Name: קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: למד הדמיה חיה של מריסטמות פסגה בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים ללא הכנה מורכבת של דגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מתקן הדמיה מרכז פרדו Bindley Bioscience לגישה הלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, לתמיכה טכנית, ומסכים המחברים מעריך את העזרה של אנדי Schaber במתקן הדמיה Bindley פרדו. פעילות זו מומן על ידי אוניברסיטת פרדו כחלק AgSEED פרשת דרכים מימון לתמוך החקלאות ופיתוח הכפר של אינדיאנה.

1. הכנת מנות מדיה והדמיה
<ol><li>MS צלחות: להוסיף 0.5 x Murashige & Skoog MS בינוני, 1% אגר למים יונים ולאחר מכן התאם את ה-pH ל 5.8 שימוש אשלגן הידרוקסידי פתרון (אופציונלי: להוסיף 1% סוכרוז לגידול צמחים לטווח ארוך). אוטוקלב, יציקת פלטות.</li>
	<li>הדמיה מנות: מילוי פלסטיק צלחות פטרי (6 ס"מ, עומק של 1.5 ס מ) ל- 0.5-0.8 ס מ עם agarose מותכת 1.5%.</li>
</ol>2. צימוח
<ol><li>
תודרנית צמיחה<ol>
<li>לזרוע זרעים סטיריליים על MS צלחות והנח הצלחות מתחת לגיל 4 ° C במשך יומיים. לאחר מכן, להעביר צלחות MS יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h), ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבועיים.</li>
		<li>השתלת השתילים אדמה ולצמוח אותם יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h) ב 22 מעלות צלזיוס במשך ארבעה שבועות.</li>
		<li>העברת מפעלים אור רציף, ב 22 ° C כדי לעודד את המעבר מ צמח לבמה הרבייה, הדמיה התפרחת סאמס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>גידול עגבניות, סויה<ol>
<li>דגירה הזרעים מכוסים נייר סינון רטוב מתחת 28 ° C עד שהם לנבוט.</li>
		<li>השתלת השתילים אדמה ואגדל אותם ביום ארוך (16 h אור / כהה 8 שעות) 25 ° c במשך שבוע אחד או יותר עבור הדמיה סאמס וגטטיבי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח השיא לירות
<ol><li>דיסקציה של תפרחת לירות השיא<ol>
<li>חותכים את איפקס לירות תפרחת יחד עם 1-2 ס מ גזע ראשי מצמחים תודרנית שהצוקים עם סכין גילוח. . תחזיק את החלק הבזליים של הגזע המרכזי, להסיר איברים פרח בוגרים רבים ככל האפשר מן הגזע הראשי על-ידי לנתח החוצה peduncles עם מלקחיים תכשיטים. זהירות: הימנעו חיתוך האצבעות כאשר באמצעות סכין גילוח. השלך סכיני גילוח משומשים לגורם המכיל שרפ ראוי.</li>
		<li>להחזיק את הגבעול המצורפת של השיא לירות עם מלקחיים תכשיטים או אצבעות בתחום stereomicroscope, להמשיך בהסרת שאר הפרחים עד כמעט כל סם ניתן להציג את עיניות. הסר peduncles בבירור בצומת של הגזע המרכזי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח איפקס צמח לירות<ol>
<li>כדי להציג סאמס צמח עגבניה או סויה, שווייץ פסיגי הזרע, עלים ושורשים מצמחים.</li>
		<li>להחזיק את hypocotyls של הצמחים תחת stereomicroscope ומנתחים נוספת החוצה primordia העלה המכסה סאמס וגטטיבי באמצעות מלקחיים תכשיטים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מכתים
<ol><li>כדי להמחיש ישירות בתאים סאמס, להשתמש propidium הטרי יודיד (PI) פתרון כתם קירות התא. לפזר אבקת PI במים סטרילי, יונים, הופך פתרון מכתימים 1 מ"ל PI-הריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן את הפתרון PI בצינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.</li>
