חקירת שינויים Caecum Microbiota לאחר פציעה טראומטית במוח עכברים
19 בספטמבר 2019
מוצג כאן הוא פרוטוקול לגרום לטשטוש פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מכשיר הקשה לרוחב הכלי נקישה ואחריו אוסף של תוכן caecum לניתוח microbiome בטן.
בו זמנית ואת הקווים אינטראקציות בין המוח המיקרוביוטה במעיים נשאר לא ידוע. השתמש בטכניקה זו, ניתן לבחון שינויים במיקרוביוטה במעיים לאחר פגיעה מוחית טראומטית בעכברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה ויעילה יחסית.
הדגמת ההליך תהיה וונדונג אתה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. עבור אינדוקציה פגיעה מוחית טראומטית, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה, ולהחיל משחה על העיניים של החיה. לאחר הגילוח, יש לחטא את עור הקרקפת החשוף ב-70% אתנול לפני שהוא חוטף את הקרקפת במישור קשת.
באמצעות מדפים, לסגת החתך משני הצדדים, ולהפריד את periosteum מעט. השתמש בסמן כדי לצייר עיגול בקוטר שלושה מילימטרים על האזור הקוקודי הימני של הגולגולת במרחק שני מילימטרים מקוו האמצע. השתמש במקדחה חשמלית כדי לחדור בזהירות את הגולגולת מבלי לפגוע בדורה.
הסר את דש העצם כדי לחשוף חלון עצם של שלושה מילימטרים ולהמקם צינורית פגיעה פלסטית מעל הגולגולת. לאחר ביצרו את הגולגולת עם אקריליק דנטלי, השתמשו במזרק של חמישה מיליליטר כדי למלא את ה cannula עם מלוחים סטריליים 0.9% נורמלי, דואגים להימנע בועות. הפעל את אוסצילוסקופ ומגבר.
ודא כי הצינור בלחץ גבוה של התקן פגיעה בכלוב נוזלי רוחבי הוא ללא בועות אוויר, ולספק כ 10 פולסים הבדיקה, עד המכשיר נותן אות יציב. כוונן את זווית נקודת ההתחלה של המטוטלת כדי להגיע לעוצמת דופק של כשני אטמוספרות סטנדרטיות ולחבר את חונת הפציעה למכשיר הפגיעה בנוזלים הצדדיים. לחץ על ההדק כדי לשחרר את המטוטלת, גרימת פגיעה מוחית.
ואז להשיג ולהעביר דופק לדורה דרך כל סגור, מערכת צינורות מלא נוזלים. לאחר אינדוקציה פגיעה מוחית, להסיר את cannula ולתפור את החתך. לאחר מכן מניחים את העכבר על משטח חימום עם ניטור עד שהוא אמבולטורי, לפני החזרת החיה לכלוב הבית שלה עם גישה עד ליביום למזון ומים.
בנקודות הזמן הניסיוניות שצוינו, לחשוף את המעיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולהשתמש מדפים אטראומטיים להפריד בעדינות את caecum ממערכות מעיים אחרות. כאשר הרקמה אותרה, לחתוך את caecum עם מספריים חדים באופן ידני לחלץ את תכולת caecum על רוטב סטרילי. לאחר מכן להעביר את התוכן לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס עד ניתוח מיקרוביום.
ריצוף דנ"א רקומביננטי 16S מדגים מגוון מופחת של מיקרוביוטה caecum בעכברים שלושה ימים לאחר פגיעה מוחית טראומטית, עם taxa הנפוץ ביותר בתוך התוכן caecum של קבוצות פגיעה מוחית מזויפת וטראומטית המוצגים באיור. יתר על כן, קנה מידה רב-מיתי לא מטרי חושף שינויים בהרכב המיקרוביוטה של caecum לאחר פגיעה מוחית טראומטית. זכור לשמור על דורה שלם בעת קידוח הגולגולת, כדי להיות עדין בעת איתור והפרדת caecum ממערכות מעיים אחרות.
בעקבות הליך זה, המטוקסילין וכתמי אאוסין וניתוח ניתן לבצע כדי לבחון את השינוי ההיסטולוגי ואת התגובה הדלקתית בתוך מערכת העיכול לאחר פגיעה מוחית טראומטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להשראת פגיעה מפושטת במוח (TBI) באמצעות מכשיר פרקוסיה נוזלית לטרטלית בעכברים. בעקבות הפגיעה, המחקר בוחן שינויים במיקרוביוטה של המעי על ידי איסוף תכולת העקום לצורך אנליזה. גישה זו שואפת להשקיף על האינטראקציות בין פגיעה מוחית לבין הרכב המיקרוביוטה של המעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניתוח מיקרוביום
- מחקר פגיעות מוח טראומטיות
רקע
- הבנת הקשרים בין המוח למיקרוביוטת המעי היא קריטית במחקר של TBI.
- הידע הנוכחי לגבי האופן שבו TBI משפיע על מיקרוביוטת המעי הוא מוגבל.
- השימוש בעכברים כאורגניזם מודל מאפשר תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להשראת TBI וניתוח השינויים העוקבים במיקרוביומ המעי.
