Name: בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: למדו לבודד קרטינוציטים מעור עכבר ולצבוע אותם בנוגדנים מתויגי מתכות לניתוח ציטומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת פרופילינג מדויק של ביטוי חלבונים במחזור התא לחקר סרטן ומחלות אחרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה עבור עבודה זו הגיע מהמחלקה לדרמטולוגיה, מרכז השערים לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטת קולורדו ואוניברסיטת קולורדו (UC) מחלת העור המרכז מורפולוגיה וליבות פנוטיפים (NIAMS P30 AR057212). המחברים מכירים את ה-UC סרטן מרכז זרימה Cy, משאב משותף ותמיכה מענק (NCI P30 CA046934) עבור הפעולה של cytometry המוני ואסירי תודה על קארן הלם וכריסטין צ'יילדס בליבה עבור הייעוץ המומחים שלהם על הזרימה המונית cy, המוני טכניקות.

הוועדה המייעצת לטיפול בבעלי חיים בקמפוס קולורדו אישרה את ניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה.
1. ההכנות
<ol><li>עיצוב מתכת מתויג הפאנל הלוח. השתמש בתוכנת העיצוב המקוונת החופשית של הפאנל12 וכוללים 127iododeoxyuridine (idu), 164Dy (דיירוסיום) שכותרתו Anti-CCNB1 (בשנת B1), 175Lu (לוטציום) פוספהו (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), ו 150 Nd (ניאודימיום)-חלבון pRETINOBLASTOMASer807/811 (prb)13. הוסיפו נוגדנים נוספים שתויגו מתכת שאינם חופפים לערוץ14שלהם.</li>
	<li>הכן פתרון מלאי IdU. התמוססות IdU אבקה ב 10 מ"ג/mL ב 0.1 N NaOH ב 60 ° c. מניות IdU הפתרון מלאי לצינורות מיקרוצנטריפוגה ולהקפיא ב-20 ° c עבור אחסון לטווח ארוך.<ol>
<li>להתאים את ה-pH של פתרון IdU כדי 7.5 עם 12 N HCl מיד לפני השימוש. מבחן עם רצועת pH על מחיקת סדרת מחלקים כדי להבטיח את הפתרון הוא ב-ph 7.5. הערה: זמן ממושך (> 5 דקות) של IdU ב-pH 7.5 יביא משקעים ומים טריים של IdU נדרש כאשר זה קורה.</li>
		<li>השתמש בציוד הגנה אישי מתאים (למשל, כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות) ולעבוד בקבינט בטיחות בעת טיפול בפתרונות NaOH או HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו פתרון של פאראמפורמלדהיד בגובה 2 x. שילוב 5 מ ל של 10x PBS (pH 7.5) ו-1 מ ל 16% הגמר עם 44 mL של dH כיתה מולקולרית טהור2O (3.2% הריכוז הסופי). הערה: ניתן להכין מלאי של כלת1 כאשר פורסם בעבר15 או לרכוש 16% מניות ללא מתכות מזהם.<ol>
<li>השתמש בציוד הגנה אישי מתאים ועבוד בקבינט בטיחות בעת טיפול באבקה ובפתרונות בתחום הלקלטיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת בריום (Ba2 +) חינם 1x pbs ידי שילוב של 5 מ ל של מתכת ללא תשלום 10x Pbs (pH 7.5) עם 45 Ml של dH טהור כיתה מולקולרית2O. הערה: האיכות של ה-PBS וריאגנטים אחרים חשוב מאוד להימנע מזיהום מתכות שיכולות להחדיר רעשי רקע במהלך ניתוח של נתוני הציטוטריק ההמוני.</li>
	<li>הכינו פתרון מניות של 100 מ"מ. התמוססות 300.5 מ ג של אבקת ציספלטין ב 10 מ ל של DMSO. חנות באליבטס ב-80 ° c. להכין פתרון 10 מ"מ עבודה ציספלטין עבור ניסויים לשימוש על 1 d.</li>
	<li>להכין פתרונות אפידרמיס/dermis הפרדה. הכן 20 x dispase פתרון מניות על ידי המסת 30 מ"ג ב 1 מ ל של HBSS או PBS. מסנן לעקר באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר ולאחסן ב-ali, ב-20 ° c. הכנת 1x סוג הרביעי העירוי קולגן מניות פתרון ב 1 מ"ג/mL ב hbss, מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר, ולאחסן ali, ב-20 ° c.</li>
</ol>2. הוספת תוויות לשלב של התאגדות IdU
<ol><li>. שוקלים עכברים השתמש ב-P1-P3 גורי המין או בעכברים מבוגרים בן 8-10 שבועות ולהשתמש בעכברים זכרים או נקבות מC57BL/6, FvB, או 129 רקעים. לקבוע מינון ב 0.1 מ"ג IdU (pH 7.5)/g משקל הגוף. לדוגמה, a 25 g העכבר דורש 0.25 mL של IdU.</li>
	<li>לספק את המינון של IdU על ידי הזרקת הצפק ולחכות 2 h לפני איסוף התאים. השתמש במזרק טוברקולין. כדי להזריק לגורי התינוק הערה: מנה של 2 מ"ג/mL של IdU ניתן להשתמש עם תאים תרבות הרקמה עם הדגירה 1 h ב 37 ° צ' לפני הקציר ותיוג עבור cy, המוני המוניים.</li>
</ol>3. בידוד תאים לתיוג
<ol><li>הפשרה dispase ו קולגן פתרונות מניות. לדלל את הפתרון 20x dispase כדי 1x (1.5 mg/mL) סטרילי HBSS או PBS. לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.</li>
	<li>לשלב 2 כרכים של dispase עם אחד הנפח של הקולגן בתוך אמצעי אחסון כולל המאפשר לעור לצוף בחופשיות. לדוגמה, העיכול של 5 עורות של העכבר האנ, ניתן צף על 8 מ ל של 1x dispase עם 4 מ ל של הקוליואז ב 100 מ"מ צלחת פטרי.</li>
