תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה
1 ביוני 2019
אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.
המעבדה שלי מתעניינת במכנוביולוגיה, הבוחנת כיצד תאים מופעלים ומושפעים על ידי כוחות מכניים. דרך אחת לכמת מכנוביולוגיה היא מדידת התכווצות התאים. בתאים חסידיים, התכווצות מתבטאת בכוחות המתיחה המופעלים על מצע התא. אנו מכמתים כוחות אלה באמצעות מתודולוגיה המכונה בדרך כלל מיקרוסקופ כוח המתיחה או TFM. ו TFM מיושם במגוון רחב של שיטות שונות, אבל היבט נפוץ הוא שזה טכניקת מעבדה סדרתית ואיטית למדי נעשה בדרך כלל בצלחת אחת כמו זו כאן. זה מגביל אותנו להערכת אוכלוסייה או מצב אחד בכל פעם. לאורך כל תרבות התאים שופרה לפני זמן מה אבל יצירת מנות multiwell וחשבנו, זה לא יהיה נהדר זה יכול להיות TFM עם תפוקה מוגברת זהה ואת אותה יעילות של זמן reagents? וזה היה הפתרון שלנו. אז יצרנו צלחת כוח מתיחה 96 היטב. וזה נראה דומה מאוד לצלחת קונבנציונלית 96 גם רקמות תרבות, אולם עם המנה הזאת אנחנו יכולים לא רק לבחון 96 תנאים שונים של תרבות התא, אלא גם לכמת את התכווצות התא שלהם. זה מציג פתרון תפוקה הרבה יותר גבוה מאשר גישות מנה אחת, המאפשר לנו לבחון תנאי תאים מגוונים ותגובות מתכווץ. במהלך גרורות סרטן, תאים סרטניים לנסוע מהאתר העיקרי שלהם לאתרים משניים, הפצת המחלה בגוף שלנו. התנהגות גרורתית זו של תאים סרטניים מהווה 90% מהמוות הקשור לסרטן. אחד המנגנונים המוצעים עבור תאים סרטניים אפיתל לרכוש פנוטיפ נודד פולשני יותר הוא מעבר אפיתל-mesenchymal, EMT. במהלך EMT, הם הופכים נודדים יותר פולשני, שינוי ההתנהגות הפיזית שלהם. כדי להבין טוב יותר את השינויים האלה בהתנהגות הפיזית, אנו משתמשים במצע הסיליקון הרך שלנו כדי למדוד שינויים בהתכווצות של תאי בלוטת החלב של העכבר עם אינדוקציה EMT על ידי TGF-In במחקר זה, חקרנו כיצד ריכוזים שונים וזמן הדגירה של התנהגות פיזית של תאים משפיעים TGF. Polydimethylsiloxane הוא גומי תואם מאוד עם מודולוס הצעיר הנמוך ביותר של כ 0.6 קילופסקל. הנוקשות של חומר זה גם יכול להיות tunable באמצעות ריכוזים שונים של סוכן crosslink כולל SYLGARD 184.To למדוד תכונות מכניות של PDMS אנו משתמשים rheometer. לאחר ערבוב חלק A וחלק B של PDMS, ביחס משקל אחד לאחד והוספת סוכן הריפוי עם אחוז המשקל שצוין, לטעון את האצווה מוכנה על צלחת rheometer. הקפד לטעון מספיק של המדגם כדי לכסות לחלוטין את אזור הציר. חשוב לוודא שהתרד נוגע לחלוטין בדגימה ללא מקום פנוי בקצהו. כל דגימה נוספת צריכה להיות חתוך בקפידה ונמחק מהצלחת. למדוד את מודולוס האחסון הסופי ואת התלות בזמן של צמיגות של כל מדגם על ידי ביצוע מטאטא זמן ותדירות בזן גזירה נדנוד של 0.5%Newsha]גרף זה הוא דוגמה אחת של מבחן seq זמן, לאחר שעשה כדי למדוד התנהגות ריאולוגית של polydimethylsiloxane עם זן גזירה מתנד להחיל של 0.5% וטמפרטורה של 100
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקת כוח מתיחה (traction force assay) בעלת תפוקה גבוהה, המיוצרת מגומי סיליקון (PDMS), שנועדה לבחון שינויים פיזיים ביכולת התכווצות התאים במהלך תהליכים ביולוגיים שונים. התועלת של השיטה מודגמת באמצעות מדידה של עליות בתכווצות התלויות ב-TGF-β במהלך מעבר של תאים מאפיתל למזנכימה (epithelial-to-mesenchymal transition).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- ביומכניקה
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- כיווצות תאים היא קריטית בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת שינויים בכיווצות יכולה לספק תובנות לגבי מחלות.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות חסרות תפוקה ורגישות.
- PDMS הוא חומר רב-שימושי ליצירת בדיקות (assays).
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה בתפוקה גבוהה למדידת כיווץ תאים.
- הערכת ההשפעה של TGF-β על הכיווץ במהלך מעבר אפיתלי-מזנכימלי.