	<li>פיפטה 50 פתרון PI µL בסביבה נקייה ולירות הפטרי ריקים ומטבל כל גזור איפקס לתוך צבע עבור 2 דק שטיפה השיא מוכתם לירות פעמיים במים סטרילי, יונים. במהלך תהליך צביעת, לטבול התפרחת כל סם או סם וגטטיבי בתוך תמיסת PI על מנת להשיג צביעה אחידה.</li>
</ol>5. אוסף תמונה
הערה: עבור שיטה זו, כל סאמס הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף ועם 20 x עדשת המים טובלים. כפי שמתואר אחרים פרוטוקולים9,12,13,15, זה גם ריאלי התמונה סאמס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. בנוסף, ההדמיה חיה יכולה להיות מושגת באמצעות סוגים שונים של מיקרוסקופ קונפוקלי, עם הפעולות הכנת המדגם. במחקר זה, השלבים הדמיה מתוארים בפירוט כדוגמה.
<ol><li>פירס חור במרכז צלחת הדמיה באמצעות מלקחיים, תקע את איפקס לירות מוכתם זקוף המדיום.</li>
	<li>למלא את הצלחת הדמיה במים סטרילי, יונים לחלוטין לטבול את הדגימה. הצגת מ סטריאו מיקרוסקופ, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר לכוד סביב meristem. לאחר מכן, להתאים את הזווית של הגזע ב אגר כדי לוודא כי סאם היא גלויה לגמרי מן ישירות מעל.</li>
	<li>במקום המנה הדמיה על השלב מדגם של מיקרוסקופ קונפוקלי. להוריד את עדשת המים טובלים ולגדל השלב הדגימה במיקרוסקופ לתת הקצה של מח ש עדשה לתוך המים.</li>
	<li>פתח את התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי ואתר את סאם, brightfield ב עיניות. להעביר את הזכות דוגמת סם מתחת לעדשה המטרה באמצעות התאמת הבקר XY, ואז להתמקד סאם של עיניות דרך בזהירות התאמת הבקר Z.</li>
	<li>להפעיל את פונקציית רכישת התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים), התחל לחיות במצב להציג את הדגימה של מסך המחשב, ולהגדיר כל הפרמטרים הלייזר סריקה הניסוי.<ol>
<li>בעת כוונון הפרמטרים, להשתמש פונקציה מציינת טווח כדי להגדיר אם האות רווי או לא.</li>
		<li>באופן אופציונלי, להחיל הפונקציה חוזר רענן כל הגדרות הפרמטר מקובץ ה-קונפוקלי שנבחרו. הערה: הציע הדמיה פרמטרים: לייזר קו (עירור): 515 ננומטר או 561 ננומטר; פליטה 570-650 ננומטר; חריר: 1 יחידה אוורירי (AU); רווח: 600-750, במצב סריקה: מסגרת; מסגרת גודל: 512 X 512 או 1024 X 1024; מהירות סריקה: 7 למקס; סריקה כיוון: כיוונים; חישוב ממוצע רגיל מספר: 2-4; ממוצע של השיטה: מתכוון; עומק סיביות: 16 סיביות; מרווח זמן סריקה: 0.5-1 מיקרומטר. יתרה מזאת, למטב כל הפרמטרים הללו מבוסס על האופי של צמחים שונים ודוגמאות על הצרכים הספציפיים הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. עיבוד תמונה
<ol><li>להמחשת אופטי אורתוגונלית וכן רוחבי בסעיף נופים, להשתמש בתוכנה מסחרית זהה לרכישת הדמיה. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט הפעלה אורתוגרפית, בחר האורתופדיה. ואז בחר גם מיקום x, מיקום y ו- z מקמו בתמונה ולשמור את התמונות של קובצי tiff.<ol>
<li>לחילופין, בחר פונקציית מרחק תלת-ממד כדי להגדיר את המרחק הפיזי בין שתי נקודות אשר נבחרו מתוך הערימה של תמונות קונפוקלי.</li>
		<li>לחלופין, השתמש פיג ' י/תמונה J, חבילת עיבוד התמונה משאבים להמחיש התצוגות סעיף אורתוגונלית ו רוחבי.</li>