	<li>עקבו אחר שיטות מאושרות להמתת החסד של עכברים ניסיוניים (למשל, בדיקת מנת יתר/צביטה בבוהן או2 שאיפת שאיפה/צוואר הרחם). נקו את עור האוזן המבוגר בתמיסה של יוד (ראו טבלת חומרים) ושטפו במים סטריליים כאשר תאים מבודדים משמשים לתרבות הרקמה.</li>
	<li>מסירים בניתוח את האוזן בבסיס (איור 1A). לשטוף את האוזניים PBS סטרילי כאשר תאים מבודדים היא לשמש לתרבות רקמות. מניחים על יבש 100 מ"מ צלחת פטרי.</li>
	<li>להפריד בזהירות קדמית מן העור האחורי על ידי יצירת בתחילה כיס באמצע או בקצה של אזור לחתוך באמצעות מלקחיים עדינים משיכת שני מדפים העור מלבד ( איור 1B-D). המשיכו עם העור הקדמי והאחורי. הערה: הוראות מפורטות לנתח את עור התינוק בבית התינוק מסופקים על ידי Litchi ואח '16 בנוסף, השימוש בהיקף מבתר עשוי לסייע בהפרדה בין העור האחורי לבין הזיהוי של האפידרמיס/הצדדים העורי של גזור העור: השיער נראה בצד האפידרמיס ואילו הדרמיס יהיה מראה ז'לטין.</li>
	<li>בזהירות מניחים את העורות הקדמי והאחורי של האוזן עם הצד דרמיס של העור נוגע dispase/קולגן הפתרון ( איור 1e). השתמש ב-1 mL עבור העור הקדמי והאחורי של אוזן אחת לכל באר של 12 לוחית התרבות הטובה. מודטה ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 h. לחילופין, לצוף עורות על פתרון 1x dispase ב 4 ° צ' עבור 16-18 h.3 הערה: עבודה במכסה של תרבות רקמה עם טכניקה סטרילית כאשר התאים הם להיות מתורבתים.</li>
	<li>מניחים את העור מתעכל עם הצד האפידרמיס נוגע במשטח של צלחת פטרי נקי. לשטח את העור בעדינות להחליק את האפידרמיס על ידי עבודה מהמרכז לקצוות בתבנית מעגלית.</li>
	<li>להיפטר הדרמיס או לעכל את זה עוד כדי לשחרר את הגידולים עבור תרבות רקמות או ניתוח16. הערה: דרמיס יהיה כהה יותר במראה יש הרכב הז'לטין ודביק. . זה בסדר. כישלון או קושי בהסרת דרמיס מציע מספיק עיכול רקמות. עם זאת, דגירה מורחבת במאגר העיכול תפחית את הכדאיות בתאים. האפידרמיס יישאר על צלחת פטרי ויהיה מראה מולבן.</li>
	<li>להרים בעדינות את האפידרמיס על ידי לתפוס בקצוות ולקלף אותו מעל פני השטח של צלחת פטרי. בזהירות מניחים את האפידרמיס על פתרון התנתקות תא טרום מחומם (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° צ' או 20 דקות ב RT. השתמש 500 μl של התנתקות תא פתרון עבור 2 האוזן למבוגרים epidermises לכל טוב של 12 היטב לוחית התרבות ולהשתמש 750 μl של ניתוק התא פתרון לאפידרמיס של תינוק בודד לכל טוב של לוחית של 6 מיטב התרבות.</li>
	<li>לתפוס את האפידרמיס באמצעות מלקחיים סטרילי לשפשף על ידי גרירת האפידרמיס נגד החלק התחתון של המנה כדי לנתק תאים. הוסף 1 מ ל של dmem המכיל 1% fbs (0.01 mL) ולעבור דרך בתוך הנפה בתוך מסננת של תא 40 יקרומטר לתוך צינור אוסף. לשטוף היטב עם תוספת 2 מ ל של DMEM ולהוסיף את ההשעיה התא.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 120 x g עבור 5 דקות. מרוב בזהירות על הסופרנטנט.</li>
	<li>השהה מחדש את מסכת התאים ב-1-2 mL של DMEM המכיל 1% FBS. לקבוע את ספירת התא ו-% live של התאים באמצעות טריקון כחול ומכשיר האו ספירה אוטומטי. התאים גלולה כמתואר בשלב 3.11. הערה: תאים יכולים להיות מתורבתים במדיה המתאימה לתרבות הרקמה אחרי שלב 3.12. מיכל בן 17</li>
</ol>4. תיוג cisplatin טינית כדי לקבוע תאים חיים/מתים
<ol><li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים לכל 1 מ ל של dmm המכיל 25 μm ציספלטין טינית (2.5 μl של מלאי/mL). דגירה של 1 דקות וכיבוי על ידי ליטוף עם נפח שווה של FBS (למשל, 1 mL).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 120 x g עבור 5 דקות decant הסופר לתוך גביע המכיל אקונומיקה מדולל ולהפוך צינורות לנקז את הפתרון הנותר על מגבת נייר. הקש בעדינות כדי לשחרר את הפתרון הנותר על הגלולה ואת הקיר צדדי של הצינור.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. התאים גלולה כמתואר בשלב 4.2. הערה: מומלץ לתקן תאים אם לא ניתן להכתם מיידית.</li>
</ol>5. קיבעון של תאים המסומנים בתווית (אופציונלי)
<ol><li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים מסומנים בלטינית ב 1 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. תאים מערבולת תחת כוח נמוך רציפה ולהוסיף dropwise 1 mL (1 אמצעי אחסון) של מאגר הקיבעון 2x בלטקס. דגירה ב-RT עבור 10 דקות על פלטפורמת נדנדה.</li>
	<li>התאים גלולה כמתואר בשלב 4.2, אבל צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 2 מ ל של Ba+ 2-התאים החינם של PBS ו גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 5.3 פעם אחת.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. חנות ב 4 ° c עבור < 3 ד. הוסף FBS ל 3% (למשל, 0.3 mL של FBS/mL של תאים) של נפח הכולל אם לאחסן יותר > 3 d, ואז לערבב ולהקפיא ב-80 ° c. הערה: קיבעון עלול להשפיע על גילוי של אפיסקופים מסוימים. ההשפעות של קיבוע אותות נוגדן צריך להיקבע באמצעות המחשב האמפירי.</li>
