זמנית, דיכוי ומחיקה4, מחיקה של שברי גדול מ -S. cerevisiae ס הגנום5, וכרומוזום מרובה fusions6 .
CRISPR/Cas מערכות עריכת הגנום למצוא את המקור שלהם במערכות החיסון אדפטיבית של חיידקים ומערכות אלה הותאמו על ידי ביולוגים מולקולריים לעריכת הגנום. הפונקציונליות שלהם מבוססת על באשכולות קבועים מקובצים באופן סדיר בטווח הקצר (CRISPR) אזורי DNA קידוד RNA אחראי על ההכרה של ה-DNA הזר או RNA ו CRISPR הקשורים גנים (Ca) אשר מקודד RNA-מונחה .שבעה, שמונה,9 בהתבסס על ניתוח הגנום האחרונות של מערכות CRISPR/Cas זה הוצע לחלק את מערכות CRISPR/Cas לשני מחלקות, חמישה סוגים 16 תת-סוגי10. שני הכיתות נבדלים על בסיס ארגון של מכלולי אפקטור המעורבים במחשוף מטרה. בדרך כלל, מערכות CRISPR/Cas עם ארגון רב-ממדי מסווגים כמחלקה 1, ואילו מכלולי משנה אחת של מתחמי שייכות לכיתה 210,11. במאמר זה, אנו לחקור את class 2 סוג V Cas12a, שנקרא בעבר Cpf110,12, שהיא חלופה לכיתה 2 סוג II Cas9. למרות שCas9 מאופיין היטב ונעשה בו שימוש נרחב במחקר, Cas12a מציעה תכונות נוספות12. ראשית, Cas12a צורות מורכב עם CRISPR RNA (crRNA) של 42 כדי 44 נוקלאוטידים מבלי לדרוש עוד מפעיל הפעלה-RNA CRISPR (tracrRNA). לכן, a מדריך קצר RNA יכול להיות מנוצל עריכת הגנום עם CRISPR/Cas12a מערכות לעומת CRISPR/Cas9. שנית, endonuclease ייחודי ו endoribonucחכירה הפעילות של Cas12a מאפשר התבגרות של pre-crRNA שלה13. פעילות RNase זו מאפשרת קידוד של crRNAs מרובים על מערך CRISPR יחיד, בעוד Cas9 דורש את הביטוי הנפרד של כל מה שנקרא מדריך יחיד RNA (sgRNA) או לחילופין ביטוי לדוגמה של endonuclease נוספת ( לדוגמה, Csy4) בשילוב עם מוטיבים הוקרה עבור Csy4 המקיפים כל sgrna14,15. שלישית, Cas12a היעד הכרה באתר דורש מוטיב הסמוך פרוטומי (פאם) בסוף 5 ' היעד ואת דבק לאחר + 18/+ 23 מיקום של פאם שלה וכתוצאה מכך ביקתה DNA עם קצוות דביק, בעוד Cas9 דורש פם ממוקם על 3 ' הקצה מן ה יעד ו-דבק לאחר מיקום -3 ליצור חתכים בקצה קהה ב-DNA12. רביעית, הקונצנזוס ההסכמה הרצף של פאם שונה בין Cas12a ((T) TTV) ו Cas9 (NGG), מה שהופך Cas12a מועמד מבטיח עבור התמקדות מקדם המקדם T-עשיר ושליחות קטלנית רצפים16. לבסוף, מחקר שנערך לאחרונה דיווח ספציפיות יותר היעד עבור Cas12a מאשר יליד Cas917.
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במערכת CRISPR/Cas12a לעריכת הגנום של S. cerevisiae ס עם מיקוד מסוים על המבוא של ביטוי DNA מרובים לתוך הקורה גנומית עצמאית בו זמנית (עריכת הגנום מולטיפלקס) באמצעות מערך crRNA יחיד. השלבים המרכזיים של הפרוטוקול מתוארים באיור 1. כהוכחה למושג, מערכת CRISPR/Cas12a הוחל על הקדמה של שלוש קלטות הביטוי לתוך הגנום של S. cerevisiae ס המאפשרים ייצור של β-קרוטן18 כפי שמוצג באיור 2. ייצור של β-קרוטן משפיע על הפנוטיפ של S. cerevisiae ס: כלומר, על הקדמה מוצלחת של כל שלושת הגנים הטרוולוגיים הדרושים עבור biotenoid הביוסינתזה, התאים הלבנים של cerevisiae ס להפוך צהוב או כתום, בהתאם לחוזק הביטוי של כל אחד מהמקדם של הגן. בשל הקריאה הפשוטה ויזואלית של מסלול זה, הוא הוצג לפתח מערכות מבוססות crispr מבוסס ושיטות לעריכת הגנום19,20. בעבודה זו, קלטות ביטויים הקידוד של הגנים קרוטאיד Crte, crtyb ו crte נבנו באמצעות שיבוט שער הזהב (ggc) גישה21 עם הטרוולוגיים היזמים ומדבירי הומוולוגי משמש כדי לנהוג בביטוי של הגנים. קלטות הביטויים מוקפות ברצפים ייחודיים של 50-בסיס (bp), המכונים מחברים, המאפשרים בהרכבה vivo עם מאגף שילוב רצפי DNA (אזורים מאגפים) עם רצפים בעלי אותו 50 bp, ואינטגרציה עוקבת לתוך ה-DNA גנומית של שמרים בעמדה שנקבעת על ידי האזורים האגפים. באמצעות החוזקות המקדם שונים, זנים עם רמות שונות של ייצור קרוטנואידים הושגו וכתוצאה מכך וריאציה בצבע של התאים. אלה זנים בהשראת "פרויקט שמרים אמנות"22 -שימשו בכיוונון האיתור עם מטפל נוזלי אקוסטי כדי ליצור 4 צבעים ברזולוציה גבוהה "צילום שמרים" של רוזלינד פרנקלין. פרנקלין (1920-1958) היה כימאי אנגלי ו-X-ray קריסטלוגרף ידוע בשל תרומתו לגילוי של מבנה ה-DNA על ידי צילום 5123,24,25.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים ספציפיים לפרוטוקול</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן מלח</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>מבחר טרנספורמטורים E. coli</td></tr><tr><td>BsaI-HF (20 U/&micro; l)</td> <td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution (מערכה Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td> <td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>בידוד DNA גנומי מ- S. cerevisiae</td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>ליניאריזציה של pRN1120</td></tr><tr><td>חומצה דאוקסיריבונוקלאית מלח נתרן מאשכי סלמון</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1626</td><td>טרנספורמציה של S. cerevisiae (נשא DNA)</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>ליניאריזציה של pRN1120</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט לניתוח</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>בידוד DNA גנומי מ-S. cerevisiae</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין-טטראצטית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>טרנספורמציה