		<li>פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחר את סטאקס ולאחר מכן בחר תצוגות אורתוגונלית.</li>
		<li>בחר XY yz ימאהה, מטוסים XZ במצב האמצעי ושמור תמונות בתבנית Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להמחשת שקוף הקרנה 3D, להשתמש בתוכנה זהה.<ol>
<li>פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט 3Dובחר שקוף ליצירת תצוגה הקרנה תלת-ממד.</li>
		<li>לחלופין לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראהולאחר מכן בחר שקיפות כדי להתאים שלושה פרמטרים של ההקרנה כולל סף, השיפוע המרבי עבור השקיפות של 3D תמונה.</li>
		<li>לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראה, ובחרו אור כדי לכוונן את הבהירות של התמונה התלת-ממד.</li>
		<li>ייצוא תמונות המוקרנת ולשמור אותם של קובצי Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להמחשת העוצמה המקסימלית 3D השלכה, לפתוח את הקבצים קונאפוקלית עם התוכנה באותו ולחץ על התפריט תלת-ממד.<ol>
<li>בחר תפריט התלת-ממד ובחרו המרבי.</li>
		<li>לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש הקרנה תלת-ממדי העוצמה המקסימלית.</li>
		<li>פתח את הקובץ המקורי קונאפוקלית עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ' ובחר ערימות.</li>
		<li>בחר פרוייקט 3D ושמור תמונות בתבנית Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להמחשת העומק קידוד תצוגה של תמונות 3D, להשתמש בתוכנה זהה.<ol>
<li>לחץ על תפריט התלת-ממד ובחרו המראה.</li>
		<li>בחר מיוחדת ובחר עומק קידוד.</li>
		<li>לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את עומק קידוד תצוגה.</li>
		<li>לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחרו Hyperstack.</li>
		<li>בחר קוד הטמפורלית-צבע ולשמור תמונות בתבנית Tiff. הערה: עומק קידוד z-המחסנית גם יכולה להיות מושגת באמצעות התוסף מחסנית קוד Z לפיג'י.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להמחשת 3D סיבוב התצוגה המוצגת (1 סרט , סרט 2), להשתמש בתוכנה זהה (ראה את הטבלה של חומרים).<ol>
<li>לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט 3Dובחר סדרות.</li>
		<li>בחר רינדור סדרתובחר באחת מהאפשרויות 4 כולל תסתובב x, תסתובב y, ההתחלה והסיוםשל הרשימה מיקום.</li>
		<li>שמור את הסדרה רינדור קבצי AVI.</li>
		<li>לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את התצוגה סיבוב תלת-ממד.</li>
		<li>פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה 'ובחר ערימות.</li>
		<li>בחר פרוייקט 3D ולשמור כקובץ וידאו בפורמט AVI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה הדמיה פשוטה שניתן להחיל בחקר לירות apical meristems מצמחים שונים עם מינימאליים, פתיחת שדרה חדש ללמוד ברגולציה meristem בשלבים הן וגטטיבי לבין הרבייה בצמחים מודל ו יבולים. בניגוד SEM ופעולות היסטולוגית מוכתמים, פרוטוקול זה יכול לעזור לחשוף בתצוגת משטח והן מבנים הסלולר פנימי של סאמס, ללא צורך קיבוע הדגימה עתירי עבודה ו/או רקמות חלוקתה צעדים. פרוטוקול זה הוא גם תואם לשיטת הדימות הוקמה עבור הכתבים פלורסצנטיות מבוסס ב סאמס, שעשוי להיות מתן החלטה סלולרית טובה אשר מאפשר לנו לקבל תצוגה תלת-ממדית של דפוסי ביט...

