Name: השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: למד טכניקת RNA-FISH למולקולה בודדת לכימות ולוקליזציה של mRNA בביציות עכברים בודדות. השיטה מספקת נתונים עם שונות נמוכה לחקר ביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר דניאל ר לארסון לעזרתו נדיב עם ההתקנה ואת השימוש מציאת נקודה, מעקב אחר תוכנית 13 ותמיכה טכנית של אוניברסיטת נברסקה לינקולן מיקרוסקופ הליבה עבור ההדמיה מיקרוסקופיה קונפוקלית. מחקר זה מייצג תרומה של האוניברסיטה של אגף המחקר החקלאי נבראסקה, לינקולן, נברסקה, נתמך על ידי קרנות הפתח UNL (נב-26-206/ההצטרפות-232435 ומספר נאב-26-231/ההצטרפות-1013511).

ההליכים בבעלי חיים היו נבדקו ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-אוניברסיטת נברסקה, כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות. במחקר זה, outbred CD-1 עכברים הייתה גישה ad libitum צ'או מכרסמים רגיל ומים; הם היו מתוחזקים ביומן 12:12 כהה: אור מחזור.
1. הכנת מדיה הנדרשים
<ol><li>על בסיס מדיה (אום), להוסיף 100 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 0.5 מ מ ח'2PO4ו- 1.7 מ"מ CaCl2-2 H2O במים סטריליים 100 מ. הערה: ניתן לאחסן OMM בינוני עד כחודש.</li>
	<li>התקשורת מלאה (OMOPS), להוסיף 20 מ מ 3-morpholinopropane-1-sulfonic חומצה (MOPS), 1.2 מ מ MgSO4-7 H2O, גלוקוז 0.5 מ מ, 6 מ מ L-לקטט, 1 מ מ ala-אך זה לא נגמר, טאורין, 0.1 מ"מ x 1 שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA), 0.01 מ מ ethylenediaminetetraacetic (חומצה EDTA), חומצה אלפא ליפואית מיקרומטר 10, 10 µg/mL מדולל גנטמיצין, 21 מ מ 1 מ' NaOH, 5 מ מ NaHCO3, 0.2 מ מ פירובט, 0.5 מ מ ציטראט, BSA 4 מ"ג/מ"ל FAF על 1:10 לדילול OMM במים סטריליים עבור הנפח הכולל של 100 מ ל. לעקר את המדיום עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הערה: OMOPS ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.</li>
	<li>עבור המדיום אחזקות (HM) להוסיף סרום שור העוברי 5% OMOPS. לעשות 2 מ ל HM לכל העכבר.</li>
	<li>פתרון hyaluronidase הוסיפו 0.1 מ"ג/מ"ל של hyaluronidase נגזר מן האשכים שור, 1 מ ל HM.</li>
	<li>המאגר פיקסציה לשלב 4% paraformaldehyde ב- 10 מ"ל של PBS x 1 יחד עם 0.1% העובר כיתה פוליוינילפירולידון (PVP)14.</li>
	<li>כדי להכין מאגר שטיפת 50 מ ל (WB), להוסיף חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.1% ו- 0.1% PVP 1 x PBS14.</li>
	<li>כדי להכין 10 מ"ל permeabilization מאגר, להוסיף 1% שאינם - יונית חומרים פעילי שטח PBS 1 x14. הערה: המאגרים רוחצים את permeabilization המתואר לעיל להחליף את המאגרים קניינית ערכות זמינים מסחרית.</li>
</ol>2. אוסף של oocytes ovulated של עכברים הנשי
<ol><li>הכנה:<ol>
<li>לעורר עכברים נקבה 5-8 שבועות של גיל על-ידי הזרקת בקרום הבטן (IP) של 5 IU סוסים שליה גונדוטרופין (א) ואחריו 5 IU גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) 44-48 h15,מאוחר יותר16.</li>
		<li>לשמור על 35 מ מ פטרי המכילות 2 מ של HM על צלחת ההתחממות 37 º C. פיפטה אחת, 100-µL טיפה של HM המכיל מדולל hyaluronidase ואחריו שלוש, 50 µL טיפות של HM ללא hyaluronidase בצלחת פטרי 60 מ מ. במקום לוחות המכילים טיפות על התחממות 37 ° C צלחת לפני השימוש. הערה: הטיפות hyaluronidase צריכה להיעשות רק לפני ניתוח כל זוג oviduct כדי למנוע אידוי את הריכוז של הרכיבים של HM עם או בלי hyaluronidase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתת חסד עכברים, h 16 אחרי הזריקה IP של hCG, שימוש יתר איזופלוריין ואחריו נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>נקה את העכבר באמצעות אתנול 70%. לחשוף את חלל הבטן והמחש את מערכת הרבייה הנשית. מחזיקים את השחלה עם מלקחיים, להסיר את הרצועות הרחם ואת רקמת שומן עודף מ סביב השחלה. לחתוך את oviduct מן הרחם ולמקם את זוג שחלה-oviduct HM חם בצלחת 35 מ מ.</li>
