Name: בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: למד הדרכה להפקת נגזרי סומיט מ-iPSCs אנושיים בתנאים כימיים מוגדרים. השיטה מאפשרת מידול מחלות שריר-שלד ופיתוח טיפולים תאיים חדשניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ד ר Junya Toguchida (CiRA) לעזרתו עם מינהלת הפרויקט, מימון הרכישה, מר. מיצואקי (CiRA) ו גב' מיי Terashima (CiRA) לסיוע טכני שלהם, טויוקה יאיואי ד ר (CiRA), ד ר Daisuke Kamiya (CiRA) עבור שלהם הגהה של כתב היד, מר Masaya Todani (CiRA) לספק המחשה (איור 1). ברצוננו להודות לכל חברי Ikeya ו- Toguchida המעבדות (CiRA) על תמיכתם במהלך מחקר זה. עבודה זו נתמך על ידי Grants-in-aid למחקר מדעי מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) (26670661), התוכנית עבור תאי iPS סורר מחלות מחקר ניצול מחלות ספציפיות של יפן המדע והטכנולוגיה סוכנות (JST), הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED), המרכז הליבה iPS מחקר תאי של רשת מרכז מחקר עבור מימוש של רפואה רגנרטיבית (JST/AMED), שב"ס קרן מחקרים תא (ל מקוטו Ikeya ו Junya Toguchida). מקוטו Ikeya נתמכה גם על ידי Grants-in-aid מחקר מדעי (JSPS) (16H 05447), את תוכנית ההאצה לחקר מחלות סורר ניצול תאי iPS מחלות ספציפיות (AMED).

<ol><li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+reproducible+myogenic+differentiation+from+human+iPS+cells%3A+prospects+for+modeling+Miyoshi+Myopathy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro.</a> PLoS One. 8 (4), e61540(2013).</li>
<li>Sakurai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+paraxial+mesodermal+progenitors+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), e47078(2012).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocl%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
<li>Umeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chondrogenic+paraxial+mesoderm%2C+directed+specification+and+prospective+isolation+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 2, 455(2012).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. 166 (2), 451-467 (2016).</li>
<li>Xi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Human+Somitogenesis+Guides+Somite+Development+from+hPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs.</a> Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).</li>
<li>Chal, J., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+muscle%3A+skeletal+myogenesis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro.</a> Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).</li>
<li>Tam, P. P., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+mesodermal+tissues+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 99 (1), 109-126 (1987).</li>
<li>Aulehla, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+gradients+during+paraxial+mesoderm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling gradients during paraxial mesoderm development.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869(2010).</li>
<li>Christ, B., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+differentiation+of+avian+somite+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation and differentiation of avian somite derivatives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).</li>
<li>Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somitic+compartment+of+tendon+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A somitic compartment of tendon progenitors.</a> Cell. 113 (2), 235-248 (2003).</li>
<li>Sakurai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+induction+toward+paraxial+mesodermal+derivatives+from+mouse+ES+cells+in+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium.</a> Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-directed+specification+of+sclerotome-like+chondroprogenitors+and+induction+of+a+somitic+chondrogenesis+program+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells.</a> Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+somite+development+and+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells.</a> Development. 145 (16), (2018).</li>
<li>McMahon, A. P., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt-1+%28int-1%29+proto-oncogene+is+required+for+development+of+a+large+region+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain.</a> Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((targeting+of+the+transcription+factor+Mohawk+in+rats+causes+heterotopic+ossification+of+Achilles+tendon+via+failed+tenogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).</li>
<li>Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanical+and+biochemical+properties+of+developing+embryonic+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).</li>
<li>Maretto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+during+mouse+development+and+in+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה ידועה אינדוקציה של נגזר PSC SM דרך PSM הוא השילוב של CHIR99021 + A83-01 (TGFβ מעכב) במהלך PSM אינדוקציה של PSC, אך לא את תהליך ההבשלה PSM6. במחקר הנוכחי, ונ ט/בטא-catenin איתות היה עכבות באמצעות C59 לזירוז SM מ PSM. עם זאת, הצגנו את השימוש CHIR99021 כדי להפעיל את השביל ונ ט במהלך בידול של SM. החלטה זו התקבלה בהתבסס על הממצאים כי מספר WNTs הם הביעו ברקמות שמסביב של SM, בהתחשב בעובדה כי ונ ט כתבים פעילים SM20. כתוצאה מכך, הבחנו epithelialization, מאפיין של SM ויוו, רק תחת התנאי עם CHIR99021, בהתבסס על ההצטברות של CDH11 ב צמתי תא-תא (2E איור). התבוננות זו מצביע על מעורבות ביקורתית של חגיגת איתות במהלך PSM בידול של SM epithelialization, לכן שפרוטוקול שלנו אולי כדאי לסכם הסביבה איתות אנדוגני. עם זאת, הוא גם מרמז על אפשרות נוספת של כוונון של חגיגת/הבטא-catenin איתות במהלך התמיינות, כי החוסן ואת היעילות של בידול עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם את סוגי תאים, שורות תאים שונים תרכובות כימיות של חגיגת-inducers בשימוש על ידי כל אחד.