</ol>6. ברקוד של דגימות (אופציונלי אך מומלץ)
<ol><li>כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2 ולאחר מכן השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 1 מ ל של מאגר קיבעון 1x (ראה טבלת חומרים). דגירה ב RT עבור 10 דקות. כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2.</li>
	<li>שטוף תאים בעלי 1 מ ל של מאגר חדירות ברקוד (ראה טבלת חומרים). התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 6.2 פעם אחת.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מאגר חדירות ברקוד לברקוד (ראה טבלת חומרים)18 ומערבבים מיד בעוד התאים משלב 6.2 הם פלטינג.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה בתא ב-800 μL של מאגר חדירות ברקוד. הוסף פתרון ברקוד לתאים, לערבב ו-דגירה ב RT עבור 30 דקות. התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. שטוף תאים 2 מ ל של מאגר צביעת תאים (ראה טבלת חומרים) וכלי גלולה שוב. הערה: ניתן לתייג עד 20 דגימות בצירופים שונים של מתכות של פלדיום18. אסטרטגיות אחרות לכתיבת ברמנים מתוארות במקום אחר15.</li>
</ol>7. מתייג תאים לצילנסות המונית
<ol><li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 1 מ ל של החומר הגרעיני אנטיגן מכתים פתרון העבודה (ראה טבלת חומרים). שילוב דגימות לתוך צינורית אחת עבור השלבים הבאים בעת שימוש בדגימות ברקודים. דגירה ב RT עבור 30 דקות. גלולה כמתואר בשלב 5.2.</li>
	<li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 2 מ ל של מאגר החדירות הגרעיניות (ראה טבלת חומרים). . קנה מידה לפי הצורך לדוגמה, השתמש 6 mL של מאגר עבור 10 דגימות משולבות עם ספירת תאים של 9 x 106 תאים. גלולה כפי שתוארה בשלב 5.2.</li>
	<li>חזור על שלב 7.2. מערבולת בעדינות את הגלולה התא בתוך הכרך השאריות שנשאר בתוך הצינור.</li>
	<li>הוסף 50 μL של קוקטייל הנוגדן תאיים לכל 1-3 x 106 תאים. . קנה מידה לפי הצורך לדוגמה, השתמש 150 μL של קוקטייל הנוגדן עבור 10 דגימות משולבות עם ספירת תאים של 9 x 106 תאים. מערבבים ו-דגירה ב-RT עבור 45 דקות. הוסף 2 mL של מאגר צביעת התא ואת הגלולה כפי שמתואר בשלב 5.2.</li>
	<li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים גלולה ב 2 מ ל של מאגר צביעת תאים. התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 7.5 פעם אחת. הערה: פתרונות מאגר אחרים יכולים לשמש לצביעת קרום מערות או סמנים cytoplasmic ו-ניסויים יכול להיות למטב את הצביעת אם יש צורך לזהות אפיסקופים במיקומים סלולריים שונים. תאים יכולים גם להיות קבוע בתוך הכדורגלן אחרי שלב 7.5 כאשר משתמשים בתאים חיים לצביעת.</li>
	<li>השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב-1 מ ל של פתרון עיבור וחנות עבור 1-3 d ב -4 ° c.<ol>
<li>לאחסן את התאים ב-80 ° c ב-dmso המכיל את הפתרון עבור > 3 ד. כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2 אם התאים נמצאים בפתרון עיבור. להשעות את הגלולה מחדש (1-3 x 106 תאים) ב 1 מ ל של תא צביעת תאים מאגר ו גלולה כמתואר בשלב 5.2. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של 10% DMSO/90% FBS19, העברה להקפאה, מקום במיכל הקפאה איזופרופיל, ולאחסן ב-80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. לשטוף 1-3 x 106 תאים עם 2 מ ל של תא מכתים מאגר, הפלטינג כפי שמתואר בשלב 5.2. בצע שני שוטף נוסף עם 2 mL מים, הפלטינג כפי שמתואר בשלב 5.2.</li>
	<li>לדלל מחרוזת כיול EQ 1:9 במים (פתרון מניות ב 3.3 x 105 חרוזים/mL).</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה הסלולרית בריכוז של 1 x 106 תאים/mL בתמיסה מדוללת באמצעות חרוז EQ. לסנן תאים דרך מסננת 35 יקרומטר כובע תזרים צינורות.</li>
	<li>הפעל דגימות על cytometer ההמוני ולרכוש נתונים. הנתונים יופקדו בתבנית קובץ מסוג Flow Cy, Standard (FCS).</li>
</ol>8. עיבוד וניתוח של מערכות הנתונים המוניות של cy,
<ol><li>נרמל קבצי FCS. השתמש בתוכנה חופשית הזמינה ב https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
</li>
	<li>. בסדר. להפריד את אוכלוסיית ברקוד במאגר לתוך קבצים נפרדים ברקודים עם תוכנה חופשית זמין ב https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
</li>
	<li>ניתוח קבצי FCS מנורמל. השתמש מסחרי21,22 או תוכניות freeware (ראה web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).</li>
</ol>