	<li>להסיר את השחלה כל רקמת שומן שמסביב. דמעה נפוחות אמפולת oviduct באמצעות מחט 27-מד ½ אינץ '. לדחוף את oviduct באתר של הקרע, מתחמי תא-oocyte תלולית (COCs) יסולקו. להעביר את oocytes ovulated, אשר נמצאים בחזקת להיות מפה של השני (MII) של מיוזה, לירידה 100 μL המכיל HM מדיה עם hyaluronidase באמצעות פיפטה של הפה (איור 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig2.jpg"> איור 2 : חלקי pipettor הפה המשמש להעברת oocytes. (א) את הפה. חתיכת (B) 0.22, 4 מ מ (ג) ליניקת אבובים (D) 1000 μL pipet קצה עם פילטר (E) 9" פסטר pipet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="5"><li>Pipette את מתחמי תא oocyte-תלולית MII למעלה ולמטה ב hyaluronidase המכיל HM עם פיפטה בפה מכך cumulus תאים. העברת כל oocyte, ברגע שהם נטולי cumulus לתאים שטיפה זרוק HM המכיל רק באמצעות פיפטה את הפה. חזור על הפעולה עבור כל droplet לשטוף. אל תעביר מפוצלים או שקוף oocytes15. הערה: חשוב להעביר את oocytes מכל טיפה בצלחת 35 מ מ עם כמו HM קטן ככל האפשר. זה נכון לכל העברה בפרוטוקול. Oocytes MII לא להישאר ב- hyaluronidase המכיל HM בינונית במשך יותר מדקה.</li>
</ol>3. SM-דגים צביעה של Oocytes
<ol><li>לתקן את oocytes טוב בודדים של צלחת 6-ובכן המכיל 500 µL מאגר קיבעון. להטביע 20 oocytes או פחות בתוך הבאר. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: כל שלב צביעת SM-דג מתרחשת בתוך ובכן בודדים בצלחת חרוט 6-. טוב. ודא oocytes לחלוטין המשוקע במאגרי ואני לא צף על המאגר. בכל שלב צריך להיות שבוצעו עם 20 oocytes או פחות מכל קידוח.</li>
	<li>להעביר oocytes קבוע μL 500 שטיפת מאגר (WB שמתואר בשלב 1.6) למשך 10 דקות. חזור על 2 פעמים נוספות.</li>
	<li>דגירה oocytes במאגר permeabilization למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: המאגר permeabilization שמתואר בשלב 1.7 מחליף את המאגר permeabilization הנימוס.<ol>
<li>איסוף ערכות בדיקה, במהירות לסובב אותם למטה ב microcentrifuge. חמים כל בדיקה להגדיר עבור 10 דקות 40 ° צלזיוס המים הרותחים או חממה. מגניב כדי טמפרטורת החדר. הערה: שלב זה צריך להתבצע במשך הדגירה permeabilization</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>העברת oocytes 80 μL פרוטאז השלישי מאגר (זמין הערכה), זה מדולל 1:8 ב- 1 X PBS, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: אמצעי האחסון 80 µL מכסה במידה מספקת הבאר בודדים בצלחת 6-. טוב.</li>
	<li>לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדלל את מערכות החללית ומחוממת של Nanog, Pou5f1, ו DapB (גן שליטה שלילי), 1:50 ב בדיקה diluent. תקופת דגירה oocytes ב 80 μL של המכשיר הספציפי תעתיק של 2 שעות ב- 40 מעלות צלזיוס. הערה: כל ערכת בדיקה קניינית זמין באחד בשלושה ערוצי קרינה פלואורסצנטית (C1, C2, C3). Nanog ואת Pou5f1 הגששים תויגו עם C2, C3, בהתאמה.</li>
	<li>חמים קניינית, מגבר 1 (1 אמפר), מגבר 2 (AMP2), מגבר 3 (AMP3) ומגבר 4-קרינה פלואורסצנטית (מגבר 4-FL) בטמפרטורת החדר. הערה: שלב זה צריכה להתבצע במהלך בדיקה ספציפית התעתיק 2 שעות.</li>
	<li>להעביר את oocytes μL 500 של WB, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה oocytes ברצף במאגרי הגברה.<ol>