שיטה זו גם מאפשרת לנו ליצור כל ארבע SM נגזרים MYO, D, SCL, SYN, מתוך iPSCs האנושית. את כל מנגנוני stepwise באמצעות CDM יכול לשמש כדי לזהות את הדרישות איתות במהלך האנושי somitogenesis/somite תכנים, ומספקים תובנות חשובות בהתפתחות SM. לדוגמה, השיטות שלנו יכול להיות שימושי עבור לימוד מנגנוני שעון פילוח, מערכת תנודה מולקולרית המווסת את היווצרות SM. זה ביסודיות נחקר עכברים, אפרוחים, דג זברה, אך לא בבני אדם בשל היעדר ניסוי כלים מתאימים.
יתר על כן, שיטת שלנו יכולה להיות ישימה לטיפולים עתידיות הקלינית מבוססת-תא. לדוגמה, האדם הנגזרות iPSC D או SYN יכול להיות מושתלים לתוך העור נפגע קשות או קרע גידים עבור התחדשות וטיפול. עם זאת, מספר מגבלות צריך להיפתר לפני שיטה זו יכול להיות מיושם באופן מעשי. למרות במחקר הנוכחי, השתמשנו באן מזין תאים עבור iPSC תחזוקה, פתרון ה-ECM, אשר מופק סרקומה העכבר Engelbreth-הולם-נחיל, כמו מעיל משטח על מדיח הכלים במהלך אינדוקציה, ריאגנטים מהחי אלה שאינם בני אדם צריכים להיות הסיר לשיפור איכות קליניים. בנוסף, תאים בכמות ובאיכות, הכוללת את הטוהר ואת ההבשלה של תאי הרצוי, חייב להיות גם שיפור. יתר על כן, לא רק את מספר התאים, אלא גם את הכוח תא הוא מאפיין חשוב עבור התחדשות גיד/רצועה. בנוסף, הפיתוח של סמני פני לטיהור ושל שיטה עבור תלת-ממד שיחזור הן תנאי הכרחי על מנת לקדם את כל מנגנוני טיפולים קליניים מבוססי תאים.

פיתוח שיטה התמיינות מכוונת לסוג התא הרצוי החל מגירסה היא צעד הכרחי לתרגום המחקר הנגזרות PSC תאים לתוך יישומים קליניים. ביטוי מאולץ של גנים מפתח אסטרטגיה מבטיח איברים תאית התמיינות החל מגירסה, השתפרה ההבנה שלנו של התקנון גנטי של גורל תא בנחישות, מורפוגנזה איברים, וארגון במהלך מופרה1. בנוסף, recapitulating את סביבות איתות אנדוגני, באמצעות הפיתוח של העוברים של עכבר חומוס כמו מפת דרכים, הוא נחשב חיוני הבידול בבימויו של מגירסה. בהתחשב היישום של תאים נגזר PSC במחקרים קליניים כגון טיפולים מבוססי תאים, האסטרטגיה השנייה זאת, מתאים יותר כי הוא אינו דורש מניפולציה ג'ין.
מספר מחקרים דיווחו על אינדוקציה של והמזודרם מן האדם, העכבר מגירסה כימית שהוגדרו בתנאי. בדרך כלל, שיטות אלה צריכים לסמוך על activin/קטרי/הפיכת איתות β (TGFβ) גורם גדילה ועצמות חלבון morphogenetic (BMP) איתות, האמין לבצע בידול meso-האנדודרם, והמזודרם, וכתוצאה מכך יעילות נמוכה אינדוקציה והמזודרם (כ-20%) paraxial2. במילים אחרות, והמזודרם, נגזר PSC המושרה על ידי איתות המסלולים האלה היה בעיקר לרוחב הלוח והמזודרם, לא paraxial והמזודרם. לאחרונה, מחקרים אחדים הדגימו ייצור יעיל של והמזודרם paraxial, נגזר PSC בהתבסס על אסטרטגיות שונות3,4,5,6,7,8 . במחקרים אלה, היו מגירסה תרבותי עם ריכוזים גבוהים יחסית של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3) מעכבי (ונ ט מפעילים איתות), כתוצאה מכך היעילות אינדוקציה של paraxial והמזודרם הגיעו 70%-95%6,7 .