של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>G418 מלח דיסולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A1720</td><td>מבחר טרנספורמנטים של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&nbsp;</td><td>אמנות פיקסלים של שמרים</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>100993</td><td>בידוד של DNA גנומי מ-S. cerevisiae</td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידראט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6883</td><td>טרנספורמציה של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Nancy-520 DNA Gel Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>NEB10 תאי E. coli מוכשרים</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>C3019H</td><td>טרנספורמציה של E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB102</td><td>מבחר טרנספורמטורים של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>מאגר Phusion New</td><td>England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 4000</td><td>Merck</td><td>7490</td><td>טרנספורמציה של S. </td></tr><tr><td>תמיסת משקעים של חלבון cerevisiae (10 M NH4AC) (מערכה Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>בידוד של DNA גנומי מ-S. cerevisiae</td></tr><tr><td>צבע טעינה סגול</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B7024S</td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>טיהור פלסמידים</td></tr><tr><td>תערובת אנזימי קוקטייל-RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>בידוד של DNA גנומי מ-S. cerevisiae</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase buffer</td><td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (1 U/&micro; l)</td> <td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>16500500 אשף אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>SV ג'ל וערכת מערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>טיהור מוצרי PCR ו- pRN1120 ליניארי</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td>ליניאריזציה של pRN1120</td></tr><tr><td>זימוליאז 50 מ"ג/מ"ל (5 יחידות/&micro; L)</td> <td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>בידוד של DNA גנומי מ- S. cerevisiae (אנזים ליזיס שמרים)</td></tr> <tr><td>מאגר אחסון זימוליאז</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>בידוד של DNA גנומי מ- S. cerevisiae (הכרחי להכנת אנזים ליזיס שמרים)</td></tr> <tr><td><חזק>כימיקלים לשימוש כללי< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2*תמצית פפטון-שמרים (PY)</td> צלחת אגר <td></td><td></td><td> גידול של E. coli</td></tr><tr><td>2*PY בינוני</td><td></td><td></td><td>גידול E. coli</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>דה-מינרליים</td><td>טרנספורמציה של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>ELFO buffer</td><td></td><td></td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>שלבים מרובים</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>מלח פיזיולוגית</td><td>טרנספורמציה של S. cerevisiae</td></tr><tr><td>TE </td><td></td><td></td><td>אחסון חוצץ של DNA, טרנספורמציה של תמצית שמרי S. cerevisiae-פפטון-דקסטרוז</td></tr><tr><td>(YEPD; 2% גלוקוז) בינוני</td><td></td><td></td><td>גידול אגר</td></tr><tr><td></td><td></td> S. cerevisiae<td>YEPD (2% גלוקוז)</td><td>גידול צלחת של S. cerevisiae</td></tr> <tr><td><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>צינורות <td></td><td></td><td></td><td>אפנדורף</td></tr><tr><td>צינורות בז (50 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלייט 96 בארות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td><td></td>פטרי</tr><tr><td>קצות פיפטה 0.5 - 10 ומיקרו; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה 10 - 200 ומיקרו; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה 100 - 1000 ומיקרו; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות שייק (500 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסננים</td><td></td><td></td><td></td> סטריליים</tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה (צינורות בז)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo 525 אקוסטי מטפל</td><td></td><td></td><td></td>בנוזלים</tr><tr><td>אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סט NanoDrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לספקטרופורזה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית (צינורות אפנדורף)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCSN067</td><td></td><td>Addgene ID 101748</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr> <tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td>זנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain CEN. PK113-7D</td> אוסף <td></td><td>EUROSCARF</td><td>http://www.euroscarf.de</td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

