מבצע ספקטרוסקופיית על חלקיקי פלמונית עם מיקרוסקופ ניגוד מבוסס שידור מסוג Nomarski הפרעות דיפרנציאליות

מיקרוסקופיית DIC עדיפה על שדה כהה בהדמיית חלקיקים פלסמוניים בסביבות מורכבות. עם זאת, DIC גם דורש ידע רב יותר ומיומנות כדי להשיג תוצאות לשחזור. מיקרוסקופיה של DIC מספקת רזולוציה צידית גבוהה ועומק שדה רדוד.

שתי תכונות אלה חשובים ביותר בעת ניטור חלקיקים בתוך תאים או בסביבות מורכבות. כדי להתחיל, השתמש בעט חוכך כדי למקם סימן שריטה רדוד וקצר על מרכז כל כיסוי זכוכית, ולאחר מכן לנקות את הזכוכית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט כדי להסיר 100 מיקרוליטרים של פתרון חלקיקי זהב 05 מיליגרם למיליליטר ממכל האחסון המקורי שלו, ולהוציא את הפתרון לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות ב 6, 000 פעמים כוח הכבידה. כאשר סיים, להסיר את supernatant עם micropipette להיפטר פעילי שטח עודף מן הפתרון חלקיקים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד לצינור הצנטריפוגה.

בקצרה מערבולת המדגם כדי לשבור את גלולה, ולאחר מכן sonicate אותו במשך 20 דקות מיד לאחר מכן כדי למחזר באופן מלא את אגרגטים חלקיקים. באמצעות micropipette, dropcast שישה microliters של פתרון חלקיקים על כיסויי זכוכית ניקה ושרוט. ואז בזהירות להפוך את הכיסוי ולה מניח אותו על גבי חתיכה שנייה גדולה יותר של זכוכית מיקרוסקופ.

הירידה צריכה להתפשט במהירות באופן שווה בין שתי חתיכות זכוכית. יש לדאוג כדי למנוע מקבל בועות אוויר לכודים בין שתי חתיכות זכוכית. השתמש בקו צר של לק כדי לאטום את הקצוות של כיסוי כדי למנוע אידוי של הנוזל.

מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ, וליישר את המטרה ואת מעבים של המיקרוסקופ. התאם את המוקד כדי למצוא את מישור המוקד עם הדגימה עליו ולאתר את סימן האחסון שנוצר קודם לכן. התמקדו בו וכווננו את המיקוד עד שהננו-חלקיקים יתבוננו.

כדי לקבוע את המיקום המדויק של המרכז, השתמש בשיטת התאורה Kohler על-ידי התחלה במטרה 20x ולאחר מכן מעבר להגדלות גבוהות כגון 80 או 100x. לאחר מכן, בחר אזור מעניין בתוך המדגם להדמיה. מרכז את האזור בשדה התצוגה של המצלמה והתאם את המוקד לפי הצורך.

אם למיקרוסקופ יש את העיצוב של דה סנרמונט, התחל עם הקיטוב שנקבע קרוב להכחדת רקע מקסימלית וסובב בהדרגה את הקיטוב לקראת הפחתת הכחדת הרקע. עוצמת הרקע תגדל בהדרגה. ההגדרה האידיאלית מושגת כאשר הננו-חלקיקים מגיעים להבדל האינטנסיביות הגדול ביותר שלהם בהשוואה לממוצע הרקע המקומי.

עבור חלקיקים פלסמוניים, הניגודיות הגדולה ביותר מושגת בדרך כלל עם רקע כהה יחסית בהכחדת הרקע המרבית או בקרבתה. כבה את תאורת החדר כדי למנוע מהאור התועה לקיים אינטראקציה עם התהליך. שים במקום 10 ננומטר ברוחב מלא בחצי מקסימום פס לעבור מסנן עם אורך הגל המרכזי שלה ממוקם במשותף עם אורך גל תהודה פלסמון משטח מקומי הראשי על מנת להציג את האזור של עניין.

לאחר מכן, התאימו את עוצמת המנורה או את זמן החשיפה עד לרמת הרקע של 5%-40% מרמת הקיבולת המרבית של המצלמה. אף אובייקט באזור המעניין לא אמור להפגין עוצמות איתות העולות על 90% מרמת העוצמה המרבית של המצלמה. תדמיין את המדגם עם סדרה של מסנני מעבר פס שלכל אחד מהם רוחב מלא בחצי מקסימום של 10 ננומטר, ושכלו מאפשרים הדמיה לאורך כל טווח העניין של אורך הגל.