ב somitogenesis, והמזודרם paraxial קודם טפסים posteriorly את והמזודרם presomitic (PSM) וטפסים ואז somites (SMs) בחלק הקדמי עד מזנכימה-כדי-אפיתל המעבר9,10. חריץ ליגנד כמו דלתא 1 (DLL1) ידוע יש תפקיד מרכזי במהלך somitogenesis, כמו שליטה מתנדנדות על הביטוי DLL1, הן ברמת mRNA, חלבון, מווסת את פילוח SM. SMs בסופו של דבר לסעף לתוך שני חלקים, והוליד dermomyotome (DM) dorsally, sclerotome (SCL) ventrally11. לאחר מכן, DM מבדילה לתוך פלסטיים (D), הקדמה של הדרמיס, וכן myotome (MYO), הקדמה של שריר השלד; בנוסף, בחלק הגחוני SCL יוצרת את syndetome (SYN), סימן מקדים של הגידים והרצועות12 (איור 1). יש חוקרים דיווחו על אינדוקציה של SM נגזר PSC נגזרים כגון MYO4,13 ו- SCL14; עם זאת, ישנן מספר מגבלות במחקרים אלה. ראוי לציין, מאחר הידע שלנו סביבות איתות של D ו- SYN מקוטעים, אינדוקציה פרוטוקולים עבור D ו- SYN לא עדיין באופן שיטתי הוקמו. להפגין המלא-סמכות של SMs המושרה החל מגירסה, זה חיוני כדי להראות את הבידול מרובי קיבולת SMs המושרה לתוך כל ארבע הנגזרים (D MYO, SCL, SYN), ואילו מחקרים קודמים התמקדו רק ספציפיים נגזרים SM. כאן, אנו מדווחים על איך ליצור כל נגזרים SM ארבע, לרבות D ו- SYN, באמצעות PSM ו- SM הגורל האנושי iPSCs15. אנו מאמינים כי הקמת שיטה stepwise במבחנה כי מודלים תהליך הפיתוח SM יכול לתרום המחקר של SM אנוש מפתחת במהלך מופרה, ללא שימוש עוברי.

<table><tbody><tr><td>נוגדן ALX4_Goat</td><td>Santacruz</td><td>sc-22066</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP7</td><td>מו"פ D</td><td>354-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>נקלאי טסק</td><td>067730-15</td><td></td></tr><tr><td>CDH11_Mouse נוגדנים</td><td>איתות תאים</td><td>13577</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר לכיבוי תאים</td><td>Strex</td><td>STB-140</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז שומנים מוגדר כימית</td><td>Gibco</td><td>11905-031</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן COL1A1_Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן COL2A1_Mouse</td><td>Thermo scientific</td><td>MS-235</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Thermofisher</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DLL1 APC-conjugated_Mouse נוגדן</td><td>R& D</td><td>FAB1818A</td><td>עבור FACS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>DMH1</td><td>Tocris</td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן EN1_Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab70993</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Nichirei</td><td>171012</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>יישומי תאים פיברובלסטים עוריים אנושיים</td><td></td><td>160-05a</td><td></td></tr><tr><td>טנוציטים אנושיים</td><td>אנגיו פרוטאומי</td><td>cAP-0041</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Wako</td><td>090-06474</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s שונה Dulbecco' s בינוני/חזיר' s F12</td><td>Gibco</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>נוקאאוט SR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Axon</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD bioscience</td><td>354230</td><td>מטריצה חוץ-תאית מלאכותית</td></tr><tr><td>MEOX1_Rabbit נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab75895</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן MHC_Rabbit</td><td>Santacruz</td><td>sc-20641</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן MKX_Rabbit</td><td>נוגדנים אטלס</td><td>A83377</td><td></td></tr><tr><td>מונותיוגליצרול</td><td>סיגמא</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell tech</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>תא גומי סיליקון רב