- אספקת שיטה מהימנה לחקר התנהגות תאים בתנאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של מערך למדידת כוח מתיחה באמצעות PDMS.
- מדידה של כיווצות תאים בתגובה ל-TGF-β.
- ניתוח בסביבת תפוקה גבוהה להערכת דגימות מרובות.
- הערכה של דינמיקת המעבר מאפיתל למזנכימה.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של שינויים בכיווציות תאים.
- הדגמה של עליות בכיווציות התלויות ב-TGF-β.
- תיקוף של התועלת בבדיקה המבוססת על PDMS.
- מתן תובנות לגבי המכניקה של תהליכי מעבר של תאים.
מסקנות
- בדיקת כוח המתיחה ב-PDMS יעילה לחקר התכווצות תאים.
- אושרה עלייה בתכווצות במהלך מעבר אפיטלiali-מזנכימלי.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים ביולוגיים וביו-רפואיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמה זו למיקרוסקופיית כוחות מתיחה (traction force microscopy) בעלת תפוקה גבוהה מאפשרת הערכה כמותית של כיווצות תאיים בפורמט בר-הרחבה, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. על ידי קישור מעבר אפיטלiali-מזנכימלי המושרה על ידי TGF-β לשינויים ביופיזיים מדידים, השיטה מספקת ערך ניבוי לתיקוף מטרות במחקר על פיברוזיס וגרורות. המערכת המבוססת על PDMS מציעה הדירות ותאימות לתהים עבודה קיימים של לוחות רב-בארים, ובכך משפרת את יכולת השימוש החוזרת בארגון לאורך צינורות של ביולוגיה של גילוי ופיתוח בדיקות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של TGF-β כמודולטור של כיווצות תאית במהלך EMT, ובכך תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק נתונים על כיווצות התלוים במינון ובזמן, לצורך תיעדוף של מטרות מכניסטיות במסלולי פיברוזיס וסרטן.
- ערך ניבוי: מכמת פנוטיפים ביופיזיקליים הקשורים ל-EMT, ובכך מסייע בבחירת מטרות בשלב הפרה-קלני ובצמצום סיכונים של מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כיווץ כמותיות שאינן תלויות בסובסטרט לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות בסריקות מכנוביולוגיה.
- ערך תפעולי: תואם לפורמט של 96 בארות, מה שמאפשר סריקה מקבילה של ספריות תרכובות או מינונים של ציטוקינים.
- מוכנות הבדיקה: עושה שימוש בסובסטרטים יציבים ואינרטיים של PDMS עם מודולו הניתן לכוונון (0.4–100 kPa) וחיי מדף בלתי מוגבלים, ובכך מפחית שונות בין סדרות ייצור.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין המינון ומשך החשיפה ל-TGF-β לבין התוצר התכווצתי, ובכך תומך במודלים פרה-קליניים של EMT המותאמים למסמני ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר הערכה של שינויים ביכולת ההתכווצות כקריאה פונקציונלית במערכות הרלבנטיות למחלה לפני תיקוף in vivo.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות go/no-go על ידי הקשר בין התערבות מולקולרית לבין מודולציה של הפנוטיפ הביופיזיקלי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת מדדים ביופיזיקליים התומכים בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים.
- ביולוגיה גילויית: תומכת בבדיקת השערות לגבי השפעות של סיגנלינג TGF-β על מכניקה תאית ויכולת התכווצות.
- סריקה: מאפשרת כימות רב-דגימתי (high-throughput) וניתן לשחזור של כוחות מתיחה בפורמטים של מספר בארות לצורך ניתוח תגובה למינון.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי התכווצות (עוצמת כוח, פיזור) המאפשרים השוואה בין ריכוזי TGF-β וזמני חשיפה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין השראה של EMT in vitro לשינויים ביומכניים מדידים, ובכך תומכת ברלוונטיות של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה רב-פעמית למדידת כוחות מתיחה, שניתן ליישמה על סוגי תאים שונים ויעדי מכנוביולוגיה באונקולוגיה ובפיברוזיס.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות בפנוטיפים מכנו-ביולוגיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות וההתרחבות באמצעות תתי-משטחים סטנדרטיים של PDMS ותאימות לבארות מרובות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי אפשור בדיקה מקבילה של תנאים והפחתת צריכת ריאגנטים לכל נקודת נתון.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעוד ותיעדוף מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על שינויים כמותיים בכיווץ במהלך מעברים פתוגניים.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, בניתוח תמונות TFM ובהכנת תַּשְׁבֵּת (substrate) של PDMS.
- נשען על רחאומטריה לאפיון התַּשְׁבֵּת ועל מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לכימות כוחות משיכה.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות הזריעה, פונקציונליזציה של התַּשְׁבֵּת ותנאי הדמיה בין הבארות.
- התאמה לסוגי תאים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קשיחות התַּשְׁבֵּת וליגנדים להיחברות.
- מגבלות מעשיות כוללות אחידות בעובי התַּשְׁבֵּת ואוטופלואורסצנציה פוטנציאלית של PDMS באורכי גל מסוימים.