<ol><li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+proliferation+markers%3A+PCNA%2C+Ki-67%2C+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li>
<li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3%2C+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedCentral+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).</li>
<li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li>
<li>http://www.dvssciences.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.dvssciences.com">http://www.dvssciences.com</a> (2019).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).</li>
<li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li>
<li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>http://www.cytobank.org. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cytobank.org">http://www.cytobank.org</a> (2019).</li>
<li>http://www.flowjo.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com">http://www.flowjo.com</a> (2019).</li>
<li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45%3A+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li>
<li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS%2FFLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid%2Ferythroid+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery%2C+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li>
<li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li>
<li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li>
<li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המתואר בנייר זה ניתן להשלים בערך 8 h. התוצאה הסופית היא השעיה של תאים מועשר KCs שניתן לנתח עבור ביטוי חלבון באופן תלוי מחזור התא. מספר מחקרים קודמים יש שיטות מתווה לבידוד kcs מעור אדם ועכבר16,25. מחקרים אלה כוללים גם פרוטוקולים עבור בידוד של KCs עבור זרימה cy, מנסה26. עם זאת, פרוטוקול מפורט לא תוארה בעבר המשלב בידוד של KCs עם ניתוח של ביטוי חלבון ודינמיקה מחזור התא באמצעות cy, המונית המוניות.
המשוכה הג...