סוג</td><td>היטב Strex STB-CH-4W</td><td></td> נוגדן MYOD_Rabbit <td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab133627</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן MYOG_Mouse</td><td>Santacruz</td><td>sc-12732</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן NKX3.2_Rabbit</td><td>Sigma</td><td>HPA027564</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני של חמור נובקס נגד עזים IgG(H+L)555</td><td>נוגדן משני Invitrogen</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>נובקס חמור נגד עזים IgG(H+L)647</td><td>נוגדן משני Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכבר IgG(H+L)555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>נובקס עז אנטי ארנב IgG (H + L) נוגדן משני555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>נובקס עז אנטי ארנב IgG (H + L) נוגדן משני647</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>PARAXIS_Rabbit נוגדן</td><td>Santacruz</td><td>sc-98796</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן PAX1_Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab95227</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן PAX9_Rabbit</td><td>Gene tex</td><td>GTX104454</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PDGFRa_Goat</td><td>מו"פ D</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תא ES פרימט</td><td>Reprocell</td><td>RCHEMD001</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Calbiochem</td><td>566661 SB431542</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Selleckchem</td><td>SEL-S1067-10</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן</td><td>SCX_Rabbit Abcam</td><td>ab58655</td><td></td></tr><tr><td>TBX6_Goat נוגדן</td><td>מו"פ D</td><td>AF4744</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי גיד</td><td>אנגיו-פרוטאומי</td><td>cAP-40</td><td>מדיום גידול טנוציטים</td></tr><tr><td>TGF ובטא; 3</td><td>מו"פ D</td><td>243-B3-200</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>ג'יבקו</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

בדור חוץ גופית של somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע pluripotent

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בתגובה אותות כגון WNTs, עצם morphogenetic חלבונים (BMPs) ו סוניק הקיפוד (ששש) מופרש מן הרקמות הסובבות, somites (SMs) להצמיח סוגי תאים מרובים, כולל את myotome (MYO), sclerotome (SCL), פלסטיים (D) ו syndetome (SYN) , אשר בתורו להתפתח שרירי השלד, axial שלד, הדרמיס הגבי ו צירית גיד/רצועה, בהתאמה. לכן, הדור של SMs ונגזרותיהם מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) הוא קריטי כדי לקבל גזע pluripotent (מגירסה) עבור יישום של רפואה רגנרטיבית, מחלות מחקר בתחום של כירורגיה אורתופדית. למרות שהפרוטוקולים אינדוקציה MYO, SCL החל מגירסה דווחו בעבר על ידי מספר חוקרים, אף מחקר עדיין הוכיחה את תנאי הגיוס של SYN D מ iPSCs. לכן, אינדוקציה יעיל של SMs המוסמכת באופן מלא נשאר אתגר גדול. כאן, אנו לסכם האנושי SM המתבנת עם iPSCs אנושיים במבחנה על ידי מחקה את הסביבה איתות במהלך חומוס/עכבר SM ופיתוח דוח על שיטות האינדוקציה שיטתית של נגזרות SM (MYO, SCL, D ו- SYN) מ- iPSCs האנושי תחת כימית תנאים מוגדרים באמצעות presomitic והמזודרם (PSM) ו- SM הברית. הידע לגבי בחורה/עכבר SM פיתוח הוחל בהצלחה על אינדוקציה של SMs עם iPSCs האנושית. שיטה זו יכולה להיות כלי הרומן לומד האדם somitogenesis תכנים ללא השימוש של העוברים טיפול מבוססת תא, מידול המחלה.

כל הדמויות בדו"ח זה התקבלו עם iPSCs 201B7-PAX3-GFP, שבו EGFP מחליף אלל אחד של רצף קידוד PAX3 ב אקסון 1. הקמת iPSCs 201B7-PAX3-GFP יהיה תיאר במקום אחר (ח' סקוראי, תקשורת אישית). מובהקות סטטיסטית הוערך באמצעות תוכנה סטטיסטית. P-ערכים נמוכים מ- 0.05 נחשבו משמעותית.