ודא שעוצמת הרקע בתמונות נשארת בטווח של 5% זה מזה על-ידי התאמת זמן החשיפה ולא עוצמת המנורה. לאחר החלפת מסננים, פוקוס מחדש את הדוגמה לפני לכידת תמונות. שמור את התמונות כקבצי TIFF לא דחוסים ו/או בתבנית הקובץ המקורית של התוכנה כדי לשמר את כל המידע הרלוונטי.

כדי להתחיל בניתוח, פתח את התמונה באמצעות ImageJ. השתמש בכלי המלבן כדי לצייר מלבן מסביב לאזור העניין הראשי. לאחר מכן בסרגל הכלים, בחר תמונה, עבור לשינוי גודל תצוגה ובחר לבחירה.

חלון ההדמיה יגדיל את התצוגה של האזור הנבחר. לאחר מכן, בחרו תמונה, עברו להתאמה ובחרו בהירות/ניגודיות. כדי לשפר את התצוגה של אזור הדגימה, התאימו את המינימום, המקסימום, הבהירות והניגודיות של התמונה.

התאמות אלה אינן משנות את הנתונים המדעיים, הן רק מאפשרות ניראות טובה יותר של אזור הדגימה. כעת, השתמש שוב בכלי המלבן וצייר תיבה סביב הננו-חלקיק הראשון שיש למדוד. התיבה אמורה להיות גדולה רק במעט מהדיסק ה אוורילי של הננו-חלקיקים.

לאחר הבחירה, עבור לניתוח ובחר מדידה. מופיע חלון חדש שמדווח על ההתעצמויות המינימליות, המרביות והרביעיות עבור הפיקסלים הממוקמים בתוך התיבה שנבחרה. שמירה על הגודל המקורי של התיבה, גרור את התיבה לאזור הסמוך מיד לחלקיק שבו ניגודיות הרקע שווה יחסית, ולא קיימים חלקיקים או מזהמים.

השתמש שוב בכלי המידה כדי לקבוע את עוצמת הממוצע עבור אזור הרקע. חזור על תהליך זה עבור כל חלקיק בכל התמונות בסדרה. לאחר מכן יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את החדות או העוצמה של כל חלקיק בכל אורכי הגל וזוויות הגל.

הזן במשוואה הבאה כדי לחשב את החדות של כל חלקיק. לבסוף, גרף את הפרופיל הספקטרלי במיקום ננו-חלקיקי נתון על-ידי התוויית נתונים עם אורך הגל לאורך ציר ה- X והניגודיות או העוצמה לאורך ציר ה- Y. כדי לקבוע את הגדרת ההדמיה האופטימלית, ננוספרות זהב אלה דימויו במספר הגדרות מקטב.

באפס מעלות, החלקיקים מופיעים בעיקר לבנים עם פס כהה רץ על פני החלק האמצעי שלהם. זה מעיד על קיטוב צולב לדגימות ננוספרה. כאשר הקיטוב מסובב זוויות שונות, החלקיקים מטילים צללים כהים לכיוון פינה אחת.

עם זאת, ערכי ניגודיות החלקיק משתנים באופן דרמטי. עבור מדגם זה, הגדרת ההדמיה האופטימלית היא עם הסטת מקטב של 10 מעלות. כאן אורך הגל הוא התווה נגד ניגודיות של ננוספרות זהב.

כל נקודת נתונים מייצגת בממוצע 20 ננוספרות עבור כל קוטר חלקיקים. ניגודיות השיא של כל חלקיק משתנה מעט בהתאם לגודלו. האינטנסיביות והסיבוב חשובים עוד יותר עם צורות אניסוטרופיות כגון ננורוד זהב זה.

כאן אורך הגל מותווה כנגד עוצמה בשתי הגדרות קיטוב שונות. בכל מקרה, האינטנסיביות של הצד החיובי הרבה יותר חזקה משל הצד האפל. פרופיל האינטנסיביות של ננו-רוד זהב יחיד באורך הגל המקומי של תהודה פלסמון במהלך סיבוב הבמה מראה הבדל בעוצמה גדולה בין הצדדים הכהים והבהירים כאשר המדגם מסתובב דרך 180 מעלות.

הדמיה לדוגמה חשובה ביותר. זה דורש גם חריצות וגם סבלנות מצד המיקרוסקופ. אם אתה מבצע ניסוי הדורש שינוי הדגימה במשך סידרה של ימים, ציוני דרך כגון סימני השריטה הם קריטיים בהעתקת אזור העניין שלך.

מיקרוסקופיה DIC גדל עניין על ידי חוקרים שחוקרים חלקיקים, במיוחד בסביבות דינמיות ותאיות. מכיוון ש- DIC מציע רזולוציה מרחבית אופטימלית, במיוחד בסביבות דגימה מורכבות.