קורלציה של ביטוי גנים עם שלבי מחזור התא נשאר אתגר בניתוח של מודלים בעלי חיים של מחלות hyperplastic כמו סרטן. חלק מאתגר זה הוא שיתוף זיהוי של חלבונים של עניין (פוי) עם סמנים של התפשטות. תאים מתרבים ניתן למצוא שלבים שונים מחזור התא כולל G1, S, G2, ו-M. Ki67 הוא אחד הסמנים הנפוצים ביותר של התפשטות והוא מתבטא בכל השלבים של מחזור התא. זה נעשה בשימוש נרחב בניתוח של רקמות האדם והעכבר1,2,3. עם זאת, כמו סמני התפשטות כלליות אחרים, Ki67 אינו משנה שלבים במחזור תאים בודדים. גישה מדויקת יותר משתמשת התאגדות של הנוקלאוטידים האנמיטין האנלוגיים כמו ברומאודאוקסילדין (brdu) לתאים הנמצאים באופן פעיל משכפל הגנום שלהם (כלומר, S-שלב)4,5. חיסרון אחד לשימוש של נוקלאוטיד מקבילים הוא הצורך לנהל אותם לחיות בחיים שעות לפני הניתוח. Ki67 ו BrdU מזוהים בדרך כלל על מקטעים רקמה קבועה על ידי שימוש של נוגדנים. אחד היתרונות של גישה זו היא כי המיקום של POIs ניתן לברר בתוך הארכיטקטורה רקמה (למשל, שכבת הבסיס של אפידרמיס העור). גישה זו גם אינה דורשת דיסוציאציה של רקמות שעלולה להוביל לשינויים בביטוי הגנים. חיסרון אחד הוא כי קיבוע רקמות או עיבוד של הרקמה עבור OCT קפוא או הפרפין מאפשר לסגר מטרות נוגדנים (כלומר, אנטיגנים). אחזור של אנטיגנים בדרך כלל דורש עיכול חום או רקמה. הכמת של עוצמות מכתים יכול גם להיות מאתגר. הדבר נובע מווריאציות של כתמים, עובי מקטעים, זיהוי אותות והטיית מע. יתר על כן, מספר מוגבל של סמנים ניתן להבחין בו זמנית ברוב הגדרות המעבדה טיפוסי. עם זאת, גישות חדשות יותר לצביעת מחדש מבטיחים להתגבר על מגבלות אלה; דוגמאות הן הדמיה מאסיבית של cy, והגברה אות של טירמידה6,7.
Cy, הזרמת הזרימה היא טכנולוגיה חזקה נוספת כדי לזהות תאים מתרבים. זה מאפשר זיהוי מולטיפלקס של סמנים בתאים זהים אך דורש הדיסוציאציה רקמות עבור סוגי תאים שאינם המטבטיים ביותר. ניתוח של תאים מתרבים נעשה באופן שגרתי על ידי שימוש בצבעים לאגד DNA (למשל, Propidium יודיד (PI))8. Cy, הזרמת מיתרים גם מאפשרת קביעה מדויקת יותר של שלבי מחזור התא כאשר ביחד עם זיהוי של התאגדות BrdU9. למרות גישה רבת עוצמה, BrdU/PI הזרימה cy, הזורם יש חסרונות שלה. אין אפשרות לפתור את השלבים G2/M ו-G0/G1 ללא הכללה של נוגדנים ספציפיים לפאזה. עם זאת, מספר נוגדנים שניתן להשתמש בו מוגבל על ידי הסלולר autoפלואורסצנטית, גולש ספקטרלי של פליטת fluorophore, ואת השימוש של שולטת פיצוי. מגבלה זו קומות אותו יותר מאתגרת ומפרך כדי לזהות את הביטוי של סמנים מחזור התא עם pois. גישה יותר נתיישב היא להשתמש cy, המסה המוני10,11. טכנולוגיה זו משתמשת בנוגדנים מצוצרים מתכת כי יש ספקטרום זיהוי צר. ברגע שהתאים מוכתמים בנוגדנים עם מתכת-מתויג, הם מתאדה, ואת המתכות שזוהו על ידי cy, לנסות זמן הטיסה (Cyתוף) המסה ספקטרומטריה. בשל מאפיינים אלה, cy, ההמוני הגדול מאפשר זיהוי של > 40 סמנים שונים באמצעות פלטפורמות קיימות10,11. בנוסף, ניתן לבצע דגימות ברקוד עם מתכות הגורמות לחיסכון של נוגדנים יקר תוך הפחתת דגימת לדוגמה לשונות מכתים. מצד שני, לציטומה ההמוני יש כמה חסרונות. יש מספר מצומצם של נוגדנים מסחרי זמין מתכת מתויג עבור תאים שאינם בדם נגזר. הכמת של תוכן ה-DNA הוא רגיש פחות לעומת השימוש של צבע ה-DNA פלורסנט ו cy, לנסות ההמוני יש טווח דינמי מופחת של זיהוי אותות לעומת זרם הזריחה cy, try.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לנתח את הדינמיקה מחזור התא מן keratinocytes מבודדים (KCs) מעור העכבר ולאפיין את מחזור התא ביטוי חלבון ספציפי בתאים אלה באמצעות cy, מאסה המונית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם תאים מתורבתים או מותאמים לסוגי תאים אחרים.