<li>דגירה oocytes ב 80 µL של AMP1 במשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס oocytes העברה כדי 500 µL של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה oocytes ב µL 80 של AMP2 למשך 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס. העברת oocytes µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה של oocytes ב 80 µL של AMP3 במשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס. העברת oocytes µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: השארית של הפרוטוקול מבוצעת בחושך כי כח-FL מכיל את fluorophore. כאשר עובד תחת המיקרוסקופ ויבתר, להפחית כמה שיותר את האור.</li>
		<li>להוסיף oocytes 80 μL של AMP4-FL למשך 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס. הערה: AMP4-FL מסופק כאלטרנטיבה מאגר-A Alt-B (Alt-A), או Alt-סי בחר AMP4-FL המאגר תלוי על איזו פליטה גל היא הרצויה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה oocytes ב µL 80 של דאפי במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף oocytes ב µL 500 של WB למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>פיפטה 12 µL של התקשורת נגד דהייה הרכבה במרכז שקופית מבלי להוסיף בועות הכימית. להעביר את oocytes עם כמה WB קטן ככל האפשר לתוך כלי התקשורת הרכבה ולהחיל על coverslip.<ol>
<li>להטות את coverslip בזווית, לאט ובעדינות למקם מעל הנוזל בשקופית. הימנעו מלחיצה על coverslip קשה מדי למנוע עיוות של oocytes, הקדמה של בועות.</li>
		<li>אחסן את השקופיות תיבה כהה לילה יבש בטמפרטורת החדר. מעיל קצות השקופיות לק ברור לאטום coverslip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש מיקרוסקופ רגיל כדי למצוא oocytes על שקופיות, מעגל עם סמן קבוע. הערה: שלב זה אינו נדרש, אך משפר את oocytes איתור בשקופית. לקבלת תוצאות מיטביות, תמונות שקופיות בתוך 1-5 ימים כמו האות פלורסנט יתחיל לדעוך.</li>
</ol>4. עיבוד תמונה
<ol><li>תמונה של oocytes תלת-ממדי, באמצעות z שלב קונפוקלית. הערה: כדי לנתח במדויק את התמונות, כל שלב z להיות מיקרומטר 1.0/פרוסה.</li>
	<li>שמור תמונות קונאפוקלית של nd2 דחוס או בודדים. קובצי TIFF עבור כל oocyte. שני הסוגים תמונה תואמים התוכנית עיבוד התמונה קוד פתוח, פיג'י.</li>
	<li>הורד והתקן את התוכנה פיג'י גישה פתוחה (https://imagej.net/Fiji/Downloads).<ol>
<li>לגרור קבצים nd2 פיג'י, לבחור hyperstack. אם תמונות קונאפוקלית נשמרו בתור. קובצי TIFF דלג לשלב 4.4. הערה: כאשר הקובץ nd2 הוא נפל לתוך פיג'י מהרשימה הנפתחת hyperstack אמורה להופיע באופן אוטומטי.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה תמונה לבחור צבע, לחץ על פצל ערוצים כדי להפריד בין הערוצים פלורסנט של הקובץ nd2.</li>
		<li>צור בודדים. קובצי TIFF לכל z-פרוסה של oocyte בכל אחד מהערוצים פלורסנט. לחץ על הכרטיסיה תמונה , בחר את סטאקסולאחר לחץ על אוסף תמונות. לחץ על הכרטיסיה תמונה , בחר סוג, לחץ על צבע RGB כדי להמיר כל פרוסה z תמונת צבע RGB בודדים. הערה: צבע RGB הוא מלאכותי, יכול להיות נבחרת הרצוי עבור כל גל פליטה.</li>
		<li>שמור כל תמונה המומר. קובץ TIFF. מקם תמונות oocyte יחיד לכל ערוץ פלורסנט בתיקייה חדשה כדי למנוע בלבול במהלך תפרים (שלב 4.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנרמל את אחד. תמונות TIFF עבור Pou5f1 ו- Nanog שימוש בתמונות שליטה שלילי (DapB). הערה: נורמליזציה מתבצעת באמצעות בתוכנית לעריכת תמונות. הקפד להסיר רמות זהות פלורסצנטיות רקע מתמונה כל שליטה.</li>
	<li>פתוח אחד מנורמל. קובץ TIFF בפיג'י לתפור יחד כל z-פרוסות עבור כל oocyte ב כל אורך הגל.<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה תוספים , בחר Stitching, ולחץ על רשת/אוסף (איור 3 א). בחר תמונות רציפים בתפריט הנפתח, לחץ על אישור (איור 3B).</li>
