הפרוטוקול הרומן ליצירת תאי הדנדריטים הפיזיוגניים האימונולוגיים

תאים פיזיולוגיים המציגים אנטיגן, הנוקטים PhDC, הם מתגי המאסטר החיסוניים היוזמים חסינות וסובלנות של תאי T ספציפיים לאנטיגן. מאמר זה מתיעד שיטה יעילה לייצור PhDC. שימוש קליני בתאים דנדריטיים נפגע על ידי שיטות ציטוקינות לא פיזיולוגיות המשמשות לייצורם.

השיטה שלנו מתגברת על בעיה זו באמצעות איתות טסיות דם יעיל של המרת מונוציטים ל DC בבני אדם ועכברים. PhDC אלה אינם תלויים במצבי ציטוקין לא זמין vivo, כך שהם יכולים ליצור תגובות חזקות נגד גידולים קליניים T תאים בבני אדם ועכברים עם סרטן הוקמה. חניכת טסיות דם עצמאית למינים של התבגרות מונוציטים לדוקטורט יש יש ישימות ניסיונית רחבה.

PhDC להתיר ניתוח של פיזיולוגיה של תאים דנדריטיים, להקל אינדוקציה של חסינות אנטי סרטנית טיפולית לסרטן אימונוגני, ולהציע הבטחה לחיסון מיקרוביאלית אישית. מערכת ניסיונית זו היא חדשנית, היבטים רבים של זה כגון ציפוי של תא הפלסטיק, טיפול בתא הגידול עם 8-MOP / UVA, תנאי זרימה, ושחרור של מונוציטים מיוצגים בצורה הטובה ביותר מבחינה ויזואלית. הדגימה של ההליך תהיה איב רובינסון, טכנאית מהמעבדה שלי.

כדי לאסוף תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים, הגדר תחילה צינור 15 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של מדיום בידוד לימפוציטים לכל חמישה עד עשרה עכברים דיממו. ואז לאט דם שכבה שנאסף מעכברים נושאי גידול על גבי המדיום. סובב את התאים ב- 1, 000 ל- 1, 500 פעמים-G במשך 20 דקות כדי להפריד את המחשבים לתאי דם אדומים.

בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את שכבת הפלזמה העליונה, משאיר 0.5 מיליליטר שנותרו מעל מעיל באפי, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, לאסוף את שכבת מעיל באפי לתוך צינור נקי 15 מיליליטר מלא PBS ל 15 מיליליטר, ולסובב ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמה סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את PBMC. בסוף הצנטריפוגה, בזהירות pipette את supernatant ולהעיף את הצינור כדי לעכל מחדש את גלולה.

לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של חיץ תות תות שדה אדום ACK לצינור כדי להסיר את כל תאי הדם האדומים שנותרו מן PBMC. הדגירה PBMC על הקרח במשך 10 דקות. מלא את הצינור עם PBS ל 15 מיליליטר, ולסובב למטה ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמה סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את PBMC.

בזהירות pipette את supernatant ולהעיף את הצינור כדי לשחרר את גלולה. תן שימוש חוזר לכדור ב-300 מיקרוליטרים של FBS. כדי להכין YUMM1.7 תאים סרטניים לכל קבוצת טיפול, תחילה resuspend גלולת תא הגידול ב- FBS ב 2.5 מיליון תאים לכל 300 microliters.

עם אורות מכסה המנוע של תרבות הרקמות כבויים, הוסף 8-methoxypsoralen לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר להשעיה תא הגידול YUMM1.7. לאחר מכן, מערבבים את התאים, עוטפים את מיכל התא בנייר כסף, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי לצפות מראש צלחת תרבות רקמות 12 היטב, להוסיף מיליליטר אחד של FBS ל באר אחת עבור כל קבוצת טיפול של חמישה עכברים, ומקררים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, מתחת למכסה המנוע של תרבות הרקמה, הסר את FBS מה בארות, והוסף 300 מיקרוליטרים של תאים סרטניים שנחשפו למתוקסיפסאורלן לכל באר. לאחר מכן חשוף את הלוח המכיל את התא לאולטרה סגול מחומם מראש מקור אור להקרנה מוחלטת של ארבעה joules לס"מ מרובע. כדי לאסוף תאים סרטניים 8-methoxypsoralen / UVA מטופלים מכל באר, מערבולת את הצלחת ואת פיפטה בזהירות כדי להבטיח התאוששות התא מלא.

