השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

הפרוטוקול המוצג יקל על מחקרים על הטרנס ועל ההשפעות הרב-דוריות של חלבונים שיכולים להתקיים זמן רב בסביבה. השתמשנו nematode חיים חופשיים עם 99.5 כמו הרמפרודיטים כדי לחסוך זמן ומאמץ בחקר אפקטים טרנס ורב דורי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להדגים את ההשפעות ארוכות הטווח של תרופות קצה כי nematode בפרוטוקול הנוכחי חולק מנגנונים שמרניים רבים או מסלולים עם בני אדם.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לתחומי הסינתזה התרופות וניהול סביבתי כי הם צריכים משוב של סכנות פוטנציאליות של כימיקלים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דפניה מגנה עם דגש רב יותר על רעילות מימית. גם Drosphila מלנוגסטר להמשיך לחקור השפעה על מגדר.

הוא או היא יהיו תקועים עם הרעיון שללמוד השפעות לאורך דורות זה זמן וגוזל אנרגיה. אל תפחד מהרושם הראשוני. ביצוע הפרוטוקול ירוויח לך תוצאה פורייה.

לתרבות E.coli, פיפטה 200 microliters מן המתלים חיידקי לתוך 50 מיליליטר של מדיום LB בבקבוקון. לחלופין, השתמש בלולאה לחישוב כדי לבחור מושבה קטנה מ- NGM agars ולמקם אותה במדיום LB. לתרבות C.elegans, תחת מיקרוסקופ, לספור את nematodes על אגרים NGM לערום מוכן קודם לכן.

כאשר המספר מגיע קרוב ל 2, 000, להשתמש טיפ סטרילי לחתוך 1/6 של אגר NGM ולהעביר אותו על אגר NGM שהוכן לאחרונה עם מדשאה חיידקית. שמור את אגר NGM במהופך בחממה 22 מעלות צלזיוס לתרבות הבאה. לאחר כ-36 שעות, הנומטודות הופכות לכבידה.

השתמש בשני מיליליטר של מים סטריליים כדי לשטוף את nematodes gravid וביצים המיוצרים לאחרונה על כל אגר NGM לתוך צינורות צנטריפוגה סטריליים. מניחים את הצינורות על מתלה במשך 30 דקות כדי להתיישב nematodes, ולאחר מכן להשליך 85% של supernatants על ידי צינורות. חשוב מאוד לשפוט אם הנומטודות מספיק נלהבות לסנכרון.

אחרת, פעולת סנכרון הגיל תהיה לשווא. מערבבים את כדורי עם שבעה כרכים של פתרון hypochlorite נתרן לנער את צינורות צנטריפוגה כל שתי דקות במשך חמש עד שמונה פעמים כדי ללטש את הזחלים ואת nematodes למבוגרים. צנטריפוגה הצינורות ב 700 פעמים G במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants על ידי צינורות.

להשעות מחדש את כדורי בחמש כמויות של מים סטריליים לשטוף את הביצים מסונכרן גיל. צנטריפוגה ב 700 פעמים G במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. חזור על לשטוף על ידי מים סטריליים, פעמיים.

לאחר מכן, להוסיף נפח אחד של מים סטריליים לתוך הצינורות כדי להשעות מחדש את הביצים מסונכרן גיל. להפיץ את השעיות הביצה על ידי צינור חמישים מיקרו ליטר על כל אגר NGM חדש עם מדשאה חיידקית. שמור את הצד העליון אגר NGM למעלה ב 20 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך 30 דקות, המאפשר למים להתאדות או להיספג על ידי הדשא חיידקי.

לאחר מכן, להפוך את אגר NGM, במהופך, לתרבות הבאה, ולסמן את הזמן כמו זמן הביצה. 36 שעות לאחר זמן הביצה, nematodes להגיע לשלב הזחלים L3. השתמש בשני מיליליטר של מים סטריליים כדי לשטוף את nematodes את כל אגר NGM לתוך צינורות צנטריפוגה.

לאחר שהתיישבו במשך 30 דקות, החליפו 85% מהעל-טבעיים ב-K Medium כדי לעכל את האוכל במעיים במשך שעתיים. לאחר מכן, השלך את העל-טבעיים. השתמש K Medium כדי להתאים את המתלים nematode על 200 nematodes לכל 100 microliters לניסויים הבאים.