		<li>ספריית עיון, בחר את התיקיה המכילה את כל התמונות פרוסות z עבור oocyte בודדים-גל אחד (ראה שלב 4.3.4). לחץ על אישור.</li>
		<li>הזז את המחוון בתחתית התמונה תפור לערוץ הצבע המתאים עבור הגל המשמש ו ליצור את התמונה הסופית תפור RGB על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת סוג, לחץ על צבע RGB. הערה: תמונה זו ישמש עבור כימות פלורסצנטיות שמתואר בשלב 4.6 להלן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המירו את התמונה תפור לתמונה המוקרנת מקסימום 32 סיביות. לחץ על התמונה, בחר סוג, ולחץ על ' 32-bit (איור 3C). שמור את התמונה הזו חדשה. קובץ TIFF.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig3.jpg"> איור 3 : תפרים יחד של z קונאפוקלית-סדרת תמונות של oocytes. (א) המסך מציג את הכלי יישום plug-in רשת/אוסף בפיג'י שבה השתמשת כדי להפיק תמונות ללא הפרדות צבע של oocyte. (B) תמונות רציפים משתמש פלורסצנטיות חפיפה בין רציפים. קובצי TIFF כדי ליצור תמונה מורכבת. (ג) תמונה מורכבת נשמר כמו 32 סיביות. קובץ TIFF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="7"><li>הורד והתקן את מציאת נקודה, מעקב אחר תוכנית13, אשר זמין מאתר האינטרנט של D.R. לארסון, חוקר במוסדות של הבריאות הלאומית המכון הלאומי לסרטן (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). הורד והתקן את גישה פתוחה וירטואלי עבור מערכת ההפעלה של נתונים אינטראקטיביים שפה (מסוג IDL) אשר נדרש כדי להפעיל את המקום למצוא תוכנית מעקב (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).</li>
	<li>פתחו את התמונה 32 סיביות, תפור, אשר נוצר בשלב 4.6 (איור 4A), מציאת מקום, תוכנית מעקב. בחר מהרשימה הנפתחת Localize ולחץ Localize (איור 4B), אשר יחשב את מספר הנקודות נמצא בתמונה. הערה: בכל מקום נספרים מייצג של mRNA בודדות. הגדרות הסף פוטון ותעודת הלהקה מוצגים צילום מסך (איור 4B). עבור פרוטוקול זה, שימש ברירת המחדל עבור כל הגדרה הסף. נציג חיובי ולנקודות רקע מוצגים (איור 4C).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig4.jpg"> איור 4 : כימות של mRNAs באמצעות נקודת מוצא ומעקב. (א) z בודדים-סדרת תמונות היו תפרו יחד כמתואר באיור 3 ונשמרו מקסימום 32 סיביות מוקרן. קובץ TIFF. (B) תמונה המשולב נפתח ב ספוט Finder ומעקב. בתרגום שימש כדי לספור את הנקודות פלורסנט (התיבה האדומה). סף ותעודת פוטון הלהקה מסומנים באמצעות התיבה הכחולה. (ג) החץ הכחול מצביע על איתות חיובי (מעל מפתן). החץ הלבן מראה של פלורסנט ספוט מתחת לסף וספרתי, לכן, לא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAMP-dependent+regulation+of+ovulatory+response+genes+is+amplified+by+IGF1+due+to+synergistic+effects+on+Akt+phosphorylation+and+NF-kB+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors.</a> Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).</li>
<li>Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Single+Molecule+mRNA+Fluorescent+in+Situ+Hybridization+%28RNA-FISH%29+to+Quantify+mRNAs+in+Individual+Murine+Oocytes+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7930(2018).</li>
<li>Ruebel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+modulates+inflammation+and+lipidmetabolism+oocyte+gene+expression%3A+A+single-cell+transcriptome+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).</li>
<li>Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorensztein%2C+M+%22Mouse+Oocyte+Development%22">Mouse Oocyte Development</a>. 1818, 51-65 (2018).</li>
