חוקרים למרכזי נבטי Autoreactive בודדים על-ידי Photoactivation במודל של Chimeric מעורבת של מחלת חיסון עצמי

מודל כימרי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה של מרכזי נבטים אוטואקטיביים ספונטניים מאפשר קישור של לוקליזציה תאית ב vivo עם ניתוחים מולקולריים במורד הזרם. היתרון העיקרי של המודל הכימרי המעורב של מרכזי נביטה אוטו-רטרואקטיביים הוא אופיו הרב-תכליתי ושולי, המאפשר חקירה של כמעט כל תת-קבוצה תאית רצויה או מסלול מולקולרי. הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל זה של התפתחות מחלות אוטואימוניות מאפשרת תובנות חדשניות שעשויות לסייע בקידום טיפולים חדשים.

מודל כימרה מח עצם זה יכול לשמש אימונולוגיה, אימונו-אונקולוגיה, ומחקר תאי גזע. רכיב photoactivation יש שימוש נרחב, כפי שהוא מקשר לוקליזציה רקמות לניתוח תאים במורד הזרם. הכנת מח העצם ו reconstitution ו in vivo תיוג וצעדי תיעוב רקמות הם כל הליכים מורכבים מבחינה טכנית להשאיל את עצמם היטב הדגמות חזותיות.

כדי לחלץ את התורם 564Igi עצם הירך ו tibia עכבר, להסיר את העור מאיבר אחורי אחד, ופופ החוצה את מפרקי הברך והקרסול על ידי משיכת הרגל בכוח. המשך לשבור את מפרק הקרסול. לאחר מכן, למשוך את הרגל לכיוון הגוף תוך החזקת השוקה, ובכך הפשטת הגידים והשרירים מן השוקה.

לשבור את מפרק הברך כדי לשחרר את השוקה, ולמשוך את העצם לכיוון הגוף תוך החזקת עצם הירך כדי להסיר את הגידים והשרירים מעצם הירך. לאחר מכן, לעשות חתך במפרק הירך, לחתוך את הגידים לפני משיכת עצם הירך מתוך ארובת הירך. לאחר הסרת עצמות הגפיים האחוריות ההפוך באופן דומה, בזהירות לשפשף את העצמות עם מגבת נייר גסה כדי להסיר את כל השרירים הנותרים ואת רקמת החיבור, ולשטוף את העצמות המופשטות במאגר מח עצם קר כקרח.

לאחר מכן, השתמש בדומונט מספר שבע מדפים כדי להעביר את העצמות למיכל של חיץ מח עצם טרי על קרח. כדי לחלץ את תאי מח העצם, יש לשטוף מרגמה במאגר מח עצם קר כקרח, ולהשתמש בפיפלטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להחליף את חיץ הכביסה ב-10 מיליליטר של חיץ מח עצם טרי וקר כקרח. השתמש במקלות כדי להעביר את העצמות למרגמה, ולהשתמש עלה למחוץ ולטחון את העצמות כדי לשחרר את מח העצם.

השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי לאסוף את תמצית מח העצם לפני העברת פתרון מח העצם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, שטפו את המרגמה עם 10 מיליליטר נוספים של חיץ מח עצם טרי וקר כקרח כדי להבטיח התאוששות מלאה של התאים. כדי להכין את המתלים התורם, לערבב את הכרכים המתאימים של GFP photoactivatable ו 564Igi מח תורם בצינור חרוט 50 מיליליטר, ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה.

תעבירו מחדש את גלולת התא המעורב בריכוז של פי 10 לשמונה התאים למיליליטר של חיץ מח עצם קר כקרח, והעברו את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר נמען CD45.1 הרדמה, ולהעיף את הצינור של תאי מח עצם התורם כדי להבטיח התעצמות נאותה. לטעון 200 microliters של מח עצם לערבב לתוך אחד 0.3 מיליליטר, 30-מד מזרק אינסולין, ו, עם המטופל בצד שלה, בעדינות למתוח את העור מעל ומתחת לעין כדי לפוצץ מעט את העין החוצה.

בזהירות להכניס את קצה המזרק בזווית משוערת של 30 מעלות לתוך החלק הקדמי של ארובת העין, דואג למנוע את העין ואת הרקמה שמסביב. כאשר קצה המחט נוגע בעצם הממחה מדגיש את ארובת העין, לסגת המחט על 0.5 מילימטרים לפני השימוש בלחץ יציב להזריק לאט את מח העצם התורם. לאחר מכן, להחזיר את העכבר לכלוב שלה עם מים אנטיביוטיים עד ליביום, עם ניטור עד החלמה מלאה.

כדי לתייג את צומת הלימפה popliteal, לדלל שני microliters של נוגדן נגד עכבר עכברים phycoerythrin שכותרתו נגד עכבר CD169 ב 18 microliters של PBS, ולהוסיף שתי טיפות 10 מיקרוליטר של הנוגדן על פיסת סרט פרפין פלסטיק. לטעון כל טיפה לתוך מזרק אינסולין יחיד 0.3 מיליליטר עם מחט 30-מד, ולהזריק 10 microliters של נוגדן לתוך footpad של החיה הנמען הרדמה. לפני קצירת בלוטות הלימפה, מניחים כיסוי מרובע על משטח שטוח, ולהשתמש מזרק טעון שומן ואקום, חמישה מיליליטר כדי לעקוב אחר הקצוות של coverslip עם גריז על אחד עד שני מילימטרים מכל קצה.