- בדיקת מתאמים פוטנציאליים בין פגיעה נוירולוגית לבין גיוון מיקרוביוטת המעי.
- אספקת תובנות לגבי ההשפעות של TBI על הבריאות הכללית ועל אינטראקציות במיקרוביומ.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- השתמשו במכשיר פגיעה צידית (lateral fluid percussion device) כדי להשרות TBI בעכברים שהורדמו.
- בוצעו הליכים כירורגיים מדויקים, כולל חדירה לגולגולת והשתלת קנולה.
- לאחר הפגיעה, נדגמו תכני העקום (caecum) לצורך ניתוח המיקרוביום ונשמרו באופן מתאים.
- בוצע ריצוף 16S rDNA כדי לקבוע שינויים במגוון ובהרכב המיקרוביוטה.
תוצאות עיקריות
- הניתוח הצביע על ירידה במגוון המיקרוביוטה של העקום בתוך שלושה ימים לאחר TBI.
- סקאלינג רב-ממדי לא-מטרי (Non-metric multidimensional scaling) הדגים שינויים משמעותיים בהרכב המיקרוביוטה בעקבות הפגיעה.
- המחקר מדגיש את הצורך בזהירות בעת טיפול ברקמות ושמירה על תנאים סטריליים.
מסקנות
- מחקר זה מבסס מתודולוגיה לבחינת ציר המעי-מוח בהקשר של TBI.
- הממצאים מצביעים על כך ש-TBI עלול לשבש את מיקרוביוטת המעי, דבר שעשוי להיות בעל השלכות על ההחלמה.
- הרחבת הידע בנוגע לאינטראקציות בין המעי למוח עשויה להנחות אסטרטגיות טיפוליות עתידיות עבור TBI.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של ציר המיקרוביוטה-מעי-מוח במחקר של פגיעות מוח טראומטית, על ידי אספקת מודל הניתן לשחזור להערכת שינויים במיקרוביום לאחר הפגיעה. הוא תומך בתיקוף מטרות ובגילוי סמנים ביולוגיים על ידי קישור של טראומה נוירולוגית להסתות כמותיות בהרכב המיקרוביוטה של העקום (caecum). גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים פרה-קליניים באמצעות סטנדרטיזציה של תהליכי השראת TBI ודגימת המיקרוביום.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות הנוגעות לציר מעי-מוח באמצעות מדידת שינויים במגוון המיקרוביוטה לאחר השראה מבוקרת של TBI.
- ערך תפעולי: מספק פרוצדורה כירורגית ודגימה סטנדרטית לאיסוף עקבי של מיקרוביוטה מהעקום (caecum) בין קבוצות ניסוי שונות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצרי ריצוף כמותיים של 16S rDNA לאפיון שינויים בהרכב המיקרוביום בדגימות מהמעי העיוור (caecum).
- ערך תפעולי: מבסס סבב עבודה הדיר (reproducible) לניתוח מיקרוביום, שניתן לשלבו בתהליכי סריקה עבור טיפולים המכוונים למעי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטי למחלה על ידי ביסוס קשר בין חומרת ה-TBI לבין שינויים במיקרוביומה במודל עכברי.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורך של שינויים במיקרוביוטה כדי לבסס החלטות קידום מותאמות סיכון בתוכניות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי סטנדרטיזציה של השראת TBI וניתוח מיקרוביום המעי לצורך הפחתת סיכונים של מטרה תרופתית.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות בנוגע לאינטראקציות בין המיקרוביוטה, המעי והמוח באמצעות פגיעה מבוקרת ואפיון המיקרוביום.
- סריקה: מספקת דגימות סטנדרטיות של מיקרוביוטה מהעקום (caecum), המתאימות לריצוף 16S וניתוח גיוון בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של ההרכב המיקרוביאלי באמצעות סקאלינג רב-ממדי לא-מטרי (non-metric multidimensional scaling) ומדדי גיוון.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מודלים של פגיעה נוירולוגית לבין סמנים ביולוגיים של המיקרוביום לצורך המשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה שניתן להשתמש בה שוב לחקר מודולציה של ציר המעי-מוח במודלים של מחלות נוירולוגיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקר על ציר המעי-מוח על ידי אספקת מדדי מיקרוביוטה כמותיים לאחר TBI.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של ניתוח, דגימה וריצוף.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מודלי TBI לחתימות של סמנים ביולוגיים מבוססי מיקרוביום.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המכוונות לאינטראקציות מעי-מוח בהחלמה מ-TBI.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוצדורות כירורגיות בעכברים וטיפול סטרילי ברקמות.
- תלוי בגישה למכשירי פגיעת הפרקה של נוזלים לצדית (lateral fluid percussion injury) ותשתית לריצוף 16S rDNA.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות ניתוח מדעי המוח וניתוח המיקרוביום.
- כולל שיקולי התאמה לדגימה מהעקום (caecum) בין זני עכברים שונים או מודלים שונים של פגיעה.
- מוגבל על ידי הצורך בטכניקה אספטית במהלך דיסקציה של רקמת מעי כדי למנוע זיהום.