Meristem הצמח מכיל מאגר של תאי גזע מובחן, ברציפות ומקיימת את צימוח איברים ואת פיתוח1. במהלך הפיתוח postembryonic, כמעט כל רקמות מעל פני הקרקע של צמח נגזרות של meristem apical לירות (SAM). בגידולים, פעילותן ואת גודל את סאם שלה meristems פרחוני נגזר הם קשורים בחוזקה רבים אגרונומית תכונות כגון ארכיטקטורה לירות, פירות ייצור זרע התשואה. לדוגמה, בעגבניה, סאם מוגדל גורמת עלייה הצילומים ואת תפרחת הסתעפות, ולכן התוצאות על מנת לייצר פרח נוסף ופרי איברים2. תירס, גידול בגודל סאם מוביל מספר הזרעים גבוה יותר, התשואה הכוללת3,4. סויה, indeterminacy meristem גם קשורה קשר הדוק עם הארכיטקטורה לירות, תשואה5.
מורפולוגיה של האנטומיה של סאמס יכולים להיות מאופיינת במספר שיטות, כולל היסטולוגית חלוקתה/צביעת וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)6, אשר שניהם יש קידמה מאוד את המחקר meristem באמצעות מתן תצוגת חתך או מבט תלת מימדי (3D) משטח של סאמס. אולם, שתי השיטות הן זמן רב, מעורבים מספר שלבים ניסיוני משלב הכנת המדגם אל, רכישת נתונים, שיטות אלה תלויים בעיקר מדגמים קבועים. התפתחויות אחרונות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקת לייזר היה להתגבר על מגבלות אלה ולספק לנו כלי רב עוצמה כדי לחקור את המבנה התאי ואת התהליך ההתפתחותי של הצמח רקמות ואיברים7,8. דרך אופטי ולא רקמה גופנית מיקרוסקופ קונפוקלי, אופטים מאפשר את האוסף של סדרה של תמונות z-מחסנית ושיחזור 3D עוקבות של המדגם באמצעות תוכנות ניתוח התמונה.
כאן, אנו מתארים הליך יעיל עבור חוקרים גם בפנים ולשתול משטח מבני המגורים סאמס מ שונים מינים באמצעות סריקת קונפוקלית, אשר פוטנציאל מאפשר לחוקרים לבצע כל את ניסיוני לייזר תהליך בתוך קצר ככל 20 דקות. שונה מכל שיטות נוספות שפורסמו בשידור חי הדמיה קונאפוקלית של תודרנית תפרחת סאמס9,10,11,12,13,14, 15 ו תודרנית פרחים12,13, כאן אנחנו מוכיחים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק את תפרחת meristems של המין מודל, אלא גם את הצילומים וגטטיבי meristems apical של גידולים שונים, כגון עגבניות, סויה. בשיטה זו אין להסתמך על סמנים פלורסנט הטרנסגניים ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם ללמוד את meristems לירות מתוך שפע מינים שונים של הזנים. בנוסף, אנחנו גם מציגים את התמונה פשוט עיבוד צפייה וניתוח סאמס שונים בתצוגה תלת-ממדית. יחדיו, שיטה פשוטה זו יקל על החוקרים להבין טוב יותר את המבנה ואת תהליך התפתחותי meristems דגם אורגניזמים והן יבולים.