אפיון נגזר iPSC PSM ו- SM תאים אנושיים כדי להעריך את הבידול של iPSCs אנושית כלפי SM דרך המדינה PSM (איור 2 א), ניתוח FACS, בוצעו ניתוח ICC, וניתוח RT-qPCR. כפי שמוצג באיור 2B, מעל 85% של התאים היו חיוביות עבור DLL1, סמן של PSM, אבל שלילי עבור PAX3, סמן של SM, אחרי ארבעה ימים של PSM אינדוקציה עם iPSCs האנושית. לאחר מכן, אוכלוסייה זו הפכה PAX3 תאים SM חיובי לאחר 4 ימים האינדוקציה SM. המעבר PSM-SM אושר גם ע י ICC (איור 2C) ו- RT-qPCR (איור דו-ממדי). סמני PSM TBX6, MSGN1 ו- WNT3A, היו באים לביטוי עם המדינה PSM (יום ד'), אך אינו מתבטא באיזה מצב SM (יום 8). PARAXIS, MEOX1, PAX3, סמני SM, באה לידי ביטוי ב- SM, אך אינו מתבטא ב- PSM. יתר על כן, כתמים של CDH11, סמן של epithelialized SM, רק שהצטברו באזור צומת תאים תאים, בעקבות התוספת של SB431542 עם CHIR99021 (2E איור).
אפיון SM נגזרים המושרה מתאי האדם הנגזרות iPSC SM כדי להעריך את העוצמה בידול של SM נגזר iPSC אנושי, בידול כלפי DM, MYO, D, SCL, סינטטיים (איור 3 א) הוערך על ידי ניתוח ICC ו PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית. כפי שמוצג באיור 3B, מיט בידול אושר ע י ALX4 ו- EN1 מכתים, ו- PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית; MYO בידול אושר ע י אלוהים, MYOG ו צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MHC) מכתימה; בידול D אושר ע י EN1 ו- PDGFRa מכתימה; בידול SCL אושר ע י PAX1, PAX9 ו- NKX3.2 מכתימה; בידול SYN אושרה על ידי SCX, MKX, COL1A1, COL1A2 מכתים.
אפיון המושרה D ו- SYN 1. אנזים-מקושרים immunosorbent assay (אליסה) עבור אנליזה פונקציונלית של נגזר iPSC D בגוף האדם, אחת הפונקציות העיקריות של עורי fibroblasts היא להפריש חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM), כגון קולגן או חומצה היאלורונית העור מימה, לעזור לשמר את מרקם העור. כדי להדגים כי כמות דומה של קולגן מסוג 1 ו חומצה היאלורונית חלבונים היו מופרש במדיום תרבות של נגזר iPSC D ו HDF, בוצעה אליסה, כפי שמוצג באיור 4A.
2. מכונות למתוח גירוי assay לניתוח פונקציונלי של נגזר iPSC SYN כפי שכבר דיווחו על מספר מחקרים, גירוי מכני משפיעה על התפתחות גיד לפני ואחרי לידה, ומקדם את הבידול של tenocytes קודמן תאים18,19. לכן, זה ידוע כי תגובתיות ללחץ מכני הוא אחד המאפיינים של tenocytes. כדי להדגים את תגובתיות דומות של SYN נגזר iPSC אנושי ולא אנושי tenocytes למבוגרים, וזמינותו גירוי מכני מתיחה בוצעה כפי שמוצג באיור 4B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59359/59359fig1.jpg"> איור 1: הצג סכימתי של הבידול הירארכי של paraxial והמזודרם. והמזודרם presomitic היא אוכלוסיה תא transiently מתגלה במהלך המוקדמות מופרה, עובר פילוח על טופס somites. Somites הם אוכלוסיית תאי גזע ארעי הולידה סוגי תאים מרובים, כגון תאים sclerotome ', ' dermomyotome ', ' syndetome ', פלסטיים, myotome, אשר בסופו של דבר להבדיל לתוך הגיד/רצועה, עצם/סחוס, שרירי השלד, הדרמיס תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59359/59359fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59359/59359fig2.jpg"> איור 2: ניתוח FACS, RT-qPCR ו- ICC של האדם נגזר iPSC PSM, SM. (א) הצג סכימתי של פרוטוקול עבור SM בידול באמצעות PSM. (B) נקודה נציג חלקת מכתים DLL1 ו- PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית ביום 4 האינדוקציה PSM וביום 4 (יום 8 מ iPSC) SM האינדוקציה. תמונות נציג immunocytochemical (ג) ו- PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית ביום 4 האינדוקציה PSM וביום 4 (יום 8 מ iPSC) SM האינדוקציה. התאים היו מוכתמים anti-TBX6, PARAXIS ו- MEOX1 נוגדנים (אדום) ו מוכתם שיתוף דאפי (כחול) או מזוהה עם PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית (ירוק). (ד) ניתוח RT-qPCR של סמנים עבור PSM ו- SM iPSC, PSM ו- SM. האמצעים ± השגיאה הסטנדרטית (S.E.) של שלושה סטים של ניסויים מוצגים. (E) נציג immunocytochemical תמונות ביום 4 (יום 8 מ iPSC) SM, תרבותי ב- S10I10 (שילוב של SB431542 ו- IWR1, מעכב של חגיגת איתות), S10 (SB431542), ו- S10C5 (שילוב של SB431542 ו- CHIR99021) תנאים. התאים היו מוכתמים נוגדן anti-CDH11 (אדום), מוכתם שיתוף דאפי (כחול). iPS, תאי גזע pluripotent המושרה; PSM, והמזודרם presomitic; SM, somite; S10, SB431542 10 ΜM; C5, CHIR99021 5 ΜM; I10, IWR1 10 ΜM; גודל ברים = 50 μm. איור זה השתנה בין נקאג'ימה et al. (2018)15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59359/59359fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59359/59359fig3.jpg"> איור 3: ניתוח ICC של מיט, MYO, D, SCL SYN תריז האדם הנגזרות iPSC SM. (א) הצג סכימתי של פרוטוקולים עבור SM נגזרים בידול. PAX3 (GFP) ותמונות של נציג immunocytochemical (B)-קרינה פלואורסצנטית יום 3 (יום 11 מ iPSC) האינדוקציה DM, ביום 30 (יום 41 מ iPSC) האינדוקציה MYO, יום 9 (יום 20 מ iPSC) האינדוקציה D, יום 3 (יום 11 מ iPSC) האינדוקציה SCL, וביום 21 (יום 32 מ iPSC) האינדוקציה SYN. מיט, התאים היו מוכתמים anti-ALX4 ו- EN1 נוגדנים (אדום) ו מוכתם שיתוף דאפי (כחול) או זוהה עם PAX3 (GFP)-קרינה פלואורסצנטית (ירוק); MYO, התאים היו מוכתמים אנטי-אלוהים, MYOG (אדום) ו- MHC (ציאן) נוגדנים, גם שיתוף מוכתם דאפי (כחול); D, התאים היו מוכתמים אנטי-EN1 (אדום) ו- PDGFRa (ציאן) נוגדנים, מוכתם שיתוף דאפי (כחול); SCL, התאים היו מוכתמים anti-PAX1, PAX9 ו- NKX3.2 (אדום) נוגדנים, מוכתם שיתוף דאפי (כחול); SYN, התאים היו מוכתמים אנטי-SCX, MKX, COL1A1 ו- COL1A2 (אדום) נוגדנים, מוכתם שיתוף דאפי (כחול). מיט, dermomyotome; MYO, myotome; D, פלסטיים; SCL, sclerotome; SYN, syndetome; גודל ברים = 50 μm. איור זה השתנה בין נקאג'ימה et al. (2018)15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59359/59359fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59359/59359fig4.jpg"> איור 4: assay פונקציונלי של המושרה D ו- SYN. (א) כמות 1 קולגן מסוג חומצה היאלורונית חלבונים במדיום תרבות נותחו על ידי אליסה. (B) ההשפעה של מתיחה מכנית גירוי SYN המושרה ואת האדם tenocytes למבוגרים הוערכה על ידי RT-qPCR. האמצעים ± השגיאה הסטנדרטית (S.E.) של שלושה סטים של ניסויים מוצגים. * p &lt; 0.05; * * p &lt; 0.01; p &lt; 0.001 מאת של Dunnett מספר השוואות מבחן t לעומת מתיחה (-); n.s, לא משמעותי, HDF,. פיברובלסט עורי למבוגרים אנושי. איור זה השתנה בין נקאג'ימה et al. (2018)15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59359/59359fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בינוני/פתרון</td>
			<td>Reagant</td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>של Iscove שונה F12 בינוני/ירך חזיר של Dulbecco</td>
			<td>1:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>מבחינה כימית שהוגדרו השומנים להתרכז</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apo-transferrin</td>
			<td>15 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monothioglycerol</td>
			<td>450 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלבומין שור</td>
			<td>5 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>אינסולין</td>
			<td>7 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">פתרון CTK</td>
			<td>מים</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריפסין</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase הרביעי</td>
			<td>0.1 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>סידן כלורי</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוקאאוט SR</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">D אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMP4</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">מיט אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMP4</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">פתרון ה-ECM</td>
			<td>מטריצה חוץ-תאית מלאכותי</td>
			<td>0.3 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">מאגר FACS</td>
			<td>PBS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלבומין שור</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">תא מזין ללא תרבות בינוני</td>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HDF תרבות בינוני</td>
			<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>סרום שור עוברית</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">hESC בינוני</td>
			<td>פרימטים ES תא בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF2</td>
			<td>4 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">MYO אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">PSM אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB431542</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMH1</td>
			<td>2 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF2</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">SCL אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>סאג</td>
			<td>100 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDN193189</td>
			<td>מיקרומטר 0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">SM אינדוקציה בינוני</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB431542</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">SYN אינדוקציה בינוני-1...</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF8</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">SYN אינדוקציה בינוני-2...</td>
