תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה
June 1st, 2019
אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.
המעבדה שלי מתעניינת במכנוביולוגיה, הבוחנת כיצד תאים מופעלים ומושפעים על ידי כוחות מכניים. דרך אחת לכמת מכנוביולוגיה היא מדידת התכווצות התאים. בתאים חסידיים, התכווצות מתבטאת בכוחות המתיחה המופעלים על מצע התא. אנו מכמתים כוחות אלה באמצעות מתודולוגיה המכונה בדרך כלל מיקרוסקופ כוח המתיחה או TFM. ו TFM מיושם במגוון רחב של שיטות שונות, אבל היבט נפוץ הוא שזה טכניקת מעבדה סדרתית ואיטית למדי נעשה בדרך כלל בצלחת אחת כמו זו כאן. זה מגביל אותנו להערכת אוכלוסייה או מצב אחד בכל פעם. לאורך כל תרבות התאים שופרה לפני זמן מה אבל יצירת מנות multiwell וחשבנו, זה לא יהיה נהדר זה יכול להיות TFM עם תפוקה מוגברת זהה ואת אותה יעילות של זמן reagents? וזה היה הפתרון שלנו. אז יצרנו צלחת כוח מתיחה 96 היטב. וזה נראה דומה מאוד לצלחת קונבנציונלית 96 גם רקמות תרבות, אולם עם המנה הזאת אנחנו יכולים לא רק לבחון 96 תנאים שונים של תרבות התא, אלא גם לכמת את התכווצות התא שלהם. זה מציג פתרון תפוקה הרבה יותר גבוה מאשר גישות מנה אחת, המאפשר לנו לבחון תנאי תאים מגוונים ותגובות מתכווץ. במהלך גרורות סרטן, תאים סרטניים לנסוע מהאתר העיקרי שלהם לאתרים משניים, הפצת המחלה בגוף שלנו. התנהגות גרורתית זו של תאים סרטניים מהווה 90% מהמוות הקשור לסרטן. אחד המנגנונים המוצעים עבור תאים סרטניים אפיתל לרכוש פנוטיפ נודד פולשני יותר הוא מעבר אפיתל-mesenchymal, EMT. במהלך EMT, הם הופכים נודדים יותר פולשני, שינוי ההתנהגות הפיזית שלהם. כדי להבין טוב יותר את השינויים האלה בהתנהגות הפיזית, אנו משתמשים במצע הסיליקון הרך שלנו כדי למדוד שינויים בהתכווצות של תאי בלוטת החלב של העכבר עם אינדוקציה EMT על ידי TGF-In במחקר זה, חקרנו כיצד ריכוזים שונים וזמן הדגירה של התנהגות פיזית של תאים משפיעים TGF. Polydimethylsiloxane הוא גומי תואם מאוד עם מודולוס הצעיר הנמוך ביותר של כ 0.6 קילופסקל. הנוקשות של חומר זה גם יכול להיות tunable באמצעות ריכוזים שונים של סוכן crosslink כולל SYLGARD 184.To למדוד תכונות מכניות של PDMS אנו משתמשים rheometer. לאחר ערבוב חלק A וחלק B של PDMS, ביחס משקל אחד לאחד והוספת סוכן הריפוי עם אחוז המשקל שצוין, לטעון את האצווה מוכנה על צלחת rheometer. הקפד לטעון מספיק של המדגם כדי לכסות לחלוטין את אזור הציר. חשוב לוודא שהתרד נוגע לחלוטין בדגימה ללא מקום פנוי בקצהו. כל דגימה נוספת צריכה להיות חתוך בקפידה ונמחק מהצלחת. למדוד את מודולוס האחסון הסופי ואת התלות בזמן של צמיגות של כל מדגם על ידי ביצוע מטאטא זמן ותדירות בזן גזירה נדנוד של 0.5%Newsha]גרף זה הוא דוגמה אחת של מבחן seq זמן, לאחר שעשה כדי למדוד התנהגות ריאולוגית של polydimethylsiloxane עם זן גזירה מתנד להחיל של 0.5% וטמפרטורה של 100
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הנוכחי מציג מבחן כוח משיכה בתפוקה גבוהה המיוצר מגומי סיליקון (PDMS), שנועד לחקור שינויים פיזיים בכושר ההתכווצות של תאים במהלך תהליכים ביולוגיים שונים. התועלת של השיטה מוצגת דרך מדידת עלייה בכושר ההתכווצות תלוית TGF-β במהלך המעבר האפיתלי-מזנכימלי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיית תאים
- ביומכניקה
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- כושר ההתכווצות של התא חיוני בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת השינויים בכושר ההתכווצות יכולה לספק תובנות לגבי מחלות.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות חסרות תפוקה ורגישות.
- PDMS הוא חומר רב-תכליתי ליצירת מבחנים.
מטרת המחקר
- לפתח מבחן בתפוקה גבוהה למדידת כושר ההתכווצות של תאים.
- להעריך את השפעת TGF-β על כושר ההתכווצות במהלך המעבר האפיתלי-מזנכימלי.
- לספק שיטה אמינה לחקר התנהגות תאים בתנאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור מבחן כוח משיכה באמצעות PDMS.
- מדידת כושר ההתכווצות של תאים בתגובה ל-TGF-β.
- ניתוח בתפוקה גבוהה להערכת מספר דגימות.
- הערכת הדינמיקה של המעבר האפיתלי-מזנכימלי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של שינויים בכושר ההתכווצות של תאים.
- הוכחת עלייה תלוית TGF-β בכושר ההתכווצות.
- אימות התועלת של המבחן המבוסס על PDMS.
- הספקת תובנות לגבי המכניקה של תהליכי המעבר של התאים.
מסקנות
- מבחן כוח המשיכה של PDMS יעיל לחקר כושר ההתכווצות של תאים.
- אושרה עלייה בכושר ההתכווצות במהלך המעבר האפיתלי-מזנכימלי.
- שיטה זו יכולה להיישם במחקרים ביולוגיים וביו-רפואיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