<table><tbody><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>טיפול בתא</td><td>229512</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אינטרקלטור</td><td>Fluidigm</td><td>201192A</td><td>125 ומיקרו; M - תמיסת אינטרקלטור IR</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>30525-89-4</td><td>16 %&nbsp; </td></tr><tr><td>צינורות זרימת כובע מסננת</td> PFA <td>פישר/קורנינג</td><td>352235</td><td>35 ומיקרו; גודל נקבוביות&nbsp;</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>פישר</td><td>22363547</td><td>40 &mu; גודל נקבוביות&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת פירוק תאים</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-ACCUTASE-100</td><td>תמיסת יוד Accutase</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher/Purdue</td><td>67618-151-17</td><td>בטדין 7.5%-קרצוף כירורגי יוד</td></tr><tr><td>ברקוד מאגר פרמיביליזציה&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd ברקודים</td></tr><tr><td>ברקודים</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd ברקודים</td></tr><tr><td>רצועות pH EMD</td><td></td><td>9590</td><td>colorpHast</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Dulbecco' s Modified Eagle Media</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-5-PO</td><td>Dumostar #5</td></tr><tr><td>מלקחיים מדויקים מעוקלים</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-7-PO</td><td>Dumostar #7</td></tr><tr><td>חרוזי כיול</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>EQ חרוזי כיול ארבעה אלמנטים</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק</td></tr><tr><td>פישר</td><td>מים</td><td>SH30538.03</td><td>Hyclone ביולוגיה מולקולרית בדרגת מים</td></tr><tr><td>Iododeoxyuridine</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>I7125</td><td>IdU</td></tr><tr><td>Cryo בקבוקונים</td><td>ThermoFisher</td><td>366656PK</td><td>חוט פנימי</td></tr><tr><td>מאגר צביעת תאים</td><td>Fluidigm</td><td>201068</td><td>Maxpar Cell מאגר צביעה</td></tr><tr><td>תיקון & מאגר סלסול</td><td>Fluidigm</td><td>201067</td><td>Maxpar Fix & מאגר סלסול</td></tr><tr><td>תיקון I חוצץ</td><td>נוזלים</td><td>201065</td><td>Maxpar Fix I חוצץ</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>Rockland</td><td>MB-008</td><td>ללא מתכת 10x PBS</td></tr><tr><td>מיכל הקפאה איזופרופנול</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Mr.Frosty</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר</td><td>BP359-500</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Kord-Valmark</td><td>2900</td><td>סופק על ידי Genesee 32-107&nbsp;</td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>אולימפוס חרוטי / ג'נסי</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל אולימפוס חרוטי</td><td>/ ג'נסי</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>טיפול בתא</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>ציספלטין</td><td>סיגמא</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>סיגמא / רוש</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>צביעת אנטיגן גרעיני&nbsp; מאגר חדירות</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>מאגר צביעת אנטיגן גרעיני</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>מזרק טוברקולין</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV&nbsp;</td><td>וורת'ינגטון ביוסיינס</td><td>CLSS-4</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וכתמים של העור העכבר keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות ולכמת ביטוי חלבון שינויים באופן תלוי מחזור התא באמצעות תאים בודדים מבודדים האפידרמיס של העור העכבר. ישנם שבעה צעדים חשובים: הפרדת האפידרמיס מן dermis, העיכול של האפידרמיס, כתמים של אוכלוסיות תאים באפידרמיס עם cisplatin טינית, מדגם barcoding, צביעת עם נוגדנים מתויג מתכת עבור סמנים מחזור התא וחלבונים של ריבית, זיהוי של נוגדנים מתויגים מתכת על ידי cy, המוניים לנסות, ואת ניתוח הביטוי בשלבים מחזור התא השונים. היתרון של גישה זו על שיטות היסטולוגית הוא הפוטנציאל לסדר את תבנית הביטוי של > 40 סמנים שונים בתא בודד בשלבים שונים של מחזור התא. גישה זו מאפשרת גם ניתוח מתאם מרובה משתנים של ביטוי חלבון הניתן לכימות יותר מאשר שיטות היסטולוגית/דימות. החיסרון של פרוטוקול זה הוא כי השעיה של תאים בודדים נדרש, אשר מביא לאובדן מידע מיקום שסופקו על ידי הצביעת של מקטעי רקמות. גישה זו עשויה גם לדרוש הכללה של סמנים נוספים כדי לזהות סוגים שונים של תאים בשעיות תא גולמי. היישום של פרוטוקול זה ניכרת בניתוח של מחלת עור hyperplastic מחלות. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של תת סוג ספציפי של תאים (למשל, תאי גזע) על ידי הוספת נוגדנים ספציפיים לשושלת היוחסין. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לניתוח של תאי העור במינים ניסיוניים אחרים.