			<td>CDM הבזליים בינוני</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMP7</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TGFΒ3</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תקשורת, פתרון מתכונים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>הפוך</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB</td>
			<td>CACCATTGGCAATGAGCGGTTC</td>
			<td>AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>COL1A1</td>
			<td>GGACACAGAGGTTTCAGTGGT</td>
			<td>GCACCATCATTTCCACGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEOX1</td>
			<td>GAGATTGCGGTAAACCTGGA</td>
			<td>GAACTTGGAGAGGCTGTGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSGN1</td>
			<td>GGAGAAGCTCAGGATGAGGA</td>
			<td>GTCTGTGAGTTCCCCGATGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PARAXIS</td>
			<td>TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT</td>
			<td>CACACCCTGTCACCAACAGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PAX3</td>
			<td>AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG</td>
			<td>CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCX</td>
			<td>CCCAAACAGATCTGCACCTTC</td>
			<td>GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>TBX6</td>
			<td>AGCCTGTGTCTTTCCATCGT</td>
			<td>AGGCTGTCACGGAGATGAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>TNMD</td>
			<td>CCCTTCATGCTGAAGCCACTT</td>
			<td>CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>WNT3A</td>
			<td>CAAGATTGGCATCCAGGAGT</td>
			<td>ATGAGCGTGTCACTGCAAAG</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פריימר רצפים לניתוח RT-qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="17">1 נוגדן</td>
			<td>ALX4_Goat</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH11_Mouse</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>COL1A1_Rabbit</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
<tr>
<td>COL2A1_Mouse</td>
			<td>1-2 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EN1_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEOX1_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC_Rabbit</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
<tr>
<td>MKX_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>MYOD_Rabbit</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>MYOG_Mouse</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
<tr>
<td>NKX3.2_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>PARAXIS_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>PAX1_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>PAX9_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>PDGFRa_Goat</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCX_Rabbit</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td>TBX6_Goat</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">2 נוגדן</td>
			<td>החמור אנטי antibody555 משני IgG(H+L) עז</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>החמור אנטי antibody647 משני IgG(H+L) עז</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>עז אנטי IgG(H+L) העכבר המשני antibody555</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>עז אנטי antibody555 המשנית IgG(H+L) ארנב</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>עז אנטי antibody647 המשנית IgG(H+L) ארנב</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: ראשון ושני נוגדנים עבור ICC.

אנו מציגים כאן עבור הבידול בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי לתוך כל נגזרת somite (myotome, sclerotome, פלסטיים ו syndetome) פרוטוקול בתנאים מוגדרים כימי, אשר יש יישומים בדוגמנות מחלות בעתיד, טיפולים מבוססי תא לכירורגיה אורטופדית.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

