מדריך לבניית מאוד נוטה נסחף מיקרוסקופ אריח עבור הדמיה מולקולה בודדת שדה-of-view מורחבת
8 באפריל 2019
הוראה מפורטת מתואר כיצד לבנות מאוד נוטה נסחף מיקרוסקופ אריח (HIST) ואת השימוש עבור הדמיה מולקולה בודדת.
השיטה שלנו מאפשרת לנו לדמיין מולקולות בודדות עם שטח תמונה גדול פי 40 משיטות קונבנציונליות, ויש לה אות רקע מופחת מאוד. שלא כמו טכניקות אחרות הגישה שלנו משתמשת בעדשה אובייקטיבית אחת, אינה דורשת תא מדגם מיוחד, והיא תואמת בקלות למערכות מיקרוסקופ מסחריות. לאחר איסוף הרכיבים הדרושים להתחיל לבנות את המערכת.
כאן, כמה אלמנטים כבר נמצאים בעמדה על הספסל. רכוב על בלוק אלומיניום הוא גוף מיקרוסקופ עם שלב פייזו ומחזיק מדגם. כמו כן על הספסל שלושה לייזרים ואלמנטים אופטיים כדי לשלב את הקורות.
הקורות המשולבות משולבות לסיבים במצב יחיד ביעילות רבה ככל האפשר. כצעד ראשוני אחרון, להרכיב מקור אור איסוף במערכת כלוב. זהו מקור אור קוהרנטי זמני המחובר לסיבים במצב יחיד, מתאם סיבים, עדשה אקהרומטית וקשת.
התחל לעבוד עם נתיב הזיהוי. ראשית, מניחים את מקור האור האיסוף בנמל האובייקטיבי של גוף המיקרוסקופ. התאימו את המראה מתחת למטרות כך שקרן הפלט אופקית בערך ומיושרת עם חורי הספסל.
הכנס מראה דיכרוית לנתיב הקרן ושקף את הקרן ב-90 מעלות. הוסף מראות כדי לאפשר התאמה של נתיב הקרן המשודרת למצלמת sCMOS. השתמש במראות כדי להבטיח שהקרן תפגע במרכז השבב.
לאחר מכן, הכנס עדשת צינור באורך מוקד של 300 מיליליטר בערך אורך מוקד מהמצלמה. הסר את מקור האור האיסוף מגוף המיקרוסקופ. לאחר מכן התאימו את מיקום עדשת הצינור כדי להגדיר את מישור המוקד שלה.
הפסק את ההתאמות כאשר המצלמה פותרת בבירור את התבנית בתקרה. נתיב הזיהוי מתואר בשרטוט זה. שים לב לתוספת של מסנן מעבר מרובה פסים לפני עדשת הצינור להדמיית פלואורסצנטיות צבעונית.
חזור לגוף המיקרוסקופ. שם, התקן מחדש את מקור האור האיסוף במחזיק המטרה. לאחר המראה הדיכרונית, מניחים מראה מתקפלת בנתיב הקרן המוחזרת כדי לנתב אותה מחדש ב-90 מעלות.
מוציאים את מקור האור האיסוף מגוף המיקרוסקופ וממקמים אותו בקרבת מקום. לאחר מכן, הכנס עדשת אורך מוקד של 400 מילימטר בערך באורך מוקד מהמראה. בגוף המיקרוסקופ להתקין את העדשה האובייקטיבית.
לאחר מכן התאימו את מיקום המראה לאורך הציר האופטי. שימו לב לתקרה שמעל המטרה ועצרו כאשר נוצר שם תבנית דיסק אווריוריר מושלמת. כעת הסר את המטרה והתקין מחדש את מקור האור האיסוף באמצעות קשתית פתוחה.
קבע היכן לאורך נתיב הקרן הקרן היא הקטנה ביותר במרחק של כ-400 מילימטרים מהמראה. ברגע שהנקודה מזוהה, הר מראה שם, מישור תמונה נדיד. מצב ההגדרה בשלב זה מופיע בשרטוט זה.