מעבירים את התא למשטח קר ושטוח, וממלאים את תא השומן בוואקום עם חיץ מח עצם קר כקרח. כדי לגשת לבלוטות הלימפה הפופליטיות, השתמש במספריים ישרים עדין כדי לבצע חתך בעור ממש מתחת לבור הברך של החיה המטופלת המתת חום, ולהרחיב את החתך כלפי מעלה לאורך קו מיתר הברך כמעט עד מפרק הירך. באמצעות מדפים מספר חמש או מספר שבע של Dumont, משוך כל אחד מהמדפים החשופים של העור כלפי חוץ כדי לחשוף את הרקמה באפוסה הפופליטית, ולהשתמש במטסות כדי להיכנס בזהירות לפוסה רק מדיאלי לווריד הפופליטי.

פתח וסגור את המלקצופים לאורך ציר הרגל כדי לחשוף את בלוטות הלימפה הקדמיות הבסיסיות לפני השימוש באגודל ובאצבע המורה כדי לצבוט את שריר הארבע ראשי מהצד הקדמי קרוב לברך, כדי להוציא את בלוטות הלימפה מהפוסה. החלק את המדפים מתחת לצומת הלימפה כדי לשחרר את הצומת מהרקמות שמסביב, והצב אותו בתא השומן בוואקום. לאחר צומת הלימפה השני נאסף, מניחים כיסוי שני על שפת שומן ואקום, ולחץ למטה בעדינות כדי לסגור את התא, דואג להחדיר את כל בועות האוויר.

כדי לזהות את המרכזים הנבטיים בדגימות רקמת טחול שנקטפו, מניחים את תא ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני פוטון, ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק 3.5 מיליליטר למקם טיפה של מים מזוקקים על גבי coverslip העליון. מנמיך את המטרה עד לנקודת המגע, ולהשתמש באור המועבר כדי להתמקד בחלק העליון של הרקמה. עבור למצב כהה ו עירור שני פוטון, ולכוונן את הלייזר ל 940 ננומטר.

אתר את האזורים הלבנים-עיסתיים הבודדים הגובלים בכתמי CD169 ליד פני השטח של הרקמה, וזהה את נדן הלימפה פריארטריון על ידי דור ההרמוניות השני הקשור לעורקים המרכזיים. באזור שבין נדן הלימפה periarteriolar לבין האזור השולי, לזהות את הנוכחות של autofluorescent מאוד, מופעל גוף גוף דביק מקרופאגים, באמצעות ציוני דרך אלה, לצייר אזור עניין סביב אזור מרכז נביטה אחת. לאחר מכן, להגדיר ערימת Z של סביב 100 כדי 150 מיקרומטר לעומק, החל מפני השטח של הרקמה באמצעות גודל צעד של כשלושה מיקרומטרים לפני המעבר לאורך גל בעירור 830 ננומטר.

כבה או עמעמם את כל הערוצים כדי למנוע צילום לגלאים, וצלם את הערימה. לאחר מכן, חזרו לאורך הגל של עירור 940 ננומטר ופתחו מחדש את הערוצים, סורקים דרך הערימה כדי לאשר פוטו-אקטיביזציה יעילה והיעדר פוטו-הלם לאורך ערימת התמונות. Serotyping של כימרות מח עצם מעורב חושף מספרי תא B מנורמל בשישה שבועות לאחר התחדשות, עם תדירות נמוכה של 9D11 חיובי במחזור B תאים נגזר תא 564Igi.

בתוך שער הלימפוציטים הכולל, היה תדירות נמוכה של תאים שמקורם במקבל שיורית, כ -6% מהם נגזרים CD45.1, המציין דרגה כוללת של כימריזם של כ 94%, היה כימריזם כמעט מלא בתא התא B ושליטה של תאים GFP עצם photoactivatable נגזר B, תוצאה של הבחירה השלילית הכבדה של 564Igi נגזר B תאים. כפי שנצפה, תיוג vivo עם CD169 מאפשר הדמיה חזקה של האזור השולי. אות ההרמוניקה השני ניכר באלמנטים מבניים המכילים קולגן וכלי דם עיקריים, כולל העורק המרכזי של נדן הלימפה periarteriolar ו autofluorescent מאוד, מופעל גוף מעופש מקרופאגים הקשורים לפעילות המרכז הנבטי.

יחד, נתונים אלה מאפשרים זיהוי של אזור מעניין שסביר להניח ש מכיל מרכז נבטים יחיד, פוטואקטיבי. הערכה ציטומטרית של זרימה במורד הזרם מאשרת עוד יותר את נוכחותם של מספרי תא B מנורמלים, אוכלוסיית מרכז נביטה ספונטנית, ותת-קבוצה של תאי מרכז B נביטתיים פוטואקטיביים. חשוב להגביל את זמן התפנית הכולל של שלבי הסברה, פוטואקטיביזציה ועיבוד רקמות לארבע עד שש שעות כדי להבטיח כדאיות מספקת לתאים.

התאים המנויים יכולים להיות ממוינים בזרימה וחשוף לריווח של תא יחיד, למשל, לאפיין את רפרטואר קולטן התא B של מרכז נביטה יחיד. מודל הכימרה המעורב איפשר לחקור ביולוגיה של מרכז נביטות אוטואקטיבי בעומק חדש, למשל, ולספק תובנה כיצד תהליך התפשטות האפיטופ מתפתח. שים לב כי מקור האור עבור מיקרוסקופיה שני פוטון הם לייזרים חזקים מאוד פעימות Class 4 שיכולים לגרום נזק חמור לעיניים.