כדי לבצע מעבר צלחת טרנסאימוניזציה עבור כל קבוצת טיפול של חמישה עכברים, לשלב 300 microliters של PBMC המתאים 300 microliters של 8-methoxypsoralen / UVA שטופלו בתאי גידול בצינור חרוט 1.5 מיליליטר ולערבב את התאים. לאחר מכן, פתח את מהדקי צינורות הכניסה והיציאה של צלחת TI. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי למלא את צינורות TI עם FBS, סגירת המהדקים כמו צינורות מלא כדי לשמור על FBS בתוך הצינור.

נתק את המזרק. מניחים טיפ פיפטה P1000 בבטחה לתוך צריכת צלחת TI. החזק את הצלחת בזווית של 45 מעלות ומלא את הצלחת לאט עם PBMC ותערובת תאים סרטניים, הימנעות בועות.

הסר את קצה פיפטה מן הצריכה לפני שחרור הבוכנה פיפטה. החזר את התאים הנותרים לצינור חרוט 1.5 מיליליטר. חממה צינורות מלא FBS, צלחת TI מלא תאים, ואת הצינור חרוט 1.5 מיליליטר המכיל את התאים הנותרים באינקובטור תרבות הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, שחררו את המהדקים ורוקנו את צינורות TI בכוח הכבידה. לאחר מכן הכנס קצה פיפטה P1000 עם הבוכנה מדוכאת לתוך יציאת הצלחת כדי להסיר את התאים מצלחת TI. החזק את הצלחת בזווית של 45 מעלות ומלא את קצה פיפטה P1000.

שים תאים בחזרה לתוך הצינור המקורי שלהם 1.5 מיליליטר חרוט. כדי להפעיל את לוחית ה- TI, חבר את צינור היציאה לצלחת ואבטח את לוחית ה- TI למערכת ריצת הלוח. לאחר מכן, באמצעות מזרק מיליליטר אחד, לצייר את אלה 600 microliters של PBMC ותערובת תאים סרטניים מצינור חרוט 1.5 מיליליטר.

חבר את המזרק לצינור הכניסה עם המהדק פתוח, ולאט לאט למלא עד נוזל מגיע לסוף הצינור. חבר את הקצה החופשי של צינור הכניסה לצלחת TI והמשך לטעון בעדינות את אמצעי האחסון הנותר. סגור את מהדק הכניסה בסיום.

נתק את המזרק המיליליטרי וחבר את צינורות הכניסה למשאבת המזרק. אבטחו את צינור היציאה לצינור חרוט נקי של 1.5 מיליליטר לאיסוף תאים. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.09 מיליליטר לדקה.

הטה את צלחת TI כ-30 מעלות לכיוון צד משאבת המזרק באמצעות פלטפורמת ריצה של לוח TI. שחררו בזהירות את המהדק על צינורות הכניסה. התחל את משאבת המזרק, תוך התבוננות בזהירות כיצד צלחת TI מתמלאת.

לאחר צלחת TI מלא לחלוטין, להטות אותו כ 30 מעלות בכיוון ההפוך כפי שהוא מתרוקן. כאשר כל התאים בנוזל נמצאים בצינור איסוף חרוט 1.5 מיליליטר, לעצור את המשאבה. כדי לשטוף את צלחת TI, לנתק את צינורות הכניסה ממשאבת המזרק, ולחבר אותו מזרק אחד מיליליטר מלא 600 microliters של FBS.

מלא עד ש- FBS ייטען במלואו. לאחר מכן נתק את המזרק והצמד את הצינור למשאבת המזרק. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.49 מיליליטר לדקה.

שחרר את מהדק הכניסה, ולהפעיל את צלחת TI, איסוף לשטוף באותו צינור חרוט 1.5 מיליליטר. לחץ או הקש על צלחת TI בעדינות כל הזמן כדי לסייע בניתוק ו eluting כל התאים חסידים כמו הלוח מתרוקן. נתק את האוסף צינור חרוט 1.5 מיליליטר מהגדרת לוח TI.