המראה שנוספה זה עכשיו מסומנת M5. הכנס מראה נוספת כדי לשקף את הקרן 90 מעלות ולהעלות עדשה באורך מוקד 150 מ"מ מעבר לה. העדשה צריכה להיות 150 מילימטרים ממישור התמונה ההפוך. לאחר מכן, קח באופן זמני את העדשה הראשונה בנתיב קרן העירור.
עם תצורה זו למצוא את מיקום המוקד של העדשה השנייה. מניחים מראה גלבו ציר יחיד בנקודת מוקד זו כמישור מוקד אחורי נדוש. לספק אפס וולט למראה גלבו ולסובב את המחזיק שלה כך שהוא משקף את הקרן 90 מעלות.
לאחר מכן לאורך נתיב הקרן, מניחים מראה מתקפלת המשקפת את הקרן ב-90 מעלות. מניחים את העדשה 100 מילימטרים לאורך נתיב הקרן ממישור המוקד האחורי ההצטלב. שוב, הסר את מקור האור האיסוף מהר המיקרוסקופ.
הוסיפו עדשת קולימיזציה נוספת של 100 מ"מ עם מתאם סיבים וסיבים במצב יחיד יחד עם קשתית. לאחר מכן השתמשו בכלי הקשתית, הסיבים והעדשה כדי לשלוח קרן איסוף דרך מערכת ההדמיה. לאחר מכן, הכנס עדשה גלילית של אורך מוקד 400 מילימטרים ממש לפני עדשת האיסוף האחרונה בנתיב הקרן.
השתמש בו כדי למקד את הקרן. הכנס עדשה גלילית 50 מ"מ 450 מילימטרים לפני הראשון. זהו ייצוג סכמטי של ההתקנה הסופית עם נתיבי הזיהוי וההתרנות.
הפלט של שלושת הלייזרים מקובץ לנתיב על ידי סיבים במצב יחיד. לבדיקה הכינו דגימת הידרוג'ל תלת מימדית. זה מורכב חרוזי ארגמן 20 ננומטר מעורבב עם הידרוג'ל.
במערך מניחים את דגימת ההידרוגל במחזיק הדגימה. לזרזות מדגם להפעיל את לייזר 638 ננומטר ולהתאים את כוחו פחות ממילי וואט אחד. הגדר את תוכנת בקרת המצלמה במצב גורם מפעיל פנימי וללכוד וידאו.
בשלב זה מנוע גלבו יש אפס וולט להחיל. מקם את המצלמה כך שהתמונה נמצאת במרכז העדשה. לאחר מכן, התאימו את המראה שהיא מישור התמונה ההצוי.
סובב את הידית האופקית על המראה כדי להשיג תאורה נוטה מאוד. הקלט את תמונת האריח כמו בתדמית הפלואורסצנטיות לדוגמה של הידרוג'ל תלת-מימדי עם 20 ננומטר חרוזים. סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר.
המשך לאחר הגדרת חומרה ותוכנה כדי לטאטא את המראה galvo. זוהי תוכנת הסריקה של מראה גלבו עבור ההתקנה. סדר הדמיית שדה תצוגה מלאה על-ידי הגדרת Vmin למינוס 500 מילי-וולט.
ואז להגדיר Vmax ל 500 מיליבולטים. לאחר מכן, עבור לתוכנה לרכישת המצלמה. במצב גורם מפעיל, בחר חיצוני.
תחת התפריט הנפתח LightScan PLUS בחר הבא למטה, לחץ על פקד מהירות סריקה. כעת ניתן להגדיר פרמטרי בקרה מסוימים. תחת גובה חלון הזן 180 שורות.
תחת חשיפה הזן 28 אלפיות שנייה. לאחר שתסיים, חזור לתוכנה לבקרת מראה. במתג תוכנת בקרת השיקוף בערימות תלת-מימדיות ב- On. ציין את מספר הערימות ואת גודל השלב.