אינדוקציה של נגזרות somite של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה, או iPSC, הוא צעד קריטי לשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים לטיפול רגנרטיבי או יישומי מחקר מחלות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להבדיל תאי iPS אנושיים לתוך נגזרות somite כגון מיוטום, דרמטום, sclerotome, ותאי סינדום בתנאים מוגדרים כימית. באמצעות iPSC הוקמה על ידי חולה הסובל מהפרעת שרירים שלד עקשן, שיטה זו יכולה לשמש עבור מידול פנוטיפ של המחלה לבדיקת טיפולים תרופתיים חדשים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לקדם את ההבנה שלנו של הביולוגיה ואת המנגנונים שבבסיס ההתפתחות של mesoderm paraxial במהלך העובר האנושי. ארבעה ימים לפני תחילת אינדוקציה מזודירית טרום-מינית, מצפים מנה של 10 ס"מ עם ארבעה מיליליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית עבור דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החלף את פתרון המטריצה החוץ-תאית בשמונה מיליליטר של מדיום תרבות תאים נטול מאכילים.כדי להתחיל culturing ללא מאכיל, לשטוף את תרבות iPSC האנושית עם PBS, ולהוסיף מיליליטר אחד של פתרון CTK לצלחת התרבות. כאשר התאים מתחילים להתנתק מהתחתית של המנה, לשטוף את התרבות פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר באופן מלא את כל התאים מאכיל SNL לפני הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבות תאים ללא מאכילים לצלחת. השתמש מגרד תאים כדי לנתק באופן ידני את תאי הגזע, ולהעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר.בעדינות pipette פתרון התא שלוש פעמים עם קצה פיפי 1,000 מיקרוליטר, ולהעביר את התאים לצלחת תרבות מצופה מטריצה חוץ תאית. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים. בסוף האינקובציה, החלף את מדיום תרבות התאים נטולת המאכילים בשמונה מיליליטר של מדיום אינדוקציה טרום-ימית של מסודרם, ויזום בידול מסודרם פרה-סמיטי בחמימת תרבות התאים במשך ארבעת הימים הבאים, וחליף את המדיום ביום השלישי.בסוף הדגירה, לבודד את החלבון דמוי דלתא 1 תאים חיוביים על ידי ציטומטריה זרימה, ולאסוף את התאים ממוינים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה במיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה mesoderm סומיטי לספירה, וזרע פעם אחת 10 לתאים החמישיים לתוך כל באר של צלחת מטריצה חוץ תאית מצופה 12 באר המכיל מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה mesoderm סומיטי בתוספת 10 micromolar של קינאז rho, או רוק, מעכב Y-27632. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך ארבעה ימים נוספים, שינוי המדיום לא מכיל את המעכב בימים אחד ושלושה של תרבות.עבור בידול סינדטום מתאי sclerotome, לשטוף את התאים sclerotome עם PBS לפני ניתוק התאים עם 0.2 מיליליטר של ניתוק התא reagent ל הבאר. לאחר שלוש דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים 0.8 מיליליטר של מדיום בסיס מוגדר כימית לכל באר, ומנתקים את התאים עם מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר לצנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של סינדום אינדוקציה בינוני אחד לספירה.זרעים חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים לתוך כל באר של צלחת מטריצה חוץ תאית מצופה 24 באר המכיל מיליליטר אחד של אינדוקציה סינדום בינוני אחד, ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים. ביום השלישי של אינדוקציה סינדום, להחליף את המדיום עם אינדוקציה סינדום בינוני שני, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 18 ימים, שינוי המדיום כל שלושה ימים. לאחר בידול מסודרם טרום-סמיטי, מעל 85% מהתאים חיוביים לחלבון דמוי דלתא 1, סמן של מסודרם טרום-סמיטי, אך שלילי עבור PAX3, סמן של מסודרם סומטי.אוכלוסייה זו הופכת PAX3 חיובית תאים mesoderm לאחר ארבעה ימים של אינדוקציה mesoderm somitic. יתר על כן, כתמים של cadherin-11, סמן של mesoderm somitic epithelized, מצטבר רק בצמתים התא לתא, בעקבות התוספת של CHIR99021. ההתמדה כלפי דרמומיוטום, מיוטום, דרמטום, סקלרוטום וסינדטום יכולה להיות מוערכת על ידי אימונוציטוכימיה ו פלואורסצנטיות PAX3.בדומה לפיברובלסטים עוריים אנושיים, תאי דרמטום שמקורם ב- iPSC מייצרים קולגן וחומצה היאלורונית כפי שהוערכו על ידי ELISA. כדי להדגים את תגובתיות דומה של סינדום אנושי שמקורו iPSC ו tenocytes מבוגרים אנושיים, גירוי מתיחה מכני ניתן לבצע. לפני מעבר IPSC, לאשר כי הקונפדרציה התרבותית היא בין 70 ל 80%ואת התאים המפוצלים ביחס של אחד עד שניים עד ארבעה בהתאם.פסיעה זו היא קריטית עבור התברות iPSCs מוצלחת. עבור טיפולים עתידיים מבוססי תאים בשיטה זו, יש צורך להקים מצב חדש ללא חיידקים שאינו כולל רכיבים הנגזרים מבעלי חיים שאינם בני אדם.

in-vitro-generation-somite-derivatives-from-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים נטולי הזנה באמצעות שילוב של וקטורים של וירוס מטריג'ל וסנדאי המכילים גורמי תכנות מחדש.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.

יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי

למד הדרכה להפקת נגזרי סומיט מ-iPSCs אנושיים בתנאים כימיים מוגדרים. השיטה מאפשרת מידול מחלות שריר-שלד ופיתוח טיפולים תאיים חדשניים.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

גלה סרטונים נוספים