יעילות גבוהה, קלות השימוש צדדיות של האשכולות באופן קבוע במרווחים של התאמה מלאה של palindromic מלאה/CRISPR-חלבון משויך 9 (CRISPR/Cas9) מערכת הקלה שינוי גנטי מתקדם של סכביסיסים cerevisiae ס, מודל אורגניזם וסוס עבודה בביוטכנולוגיה תעשייתית. CRISPR הקשורים חלבון 12a (Cas12a), מונחה RNA endonuclease עם תכונות להבדיל מ Cas9 מוחל בעבודה זו, עוד הרחבת ארגז הכלים המולקולרי למטרות עריכת הגנום. יתרון של מערכת CRISPR/Cas12a היא כי ניתן להשתמש בו ב מולטיפלקס עריכת הגנום עם מדריך מרובים RNAs מבוטא יחידה transcript יחיד (מערך CRISPR בודדים (crRNA) המערך). אנו מציגים פרוטוקול לאינטגרציה של מולטיפלקס של גנים מרובים הטרוולוגי לתוך הבית העצמאי של הגנום S. cerevisiae ס באמצעות מערכת crispr/Cas12a עם מספר crRNAs מבוטא מערך crrna בודד. השיטה המוצעת מנצלת את היכולת של S. cerevisiae ס לבצע ב vivo רקומבינציה של שברי DNA כדי להרכיב את מערך crrna יחיד לתוך פלבאמצע שיכול לשמש עבור בחירת טרנספוראנט, כמו גם הרכבה של ה-DNA תורם רצפים המשולבים לתוך הגנום בעמדות מיועדות. Cas12a מתבטא מראש באופן מכוון, הקלה על המחשוף של ה-S. cerevisiae ס הגנום על העמדה המיועדת על פי ביטוי של מערך crrna יחיד. הפרוטוקול כולל את העיצוב והבנייה של מערך crRNA יחיד וביטוי DNA התורם קלטות, ומנצל גישה שילוב עושה שימוש ייחודי 50 bp רצפי מחברי DNA רצפים ושילוב נפרד האגף DNA רצפים, אשר מפשט את תכנון ניסיוני באמצעות סטנדרטיזציה ומודולליזציה ומרחיב את מגוון היישומים. לבסוף, אנו מדגימים טכניקה פשוטה ליצירת פיקסל אמנות שמרים עם מטפל נוזלי אקוסטי באמצעות שונה בצבע קרוטנאיד הפקת זנים שמרים שנבנו.