לחץ על לצלם וידאו כדי להתחיל להקליט תמונות. זוהי דוגמה של אפידמיה של דנ"א מסומן חד-גדילי. לעומת זאת, טכניקת הארי אריחים סחף נוטה מאוד הפיק את התמונה הזאת.
תמונת HIST מציגה פחות רקע בהשוואה לתמונה Epi. הדנ"א נמצא בהידרוגל תלת מימדי, ואורך הגל של העירור הוא 638 ננומטר. הנה תמונת אפי של גורם התארכות תרגום איקריוטי שכותרתו 2.
תמונת HIST שיפרה את יחס האות לרקע. יש לו גם תאורה אחידה יותר. לשניהם יש את אותו כוח תאורה של 7.5 מילי וואט.
מהירויות ההדמיה היו שתיהן 2.5 פריימים לשנייה. חשוב לשמור כל הזמן על זווית שיפוע גבוהה, ולסנכרן את המראה הגורפת עם קריאת המצלמה. פעולה זו מבטיחה יחס אות-לרקע גבוה במהלך רכישת תמונה.
אנו צופים כי מיקרוסקופ HIST ייהנה ממספר יישומים, כולל הדמיה ברזולוציית-על בעומקי הדמיה עמוקים יותר ופרופיל ביטוי גנים בתפוקה גבוהה בפרוסות רקמה עבות.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הבנייה והיישום של מיקרוסקופ בעל אריח מוטה בשיפוע גבוה (HIST) לצילום של מולקולה בודדת. השיטה משפרת את יכולות ההדמיה באמצעות שטח תמונה גדול יותר והפחתה של רעשי רקע בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוסקופיה
- דימוי של מולקולה בודדת
- הנדסה אופטית
רקע
- מיקרוסקופ ה-HIST משתמש בעדשת אובייקטיב אחת.
- הוא תואם למערכות מיקרוסקופ מסחריות.
- המערכת משפרת משמעותית את שטח הדימוי ומפחיתה אותות רקע.
- שיטות קונבנציונליות דורשות לעיתים קרובות מערכים מורכבים ותאי תגובה מיוחדים.
מטרת המחקר
- מתן מדריך מפורט להרכבת מיקרוסקופ ה-HIST.
- הדגמת יעילותו בדימוי של מולקולה בודדת.
- הדגשת היתרונות שלו על פני טכניקות דימוי מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של רכיבים אופטיים, כולל לייזרים ועדשות.
- כיוונון של מראות ועדשות ליישור אופטימלי של הקרן.
- שימוש במראת גלוו (galvo mirror) לסריקה וללכידת תמונות.
- בדיקה באמצעות דגימת הידרוג'ל בתלת-ממד המכילה חרוזי פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופ ה-HIST השיג שטח תמונה הגדול פי 40.
- הפגין רעש רקע מופחת בדימות.
- לכד בהצלחה תמונות באיכות גבוהה של מולקולות בודדות.
- סיפק השוואה ברורה מול טכניקות דימות קונבנציונליות.
מסקנות
- מיקרוסקופ ה-HIST הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים בתחום הדימוי של מולקולה בודדת.
- עיצובו מפשט את תהליך ההקמה תוך שיפור יכולות הדימוי.
- ניתן לשלב את השיטה בקלות במערכות מיקרוסקופיה קיימות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית אריחים סרוקים בשיפוע גבוה (HIST) פותרת צוואר בקבוק קריטי בדימות של מולקולה בודדת: השגת שדה ראייה רחב עם יחס אות לרקע גבוה בדגימות ביולוגיות עבות. על ידי מתן אפשרות לאזור דימות הגדול פי 40 והארה אחידה ללא צורך בתאי דגימה מיוחדים, HIST תומכת בתיקוף מטרות ברמת קנה מידה רחב ובצמצום סיכונים מכניסטיים בביולוגיה של גילוי. התאימות שלה למערכות מסחריות מורידה את חסמי האימוץ עבור מחלקות מו"פ בארגונים השואפות לביטחון חיזוי במעורבות של מטרות מולקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקה של מולקולה בודדת בסביבות תלת-ממדיות דמויות טבע (native-like).