טבלה 1 מראה את תשואות התאים הצפויות ויכולת הכדאיות מתוך האוזן של העכבר המבוגר (איור 1) והעור הבין-מחלות בתנאים לא פתולוגיים. הטבלה גם מציגה נתונים מייצגים של בעלי חיים מעורב C57/126 רקע. הוא צפוי כי העור של זנים אחרים יגרום התשואות תאים דומים והviabilities. התשואה המשוערת תלויה על פני השטח של העור ומצביעה על כך שעור התינוק יהיה בחירה טובה יותר לניסויים הדורשים מספר גדול יותר של תאים (שולחן 1). תשואות נמוכות או כדאיות מופחתת (...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משתי סיבות עיקריות. מספר אחד, זה מאפשר למשתמש להיות מסוגל לקבוע את מצבי מחזור התא של תאי העור שבודדו ממודל של בעלי חיים. זה גם מאפשר לנו להיות מסוגלים לנתח ביטוי חלבון בשלבים הדיסקרטיים של מחזור התא.בהשוואה לשיטות קודמות לקביעת התפשטות תאים, השיטה שלנו מאפשרת קביעה מדויקת יותר של השלבים השונים במחזור התאים, ואנחנו יכולים גם לנתח יותר מ -40 סמנים שונים בשלבים השונים של חלוקת התאים. זה משפר מאוד את היישום ואת הרבגוניות של השיטה. פרוטוקול זה עשוי לשמש בחקר הסרטן ובכל סוג אחר של מחלה שבו יש צורך לקבוע מחזור התא דפוסי ביטוי חלבון ספציפיים.בנוסף, ניתן לשנות פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים ולאורגניזמים אחרים במודלים. המשתמש בפעם הראשונה צריך להתמקד מקבל את ההכנה התא באיכות הטובה ביותר האפשרית. זה דורש עיבוד בזמן של עור ניסיוני באמצעות reagents טרי, זמן עיכול רקמות מינימלי, וסילוק זהיר של supernatant לאחר צנטריפוגה כדי לשמור על שלמות וכמות התאים.ראשית, תכנן פאנל נוגדנים מתויג במתכת באמצעות תוכנת עיצוב פאנל מקוונת חינמית, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן הכינו פתרון מלאי IdU על ידי המסת אבקת IdU ב-10 מיליגרם למיליליטר ב-0.1 נתרן הידרוקסידי רגיל ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר aliquoting פתרון מלאי IdU לתוך צינורות microcentrifuge, להקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.מיד לפני השימוש, להתאים את ה- pH של פתרון IdU ל 7.5 עם 12 חומצה הידרוכלורית נורמלית, ולבדוק עם רצועת pH על aliquot להשליך כדי להבטיח את הפתרון הוא ב pH 7.5. כדי להכין פתרון תיקון פרפורמלדהיד x, לשלב חמישה מיליליטר של 10 x PBS ומיליליטר אחד של 16% PFA עם 44 מיליליטר של מים מזוקקים מולקולריים טהורים. כדי להכין 100 מילימולרי ציספלטין פתרון מלאי, להמיס 300.5 מיליגרם של אבקת ציספלטין ב 10 מיליליטר של DMSO.לניסויים שישמשו במשך יום אחד, הכינו פתרון עבודה של 10 מילימולרים. לשקול עכברים ולאחר מכן לקבוע מנה ב 0.1 מיליגרם של IdU לגרם של משקל גוף. לנהל את המינון המחושב של IDU על ידי הזרקה תוך-לידתית, ולחכות שעתיים לפני קצירת תאים.השתמש זוג מספריים כיתה כירורגית כדי להסיר בניתוח את האוזן של העכבר המתת חום שהוזרק בעבר עם IdU בבסיס האוזן. מניחים את האוזן על צלחת פטרי יבשה 100 מילימטר. בזהירות להפריד את הקדמי מן העור האחורי באמצעות ממטרים עדין כדי ליצור כיס באמצע או בקצה של האזור לחתוך, ולאחר מכן למשוך את שני מדפים העור לגזרים, ולהמשיך עם העור הקדמי והן האחורי.בזהירות למקם את העורות האחוריים והעורפיים של אוזן אחת באר אחת של צלחת תרבות 12-well, מלא מיליליטר אחד של פתרון dispase / קולגן מוכן טרי, עם הצד derma של העור נוגע בתסכה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לעכל את העור. מניחים את האוזן מתעכל או עור יילודים בצלחת פטרי נקי עם הצד epidermis נוגע על פני השטח של המנה.באמצעות מדפים, לשטח את העור בעדינות להחליק את הדרמיס את האפידרמיס על ידי עבודה מהמרכז אל הקצוות בתבנית מעגלית. עם מטחנות, לתפוס את האפידרמיס בקצוות בעדינות להרים אותו על ידי קילוף אותו מפני השטח של צלחת פטרי. בזהירות למקם את האפידרמיס על פתרון ניתוק תאים מחומם מראש באר אחת של צלחת.דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס או 20 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש מדפים סטריליים כדי לתפוס את האפידרמיס לשפשף על ידי גרירת האפידרמיס נגד החלק התחתון של המנה כדי לנטרל תאים. הוסף מיליליטר אחד של DMEM המכיל 1%FBS, ועובר דרך מסנון תא 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף.יש לשטוף היטב עם שני מיליליטר נוספים של DMEM ולהוסיף המתלה התא. לאחר צנטריפוגה ב 120 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות לשאוף את supernatant. תן שוב את גלולת התא באחד עד שני מיליליטר של DMEM המכיל 1%FBS, ו גלולה את התאים שוב כמו קודם לכן.כדי לתייג תאים כדי לקבוע תאים חיים ומתים, התן מחדש אחד עד שלושה מיליון תאים במיליליטר אחד של DMEM המכיל 25 ציספלטין מיקרומולרי ודגירה למשך דקה אחת. הרווה על ידי צינור עם נפח שווה של FBS. לאחר צנטריפוגה ב 120 פעמים g במשך חמש דקות, decant את supernatant לתוך מקור המכיל אקונומיקה מדוללת, ולהפוך את הצינורות כדי לנקז את הפתרון הנותר על מגבת נייר.תן את גלולת התא בשני מיליליטר של PBS ללא יון בריום, וצנטריפוגה אותם שוב כפי שתואר קודם לכן. כדי לתקן את התאים, תן שימוש חוזר לכדור התא במיליליטר אחד של PBS ללא יון בריום. Vortex התאים תחת כוח נמוך מתמשך ולהוסיף מיליליטר אחד של שני x PFA קיבעון מאגר טיפה חכם.מניחים על פלטפורמת נדנדה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות decant את supernatant. לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS ללא יון בריום, צנטריפוגה שוב באותם תנאים, ולחזור על שלב הכביסה.לבסוף, תן שימוש חוזר את גלולה בשני מיליליטר של PBS ללא יון בריום. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות בזהירות decant את supernatant. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מאגר קיבוע x אחד, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות וחזור על הצנטריפוגה.כדי לשטוף את התאים, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר permeabilization ברקוד. במהלך צנטריפוגה התא ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, להכין ברקודים על ידי הוספת 100 microliters של מאגר permeabilization ברקוד להם, ומערבבים מיד. תן שימוש חוזר לכדור התא ב-800 מיקרוליטרים של מאגר חדירות ברקוד.מוסיפים תווי ברקוד לתאים, מערבבים ומטגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. לשטוף תאים בשני מיליליטר של חיץ כתמי תאים וצנטריפוגה שוב.לאחר מכן, תן שימוש חוזר של 1 עד 3 מיליון תאים במיליליטר אחד של חיץ כתמי אנטיגן גרעיניים עובד פתרון עבודה, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, בזהירות decant את supernatant. תן שוב את התאים במיליליטר אחד של חיץ זיכרון מחלחל מכתים אנטיגן גרעיני וצנטריפוגה שוב.לאחר שימוש חוזר וצנטריפוגה, יש לעכל מחדש את גלולת התא בנפח שיורית עם מערבולת עדינה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים תאיים, מערבבים ודולרים בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. הוסף שני מיליליטר של מאגר כתמי תאים.צנטריפוגה שוב באותם תנאים כמו בשלב הקודם, ולהסיר את supernatant. תן שוב את גלולה בשני מיליליטר של חיץ כתמי תא, צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות, ולחזור על resuspending וצנטריפוגה. יש להשתמש מחדש בתאים במיליליטר אחד של פתרון חישוב הדדי, ולאחסן במשך יום עד שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, לשטוף את גלולה עם שני מיליליטר של חיץ כתמים התא, צנטריפוגה באותם תנאים, ולבצע שתי שטיפות נוספות עם שני מיליליטר של מים, עם צנטריפוגה זהה. תן שוב את גלולת התא בריכוז של מיליון תאים למיליליטר עם פתרון חרוז EQ מדולל, ולאחר מכן להפעיל את הדגימות על ציטומטר המסה. תפוקות תאים צפויות וכדאיות מאוזן עכבר בוגרת ועור יילודים נקבעים.התשואה המשוערת תלויה בשטח הפנים של העור. עור יילודים הוא בחירה טובה יותר עבור ניסויים הדורשים מספר גדול יותר של תאים. מוצגת אסטרטגיית הגט הבסיסית לבחירת תאים שלמים, יחידים ובת קיימא, לאחר נורמליזציה ותיעוב של נתוני ציטומטריית מסה מקודדת.אחוז התאים בני קיימא עשוי להצביע על האיכות או המצב של התאים לפני הכתם. הבדלים בכדאיות בין תאי קרצינומה מתורבתים לעומת תאי אוזניים מבודדים של העכבר מוצגים גם כן. תאים בני קיימא היו מגודרים באורך אירוע לעומת CD45 כדי לא לכלול תאים hematopoietic.הכללת סמני שושלת מאפשרת בחירת אוכלוסיות תאים מעניינות בשלבים שונים של מחזור התאים. פרופיל מחזור התא הבסיסי מתקבל על ידי זיהוי של BrdU לעומת PI בציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטי. עם זאת, הכללה של סמני התפשטות אחרים עם ציטומטריה המונית, מאפשר זיהוי מדויק יותר של שלבי מחזור התא.בעקבות גישה זו, ניתן לבנות פרופילי מחזור תאים עבור סוגי תאים שונים או עבור תנאים ניסיוניים שונים, כגון הפרופילים עבור CD45 שלילי לעומת CD45 תאים חיוביים מאותו ניסוי. בדוגמה אחרת, ניתוח סמנים המגדירים את מסלולי האיתות של EGFR ו- mTOR PI3K בשלב G-One, חשף פרופילי ביטוי דומים בתאים שליליים CD45, המוצגים בתאים כתומים ו- CD45 חיוביים, המוצגים בכחול. ציטומטריה המונית דורשת הרבה תאים באיכות גבוהה.אם משתמש מעוניין באוכלוסיית תאים נדירה, ייתכן שיהיה צורך במספר גבוה יותר של תאים. תאים חיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח DNA או RNA, מחקרים ביוכימיים, או ניתן להשתמש בתרבות הרקמות לפני הקיבעון וכתמים עבור ציטומטריה המונית. המשתמש צריך להשתמש בציוד הגנה אישי ארון בטיחות בעת הצורך, בעת עבודה עם paraformaldehyde, חומצה הידרוכלורית, או נתרן הידרוקסיד.

