ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence
17 באפריל 2019
אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.
באמצעות שיטה זו אנו יכולים ישירות בדיקה היווצרות צינור הלב, לולאה, היווצרות תא מלא ללא מניפולציות ניסיוניות נוספות של עובר העכבר. אמנם, אנו משתמשים MLC-2v-tdTomato עכברים כדוגמה, שיטה פשוטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב עם קווי עכבר כתב פלואורסצנטי אחרים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה פשוט מאוד ואינו דורש שום טכניקות מורכבות או ציוד.
זה יכול להתבצע בהגדרת מעבדה רגילה. לאחר הזדווגות נקבה עם עכברים זכרים, שניהם MLC-2v-tdTomato 8 עד 10 שבועות, לבדוק את הסכרים עבור תקעים בנרתיק בכל בוקר. הניחו את הסכרים ההריונים, המתת דם בימים שונים לאחר הקוטום, בתמרורי סופין וריסוס הבטן עם 70% אתנול.
השתמש מספריים כירורגיים חדים מדפים כדי לפתוח את חלל הבטן על ידי חתך של העור והן את דופן הבטן. לאחר איתור קרני רחם דו-צדדיות בחלק הגבי של חלל הבטן, הפרד את הרחם כולו באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומדפים לחתוך בזהירות מעל oviducts משני הצדדים. מניחים את הרחם כולו נותח בצלחת פטרי 10 ס"מ עם PBS קר כקרח.
באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומלקחיים, בזהירות להפריד כל שאק מי המיצוק לאורך קרן הרחם. השתמש פינצטה כדי להעביר כל עובר לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר מלא PBS קר כקרח. באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים חדים, פתח את שיכר מי המיצוק וחשוף כל עובר על ידי ניתוק חבל הטבור ולאחר מכן לקצץ רקמות עובריות נוספות ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים.
תחת מיקרוסקופ ניתוח עם מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים, לחתוך את ראשו של העובר ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר עם 100 microliters של חיץ A עבור genotyping מאוחר יותר כדי לתאם עם התוצאות של הדמיה epifluorescent. באמצעות מדפים עדין, לפתוח את החזה של העובר. עם מספריים כירורגיים חדים ומדפים, להסיר את הלב מן הריאות ואת כלי הדם.
השתמש פינצטה כדי להעביר את הלב העוברי נותק לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר עם PBS. מניחים את הצלחת עם לבבות עובריים עכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח epifluorescent. השתמש במטלות עדין כדי למקם את הלבבות העובריים כך פיתוח החדרים פונים הבוחן.
התאם את המוקד באמצעות מטרה של 0.63x במצב שדה בהיר. צלף חשיפות של שדות בהירים וללכוד תמונות מרובות. כדי לדמיין ביטוי tdTomato, כבה מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים והגדר את המסנן עבור פלואורסצנטיות אדומה.
התאימו מחדש את התמקדות התמונה במידת הצורך, התאימו את הבהירות והניגודיות, צלמו חשיפות פלואורסצנטיות אדומות ולכדו תמונות מרובות. עבור genotyping עובר, להרתיח דגימות ראש מבודדות בעבר במאגר A ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 11, 360 פעמים G.Transfer 20 microliters של על טבעי לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר עם 20 microliters של חיץ B ומערבבים.
השתמש 4.5 microliters של supernatant מעורב כתבנית DNA ולשלב אותו עם 0.5 microliters של כל אחד 10 מיקרומולרים ספציפיים קדימה והפכו פריימרים, 10 microliters של פולימראז 2x-premixed ומאגר תגובה ולאחר מכן להוסיף מים לנפח כולל של 20 microliters. הפעל PCR כמתואר בכתב היד. לטעון את התגובה הושלמה 100 סולם DNA זוג בסיס על 1% ג'ל agarose ולהפעיל ב 140 וולט ב 1x TAE חיץ במשך 25 דקות.
מניחים את הג'ל שהושלם על טרנסילומינטור UV ולהדליק את אור UV כדי לזהות את להקות DNA. MLC-2v נחשב הסמן המוקדם ביותר עבור מפרט התא חדרי במהלך התפתחות הלב. ב MLC-2v-tdTomato כתב לדפוק בעכברים, ביטוי חלש יחסית של tdTomato בצינור הלב ליניארי ב E8.0 מתחזק ב E8.5 כפי שמוצג באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כל הר של העוברים.
באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כולה של הלב המנותק, ניתן לקבוע בקלות היווצרות תא חדרית במהלך התפתחות לב העכבר. בלב המנותח של עובר עכבר שלם ב- E10.5, ביטוי הכתב MLC-2v-tdTomato הוצג בחלק החדרי של הלב ולא בדרכי הזרימה, בדרכי הזרימה או באטריה העתידית. ב E12.5 כדי E13.5, כתב tdTomato בא לידי ביטוי באופן בלעדי בחדרי הלב ארבעה תאים.
תבנית הביטוי הדומה ספציפית חדרית הוצגה בעובר העכבר המנותק ב- E16.5. לאחר הדמיה שלמה, גנוטיפ של העוברים נקבע באמצעות שני סטים של פריימרים עבור PCR genotyping, המאשר עוברים הומוזיגים הנושאים את אלל דפיקות tdTomato, הטרוזיגים, ואת העוברים מסוג פראי. שיטה זו היא די פשוטה ופשוטה לביצוע.
הצעד הקריטי הוא לנתח לבבות עובריים. הבנת אנטומיה לבבית במהלך התפתחות הלב יש צורך לבודד בהצלחה את הלב מן העובר כולו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקולים לבחינת התפתחות לב העכבר באמצעות מיקרוסקופיה אפיפלואורוסצנטית שלמה על עכברי MLC-2v-tdTomato reporter knock-in. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של שלבי היווצרות החדרים ללא טכניקות היסטוכימיות מורכבות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מחקר קרדיווסקולרי
רקע
- התפתחות הלב היא תחום קריטי במחקר בביולוגיה התפתחותית.
- שיטות מסורתיות לחקר מורפולוגיה של הלב יכולות להיות עתירות עבודה.
- עכברי reporter פלואורסצנטיים מספקים גישה חדשה להדמיית מבני הלב.
- עכברי MLC-2v-tdTomato משמשים כמודל שימושי למחקרים אלו.
מטרת המחקר
- לספק שיטה פשוטה להדמיית שלבי התפתחות הלב.
- להדגים את התועלת של עכברי reporter פלואורסצנטיים במחקרים התפתחותיים.
- להקל על המחקר ללא צורך בטכניקות מורכבות.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה אפיפלואורוסצנטית שלמה.
- שימוש בעכברי MLC-2v-tdTomato reporter knock-in.
- ניתוח עובריים בשלבי התפתחות שונים.
- הגדרת ניסוי פשוטה המתאימה לסביבות מעבדה רגילות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של היווצרות צינור הלב ולולאה.
- תצפית ברורה של היווצרות חדרים מלאה.
- שיטה שימושית לקוי reporter פלואורסצנטי אחרים של עכברים.
- הפרוטוקול הדגים קלות שימוש בסביבת מעבדה סטנדרטית.
מסקנות
- השיטה המוצגת מפשטת את המחקר על התפתחות הלב.
- היא מאפשרת לחוקרים להדמיר שלבים קריטיים ללא נהלים מורכבים.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של מורפוגנזה של הלב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