מערכת CRISPR/Cas12a בשילוב עם מערך crRNA יחיד מאפשר עריכה משולבת יעילה של הגנום S. cerevisiae ס בבית מרובים בו זמנית. זה הפגינו על ידי בניית קרוטנאיד הפקת זנים שמרים אשר משמשים לאחר מכן כדי ליצור פיקסל ארט שמרים.

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית לעריכת גנום מולטיפלקס של Cerevisiae Saccharomyces על ידי החדרת קלטות ביטוי מרובות על loci שונים בשלב טרנספורמציה אחת. גישת הרכבה פלסמידית חופשית לשיבוט להבעת מערך crRNA יחיד, מובילה לפרוטוקול עריכת גנום מהיר, יעיל וגמיש. אנו מהנדסים תאי שמרים מסוג בר, כדי לייצר קרוטנואידים על ידי החדרת גנים הטרולוגיים בחינם על לוקוסים גנומיים בחינם.מערך crRNA יחיד מורכב crRNAs בודדים חינם לידי ביטוי מיזם RNA פולימראז חינם. Cas12a מעבד ב vivo מערך crRNA לתוך crRNAs בודדים. CRRNAs מדריך Cas12a אל לוצי היעד על ה-DNA הגנומי שבו Cas12a מציג שבירות גדיל כפול.שברי דנ"א כלפי מטה משתלבים מחדש לשילוב מחדש של vivo ומשתלבים בדנ"א גנומי. הפגנת הפרוטוקול תהיה קלאודיה Ciurkot, סטודנט לדוקטורט. ג'פרי ואן ווייק, מדען שותף.וברנדה וונק, מדענית עמיתה בכירה מהמעבדה שלנו. לאחר קבלת מערך crRNA יחיד לניסויים בעריכת גנום מולטיפלקס של דנ"א סינתטי, הכינו את תערובת ההגברה של PCR, וטען את המערך לתוך התרמוצ'ילר להגברה. כדי לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה, הפעל את הדגימות על ג'ל 0.8% agarose ב 5 V / cm במשך 40 דקות.לטעון את סולם ה-DNA עם שברי ה-DNA החל 100 10000 זוגות בסיס ואז לטהר את מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR על פי ההוראות של היצרן. עבור טרנספורמציה שמרים, להתחיל על ידי טרום culturing סוג בר שמרים בבקבוק 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז או YEPD בינוני. עבור דגירה לילה, ב 30 מעלות צלזיוס, ו 250 סיבובים לדקה למחרת בבוקר, לחסן 20 מ"ל של מדיום YEPD טרי עם נפח מחושב של שמרים טרום תרבות לילה.מניחים את התרבות באינקובטור רועד עד צפיפות אופטית של 1.0, נמדד ב 600 ננומטר הוא הגיע. לקצור את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולת תא שמרים ב 20 מ"ל של מים demineralized טמפרטורת החדר, ואחריו צנטריפוגה נוספת.תן את גלולה ב 100 microliters של פתרון ליתיום אצטט טריס-EDTA, ולהעביר את השמרים לצינור microcentrifuge. מערבבים חמישה מיקרוליטרים של דנ"א נושא חד-גדילי ומיקרוגרם אחד של pCSN067 פלסמיד עם ההשעיה של תאי השמרים. לאחר מכן מערבבים 600 מיקרוליטרים של פתרון פוליאתילן גליקול LiAc-TE עם הדגימה.דגירה תאי שמרים פלסמיד במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס ו 450 prm בבלוק חום העליון שולחן. בסוף הדגירה, מערבבים 70 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד עם פתרון הטרנספורמציה. החום מזעזע את התערובת במשך 15 דקות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.מעבירים את התערובת לצינור תחתון עגול 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של YEPD לצינור עבור דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים שהשתנו על ידי צנטריפוגה, ושואפים את כל מלבד 200 microliters הסופי של supernatant.תן מחדש את גלולת תאי השמרים שהשתנתה בשארית העל-טבעית. צלחת 150 microliters של תערובת הטרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של 50 microliters הנותרים של תערובת טרנספורמציה ב YEPD, על צלחות אגר YEPD, בתוספת 0.2 גרם לליטר של G418. לאחר 48 עד 72 שעות ב-30 מעלות צלזיוס, בחרו טרנספורמנט יחיד לפסים מחדש על צלחת אגר חדשה של YEPD בתוספת 0.2 גר'/ל' של G418.עבור השינוי השני, להגדיל את התרבות לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 1.0, כפי שהוכח רק. ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר לכדור התא ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון LiAc-TE והוסף ssDNA.