isolation-staining-mouse-skin-keratinocytes-for-cell-cycle-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.

ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis

העור הוא ביתה של רשת תאי חיסון מורכבת. אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר, מחלקים שונים בגוף החיה, על מנת לקבל תרחיף חד-תאי ולנתח את אוכלוסיות הלויקוציטים השונות השוכנות בעור על ידי זרימה ציטומטרית.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

פרוטוקול זה מתאר עיכול אנזימטי של עור עכבר במדיום עשיר בחומרים מזינים ואחריו הפרדת שיפוע לבידוד לויקוציטים.  תאים הנגזרים כך יכולים לשמש ליישומים מגוונים במורד הזרם. זוהי אלטרנטיבה יעילה, חסכונית ומשופרת למכונות דיסוציאציה של רקמות ופרוטוקולי עיכול רקמות קשים יותר וטריפסין מבוססי דיספאז.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

מאמר זה מתאר את האיסוף והעיבוד של דגימות לניתוח ציטומטריית מסה.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

הרחבת ציפורן היא תכונה מרכזית של תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן. עם זאת, מחזור התא של תאי T מגיב אנטיגן נחקר בצורה גרועה, בין היתר בגלל מגבלות טכניות. אנו מתארים שיטה ציטומטרית זרימה לנתח באופן קלוני הרחבה תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן בטחול ובלוטות הלימפה של עכברים מחוסנים.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת DNA/Ki67 לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בעכברים מחוסנים

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

אנו מתארים פרוטוקולים להכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

למדו לבודד קרטינוציטים מעור עכבר ולצבוע אותם בנוגדנים מתויגי מתכות לניתוח ציטומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת פרופילינג מדויק של ביטוי חלבונים במחזור התא לחקר סרטן ומחלות אחרות.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

גלה סרטונים נוספים