<table><tbody><tr><td>אגר פיטו</td><td>דוט סיינטיפיק בע"מ</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>דוט סיינטיפיק בע"מ</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF מלקחיים סופר עדינים גודל קצה אינוקס .025 X .005 מ"מ, לניתוח קודקודי יורה.</td></tr><tr><td>LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף&nbsp;</td><td>זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מוראשיג'ה & Skoog MS בינוני</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 עדשת טבילה במים</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מפלסטיק 100 מ"מ X 15 מ"מ</td><td>CELLTREAT מוצרים מדעיים</td><td>229694</td><td>לשימוש להכנת צלחות MS</td></tr><tr><td>צלחות פטרי מפלסטיק 60 מ"מ X 15</td><td>CELLTREAT מוצרים מדעיים</td><td></td><td>229665 שימוש ככלי הדמיה</td></tr><tr><td>תערובת ריבוי</td><td>Sungro גננות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל במים, כדי להכתים את דפנות התא</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>לחיתוך קודקוד יורה מצמחים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen black</td><td>Zeiss</td><td></td><td>תוכנת רכישת תמונות</td></tr></tbody></table>

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

הפונקציות apical meristem (SAM) לירות כמו מאגר תאי גזע שנשמרת וזה יוצר כמעט לכל רקמות מעל פני הקרקע במהלך הפיתוח postembryonic. פעילותן ואת המורפולוגיה של סאמס לקבוע תכונות אגרונומית חשובים, כגון ארכיטקטורה לירות, הגודל והמספר של איברי הרבייה, וחשוב, התשואה תבואה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח המורפולוגיה השטח והן המבנה התאי פנימי של חיים סאמס ממינים שונים דרך מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. ההליך כולו משלב הכנת המדגם רכישת תמונות תלת מימד (3D) ברזולוציה גבוהה יכול להתבצע במרחק קצר ככל 20 דקות. נדגים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק התפרחת סאמס של המין מודל, אלא גם את meristems וגטטיבי של גידולים שונים, מתן כלי פשוט אך רב עוצמה כדי ללמוד את הארגון ואת התפתחות meristems על פני מינים שונים.

כדי להעריך את היעילות של פרוטוקול שלנו וכדי לחקור את המורפולוגיה של meristems של מינים שונים, ערכנו הניסויים קונאפוקלית הדמיה בשידור חי את meristem תפרחת של תודרנית ו את צמח meristems מ עגבניות וגם סויה. זה מחקר, תודרנית אקוטיפ לנדסברג זקופה, עגבניות לדבורי מיקרו-טום, סויה לדבורי וויליאמס 82 שימשו כדוגמאות.
ראה בחלק אורתוגונלית דרך האמצע של תודרנית סם, זה ברור כי PI היה מסוגל כתם על הקירות אופ...