סובבו את צינור האיסוף במיקרופוגה על הספסל ב-250 פעמים במשך שמונה דקות והשליכו את העל-טבעי. כדי לבצע דגירה שותף לילה של PBMC עם אנטיגן, תחילה להשתמש מחדש את PBMC ואת גלולת תא הגידול בשני מיליליטר של RPMI ברור בתוספת 15% סרום עכבר אוטולוגי. ואז תאי צלחת בצלחת סטרילית שאינה רקמות 35 מ"מ שטופלו, ו דגירה לילה בתנאים סטנדרטיים של תרבות רקמות.

ביום שלמחר, בזהירות לנתק את כל התאים חסידים מתחתית המנה עם מגרד תרבות רקמות. סובב את המנה תוך כדי גירוד כדי להבטיח איסוף תאים שווה. לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר.

מוסיפים שני מיליליטר של PBS לצלחת, וחוזרים על שלב הגירוד, אוספים את התאים לאותו צינור. שוטפים את המנה 35 מילימטר עם מיליליטר אחד של PBS, ומוסיפים את לשטוף לאותו צינור. לסובב ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמות סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את התאים.

בזהירות פיפטה את supernatant, ולאחר מכן להעיף את הצינור כדי לעכל מחדש את גלולה. הטיפול הראה ירידה של צמיחת הגידול YUMM1.7 ביותר מ -100 עכברים מטופלים לעומת עכברי בקרה, כפי שנצפה בשנת הגידול המצטבר של תשעה ניסויים עצמאיים שנערכו במשך שנתיים. עקומות הגידול הייצוגיות לבעלי חיים בודדים בניסוי אחד מספקות תחושה של שונות במערכת.

כאשר מונוציטים או טסיות דם מתרוקנים מהשבר PBMC, או כאשר מעבר צלחת מושמט, האפקט הטיפולי אינו נצפה עוד. הטיפול אינו יעיל בהיעדר תאי החיסון או מקור אנטיגן, או בנוכחות אנטיגן לא תואם, כגון גידולים YUMM1.7 שטופלו בתאי קרצינומה של המעי הגס MC38. לקבלת תוצאה חיסונית, זה גם קריטי כדי למנוע חשיפה PBMC 8-methoxypsoralen.

ניתוח FACS של שינוי סמנים שצוינו מפקדי IgG תואמים בתאי CD11c + אנושיים בין PBMC מבודד טרי, PBMC שטופלו TI, PBMC שטופלו TI ללא מעבר טסיות, טסיות דם מרוקנות לפני מעבר טסיות הדם, או שניהם לעיל, הראו כי הפעלת DC תלויה בנוכחות טסיות דם ב- PBMC, ועל מעבר טסיות TI. מחשבי ה-DCs האנושיים המופעלים על-ידי TI יכולים לעבד ולהציג ביעילות אנטיגנים פפטידים, או אנטיגנים מתאי גידול אנושיים שלמים שנחשפו על-ידי 8 מתוקסיפסורלן כדי להפעיל קווי תאי T ספציפיים לאנטיגן אנושיים במבחנות חוץ-חוץ-זיונות באופן תלוי TI וטסיות דם. הספציפיות של תגובות תאי T תלויה במקור האנטיגנים המעובדים.

כאשר גרימת חסינות נגד סרטן, אפופטוזיס של כל קו תאים סרטניים חייב להיות titrated כדי למקסם את האימונוגניות. מכיוון שחסינות המושרה תהיה ספציפית לחיסון אנטיגנים, יתאפשר ניתוח מפורט של כל מערכת. כל סרטן ניסיוני או קליני, וכל תגובה מיקרוביאלית, יהיה אינפורמטיבי באופן ייחודי.

לכל סרטן אנושי יש מערך משלו של אנטיגנים ספציפיים לגידול. הדוקטורט מבצע את המיון וההצגה הדרושים של אנטיגנים סרטניים, ללא צורך בזיהוי המעבדה הקודם שלהם. אנא זכור כי 8-MOP ואור UVA הם חומרים מסרטנים.

השתמש בציוד מגן מתאים ובצע נהלי בטיחות בעת טיפול ב- 8-MOP ובעבודה עם מקורות אור UVA.