- ערך תפעולי: מפחית רעשי רקע, ובכך משפר את רמת הביטחון בקריאות של מעורבות המטרה (target engagement) ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- ערך חזוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של המטרה באמצעות דימות כמותי בניגודיות גבוהה של אינטראקציות מולקולריות במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מספק קריאות פלואורסצנציה סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות במודלים של תאים עבים או מודלים דמויי רקמה.
- ערך תפעולי: תואם למצלמות sCMOS ולסריקה מבוססת galvo, מה שמאפשר מוכנות לסריקה בשטח רחב (high-throughput screening).
- יכולת הרחבה: שדה ראייה רחב מאפשר ניתוח של מספר מטרות (multiplexed) בכל תמונה, ובכך מגדיל את יעילות הבדיקה ואת צפיפות הנתונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לשלב הפרה-קלני על ידי אפשור ניטור עקבי של מולקולה בודדת לאורך קנה מידה שונה, מתאים ועד לפרוסות רקמה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: הארה אחידה ורקע מופחת משפרים את המהימנות של יישור סממנים ביולוגיים ומחקרי מודולציה של מטרות.
- קידום מותאם סיכונים: יחס אות-לרקע גבוה תומך בהחלטות המשך/עצירה (go/no-go) המבוססות על פנוטיפיקה מולקולרית חסונה במודלים מורכבים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מיקרוסקופיית HIST משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשוניות לגבי מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד כאשר תוצאות כמותיות של מולקולה בודדת תורמות להבנה מכניסטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה ישירה של התנהגות מולקולה בודדת בתוך הידרוג'לים בתלת-ממד או בסימולציות של רקמות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות הודות לתאורה אחידה, שדה ראייה רחב ותאימות לסריקת galvo אוטומטית והפעלה של מצלמה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (למשל, צפיפות מולקולות, קולוקליזציה, קינטיקה של קישור) החיוניות להשוואה בין תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקלה על הרצף משלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי שמירה על ביצועי דימות עקביים לאורך עוביים שונים של דגימות.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכננה כפלטפורמה מודולרית וסתגלנית לשימוש חוזר בפרויקטים שונים, ובכך מפחיתה מאמצים מיותרים בהקמת מערכות אופטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית וזיהוי מולקולות בודדות בניגודיות גבוהה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות סריקת גלוונומטר (galvo) מסונכרנת ודחיית רקע באמצעות חריץ קונפוקאלי.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הונית והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הפחתת סיכונים של היפותזות לגבי המטרה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים המבוסס על נתוני דימות מולקולרי כמותיים ואמינים ממערכות ביולוגיות מורכבות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות ביישור אופטי, בטיחות בלייזר ובמערכות בקרה של מראות גלוו (galvo).
- נדרש שולחן יציב עם בידוד רעידות, במות העברה מדויקות וחומרה מסונכרנת לרכישת נתונים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הספק העירור, פרמטרי הסריקה והגדרות המצלמה לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- שיקולי התאמה כוללים התאמה של מקדם השבירה של הדגימה ובחירת עדשה גלילית עבור אורכי גל שונים של עירור.
- מגבלה מעשית: הביצועים תלויים בשמירה על סנכרון מדויק בין סריקת הגלוו לקריאת המצלמה כדי לשמור על חיתוך אופטי (optical sectioning).
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Preliminary Setup
1:11
Setting up the Detection Path
2:14
Setting up the Excitation Path and the Cylindrical Lenses
4:59
Testing Tile Imaging
5:53
Highly Inclined Swept Tile (HIST) Imaging
6:52
Results: Highly Inclined Swept Tile Microscopy of Labeled DNA and RNA
7:38
Conclusion