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

לירות meristems apical לשלוט צמיחת הצמח ורבייה. שיטה זו מסייעת לנו לחקור את המורפולוגיה והמבנים הפנימיים של ירי מריסטמים אפיים לא רק במין המודל אלא גם בגידולים שונים. טכניקה זו היא הליך יעיל מאוד.לירות meristem apical ניתן לדמיין ישירות ברזולוציה תאית גבוהה ללא כל קיבעון מדגם עתיר עבודה וצעדי חתך רקמות. ראשית, לגדל ערביידופסיס, עגבניות, וצמחי סויה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. חותכים את תפרחת לירות איפקס מצמחי Arabidopsis מוברגים.החזיקו את החלק הבסיסי של הגבעול הראשי, ולהשתמש במקלות כדי להסיר כמה שיותר איברי פרחים ישנים ככל האפשר מהגזע הראשי. המשך להסיר את שאר הפרחים בשדה של מיקרוסקופ סטריאו עד meristem apical לירות ניתן לראות מן העיניים. כדי לצפות בצמחייה לירות meristems apical מעגבניות או סויה, לנתח את הקוטילדונים, עלים, ושורשים מן הצמח.החזיקו את ההיפוקוטילים של הצמח מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, ולהשתמש במטסים כדי לנתח עוד יותר את העלים ואת פרימורדיית העלים המכסים את הריסתם הצמחית. פיפט 50 מיקרוליטרים של תותח פרופידיום יודיד בצלחת פטרי נקייה וריקה. טובלים את כל איפקס היורה המנותק לצבע במשך שתי דקות.במהלך תהליך הכתמים, לטבול את כל תפרחת לירות meristem אפית או וגטטיבי לירות meristem אפית לתוך פתרון יודיד פרופיד כדי להשיג כתמים אחידים. שוטפים את איפקס הירי המוכתם פעמיים במים סטריליים, דה-מיונים. עכשיו, לנקב חור במרכז צלחת הדמיה מוכנה באמצעות מדפים, ולתקוע את היורה מוכתם זקוף במדיום.ממלאים את צלחת ההדמיה במים סטריליים, deionized לטבול לחלוטין את המדגם. הצג את הדגימה דרך מיקרוסקופ הסטריאו. פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר לכודות סביב מריסטם.לאחר מכן, להתאים את הזווית של הגבעול ב agar כדי לוודא כי meristem apical לירות גלוי לחלוטין מלמעלה. עכשיו, מניחים את צלחת ההדמיה על שלב הדגימה של מיקרוסקופ הקונפוקל. מנמיך את עדשת טבילת המים, ומרים את שלב דגימת המיקרוסקופ כדי לאפשר לקצה העדשה לטבול במים.פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי, ולהשתמש ב eyepieces כדי לאתר ולהתמקד meristem apical לירות בשדה הבהיר. הפעילו את פונקציית הרכישה בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקל. הפעל את המצב החי כדי להציג את הדגימה ממסך המחשב והגדר את כל הפרמטרים לניסוי סריקת הלייזר.בעת התאמת הפרמטרים, השתמש בפונקציה מחוון טווח כדי להגדיר אם האות רווי או לא. אותה תוכנה ששימשה לרכישת דימות יכולה לשמש להדמיה של הקרנה שקופה תלת-ממדית. פתחו את קובץ הקונפוסל המקורי, לחצו על תפריט תלת-מימד ובחרו 'שקוף' ליצירת תצוגת הקרנה תלת-מימדית.לחלופין, בחרו 'שקיפות' להתאמת שלושה פרמטרים של ההקרנה, כולל 'סף', 'שיפוע' ו'מקסימום' לשקיפות התמונה תלת-מימדית. כעת, בחרו 'אור' להתאמת הבהירות של התמונה תלת-מימדית. יצא את התמונות המוקרנות ושמור אותן כקבצי TIFF.להצגה חזותית של תצוגת קידוד העומק של התמונות תלת-מימדיות, השתמש באותה תוכנה. שוב, לחצו על 'תלת-מימד' ובחרו 'מראה'. בחרו 'מיוחד' ובחרו 'קידוד עומק'.יצא את התמונות המוקרנות ושמור אותן כקבצי TIFF. תמונה זו מן החלק orthogonal דרך אמצע Arabidopsis לירות מריסטם apical מראה כי הקירות האופקיים מוכתמים יודיד פרופיד כמעט בכל התאים בשכבות תאים מרובים. מבט על קטע רוחבי אחד דרך הקורפוס של תפרחת לירות מריסטם apical מראה כי התאים ממישור XY הם גם בתמונה ברורה.תצוגת ההקרנה תלת מימדית מגלה כי מריסטם תפרחת יוצר מבנה דמוי כיפה ומוקף פרימורדיה הפרח המתפתחת. תמונה זו מן החלק orthogonal דרך אמצע העגבניות לירות מריסטם אפית גם מראה כי הקירות האופקיים מוכתמים יודיד פרופיד בשכבות תאים מרובים, אם כי אות יודיד פרופיד מאזור הפנים העמוק הוא מעט נמוך יותר. תמונה מקטע רוחבי אחד דרך השכבות העמוקות של מריסטם האף הצמחי חושפת את התאים ממטוסי ה- XY ואת הגבול שנוצר בין מריסטם הצמחי לפרימורדיית העלים.תצוגת ההקרנה תלת מימדית יכולה לספק תצוגה מקיפה של הצורה והארגון של מריסטם הצמחי מעגבניות. מוצג כאן הוא נוף אורתוגונאלי דרך אמצע מריסטם פולי סויה לירות apical והקרנה 3D של מריסטם אפית לירות אותו. גם מריסטם הצמחי דמוי הכיפה ופרימורדיית העלים החדשים הנגזרים שלו ניתנים לצפייה.Propidium יודיד יכול בקלות כתם תאים פגומים או מתים, אשר ישפיעו מאוד על איכות התמונות, ולכן חשוב למנוע כל נזק פיזי בעת הכנת לירות דגימות מריסטם apical.

confocal-live-imaging-shoot-apical-meristems-from-different-plant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

למד הדמיה חיה של מריסטמות פסגה בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים ללא הכנה מורכבת של דגימות.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

גלה סרטונים נוספים