כדי למנוע השפעות קצה, באזור האמצעי של מיקרופלסטיק סטרילי 96 באר, להוסיף 100 microliters של שליטה מוכנה או פתרונות כימיים לתוך 10 בארות, כמו משכפל בשש קבוצות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של ה-K Medium המוכן לכל אחת מ-60 בארות. סמן את השעה כ-T0. בצע את החשיפה במשך 24 עד 96 שעות.

לאחר החשיפה, השתמש פיפטה כדי לאסוף nematodes מחמש בארות בכל קבוצה, לתוך שישה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. ליישב את nematodes במשך 30 דקות ולאחר מכן פיפטה כדי להשליך את supernatants. לשטוף את nematodes בתחתית עם מיליליטר אחד של מים מעוקרים.

ליישב את nematodes במשך 30 דקות. השלך את העל-טבעיים, ולהשתמש nematodes בתחתית עבור מדידות מחוון של דור האב חשוף, מסומן כמו F0. לאסוף את nematodes מחמש בארות הנותרות בכל קבוצה. להתיישב ולשטוף את nematodes כמו קודם לכן.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של מים סטריליים להשעות מחדש את nematodes בכל צינור, ולהעביר את המתלים nematode באופן שווה על שלושה אגרים NGM שהוכנו לאחרונה עם מדשאה חיידקית. דגירה nematodes במשך 36 שעות כדי להיות gravid, ולבצע סנכרון גיל, כמו קודם לכן. לאחר הדגירה של הביצים המסונכרנות על אגרים NGM עם מדשאה חיידקית במשך 36 שעות, לשטוף את nematodes לתוך שישה צינורות צנטריפוגה.

לאחר התיישבות וכביסה עם מיליליטר אחד של מים מעוקרים, השתמש nematodes בתחתית עבור מדידות מחוון של הדור צאצאים מסומן T1. מערבבים 99 מיליליטר של אגרים NGM חם עם מיליליטר אחד של שליטה או פתרונות כימיים. לאחר הכנת האגארים עם השעיות חיידקים על פי כתב היד, בארון הבטיחות הביולוגית, הניחו בצד את המכסים העליונים של צלחות פטרי וחשפו את מדשאת החיידקים לאור UV במשך 15 דקות. פיפטה הביצים המסונכרנות לגיל על אגר UV מטופלים.

סמן את תחילת החשיפה לדור האב, F0, כיום אפס. דגירה אגר במשך שלושה ימים ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשתמש nematodes בוגרת כדי למדוד אפקטים F0. כמו כן, ביום השלישי, השתמשו במוט זכוכית המצויד בחוט סיבים עשוי אדם הכפוף לטבעת כדי לבחור נמטודות בוגרות F0, ולהחליק על פני השטח של אגרים NGM חדשים שטופלו ב- UV.

ביום הרביעי, בחרו והשליכו את ה-F0 nematodes הבוגרים מ-NGM agars. ביום השישי, השתמשו ב-F1 nematodes בוגרים שחוו חשיפה במשך שלושה ימים למדידת מדדים. בפרוטוקול זה, ההשפעות הטרנס-דוריות של קדמיום, נחושת, עופרת ואבץ על תדר כיפוף הגוף הראו כי העכבות בהורה nematode, F0, לאחר חשיפה טרום לידתית היו פחות מאשר צאצאיהם, T1. ההשפעות הרב-דוריות של סולפאמתוקסזול על תוחלת החיים והרבייה של הנמטודה הראו כי הרבייה הושפעה באופן משמעותי בחשיפה לקו הנבט, והטוקסיקות נמשכו בדורות לא חשופים מדורות T3 עד T6.

חשיפה רב-דורית והשפעות שיורית רב-דורית של לינדן על המדדים הביוכימיים והגנטיים של נמטודה הראו השפעות אובסוגניות עם הפרעות בוויסות אות האינסולין. יתר על כן, השינויים בין sgk-1 ו akt-1 איתות עולה כי nematodes מדורות חשיפה שונים הראו אסטרטגיות תגובה שונות עבור סובלנות והימנעות. בדוק את מצב החיים של nematodes לפני כל פעולה, ולשנות את השלבים הבאים בהתאם.

השפעות אחרות, למשל, השפעות obesogenic של כימיקלים, ניתן לכלול כדי לענות עוד יותר על השכיחות הגוברת של השמנת יתר לאורך דורות. בהתבסס על השיטה, ניתן לחקור מנגנונים נוספים. לדוגמה, אותות אפיגנטיים תורשתיים בין דורות.

לפתרונות הכלור יש פוטנציאל חמצוני חזק, ולהימנע ממגע ישיר של העור אליו.