בצינור נפרד, שלבו מיקרוגרם אחד של מערך ה-CRRNA הבודד, מיקרוגרם אחד של פלסמיד הנמען ליניארי עבור מערך ה-CRRNA, מיקרוגרם אחד של כל דנ"א תורם, ומיקרוגרם אחד של כל אזור איגוף. לאחר מכן להעביר את תערובת ה-DNA לצינור של תאי שמרים מוסמכים ולהשלים את השינוי השני כפי שהוכח עבור השינוי הראשון. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב aliquot קטן של על טבעי.ואז צלחת 150 microliters של תערובת טרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של תערובת הטרנספורמציה במדיום YEPD, על צלחות אגר YEPD בתוספת 0.2 g/ L G418, ו 0.2 g / L nourseothricin לאחר 48 עד 72 שעות, ב 30 מעלות צלזיוס, לבחור טרנספורמנט בצבע אחד עבור פסים מחדש על צלחת YEPD חדשה כדי להשיג מושבות צבעוניות בודדות. כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנום, ספור את מספר המושבות הצבעוניות והלבנות על לוחות השינוי, וחלק את מספר המושבות הצבעוניות במספר המושבות הכולל. ליצירת אמנות פיקסל שמרים, יש לחסן בקבוקוני טלטול בודדים של 500 מ"ל המכילים 100 מ"ל של מדיום YEPD עם שלושה זני קרוטנואידים בצבעים שונים המייצרים זני S.cerevisiae, וסוג פראי CEN.זן PK113-7D. הדגירה את התרבויות לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד. העבר 0.5 מ"ל של כל תרבות לילה לצינורות בודדים המכילים 0.5 מ"ל של בינוני שיפוע סטרילי ולא יוני לכל צינור, ומערבבים בקצרה את הפתרונות על ידי מערבולת.העבר את המתלים התא בודדים, מאגר מוסמך 2 על ידי 3 בארות. השתמש בקובץ csv עם הגדרת כיול נוזלים 6RES_AQ_GPSA2 על מכשיר מטפל בנוזל אקוסטי כדי לזהות 25 ננוליטרים של כל זן S.cerevisiae מצלחת המקור המתאימה של המאגר המוסמך למיקרופלאט יעד 6144 המכיל 50 מ"ל של אגר YEPD. כאשר כל בארות כבר הבחינו, דגירה microplate ב 30 degress צלזיוס במשך 48 שעות.כדי להגביר את הצבעים של הזנים, לאחסן את צלחות אגר ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 72 שעות. תמונה של רוזלינד פרנקלין הופיעה על הצלחת. כפי שהוכח, ניתן להרכיב מקדם, מסגרת קריאה פתוחה, שליחות קטלנית ושני רצפי מחברים רציפים של 50 bp לקלטת ביטוי באמצעות תגובת שיבוט שער הזהב, ולאמת אותם על-ידי PCR.לאחר הגברה של מערך crRNA יחיד על ידי PCR, פלסמיד הנמען עבור מערך crRNA יחיד הוא ליניארי כפי שאושר על ידי אלקטרופורזה. היעילות של עריכת הגנום מולטיפלקס ניתן לחשב על ידי אחוז המושבות הצבעוניות לאחר השינוי, ועל ידי התוצאות של ניתוחי PCR המאשרים את השילוב של DNA התורם במקומות DNA גנומי המיועד. לדוגמה, החל מתמונה בשחור לבן של רוזלינד פרנקלין, נוצרה תמונה בארבעה צבעים ורשימת איתור ששימשה אז כדי לזהות את ארבעת זנים שמרים שונים על מיקרופלסטיק אגר באמצעות מטפל נוזלי אקוסטי, כפי שהוכח, וכתוצאה מכך ציור שמרים ברזולוציה גבוהה של המדען.לשינוי זה, השתמש בפתרונות טריים ובשברי דנ"א באיכות גבוהה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם עבור כניסת מולטיפלקס של מחיקות מוגדרות מוטציות הצבע לתוך DNA גנומי. בנוסף, ניתן לבצע ניסויי ויסות CRISPR.ניתן לשנות שיטה זו כדי להציג יותר crRNAs חינם בתוך מערך כדי להגדיל את מספר שינויים בו זמנית שניתן לבצע.

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

הנדסה יעיל הגנום של קנדידה אלביקנס חיוני להבנת הפתוגנזה של התפתחות הרפוי. כאן, אנחנו תיאר נוהל לעריכת במהירות ובדייקנות את הגנום אלביקנס ג באמצעות CRISPR. הפרוטוקול מאפשר חוקרים כדי להציג מגוון רחב של שינויים גנטיים כולל מוטציות נקודה, הוספות ומחיקות.

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 היא עורכת גנום קלה לשימוש ששימשה למינים מודלים ולא דגם. כאן אנו מציגים גרסה מבוססת חלבון של מערכת זו ששימשה להכנסת קודון עצירה מוקדמת לגן הזדווגות של פטריית אסקומיסט לא מודלית.

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

למד עריכת גנום מולטיפלקס ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מערך crRNA יחיד ללא שיבוט. שיטה זו מאפשרת יצירת זני שמרים מייצרי קרוטנואידים ואמנות פיקסל ביולוגית.

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

גלה סרטונים נוספים