<li>Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNA+and+translation+in+the+mammalian+oocyte+and+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo.</a> PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li>
<li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeDesigner%3A+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+%28bDNA%29+signal+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li>
<li>Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarson%2C+B+%22BioTek+Application+Notes%22">BioTek Application Notes</a>. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).</li>
<li>Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+%CE%B2-Actin+mRNA+Detection+in+Neurons+Reveals+a+Mechanism+for+Regulating+Its+Translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability.</a> Science. 343 (6169), 419-422 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+better+mouse+embryo+assay%3A+effects+of+mouse+strain+and+in+vitro+maturation+on+sensitivity+to+contaminants+of+the+culture+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).</li>
<li>Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+obesity+alters+the+steroidogenic+response+to+ovulatory+stimulation+and+increases+the+abundance+of+mRNAs+stored+in+the+ovulated+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte.</a> Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).</li>
<li>Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-dependent+increases+in+oocyte+mRNAs+are+associated+with+increases+in+proinflammatory+signaling+and+gut+microbial+abundance+of+lachnospiraceae+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice.</a> Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).</li>
<li>Hirao, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effect+of+visible+light+on+meiosis+of+mammalian+eggs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. , (1978).</li>
<li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+Approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).</li>
<li>Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+follicle+culture+supports+primary+follicle+growth+through+paracrine-acting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals.</a> Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).</li>
<li>Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+Regulation+of+Kinase+Signaling+Pathways+by+AREs+and+GREs%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs.</a> Cells. 5 (1), 4(2016).</li>
<li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li>
<li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative%2C+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).</li>
<li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li>
<li>Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalstead%2C+JM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 572, Elsevier Inc. (2016).</li>
<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li>
<li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomics%3A+the+next+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).</li>
<li>Freimer, N., Sabatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Phenome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Phenome Project.</a> Nature Genetics. 34, 15(2003).</li>
</ol>

המחברים יש ריהצהל

סדרה של צעדים קלים במהלך הפרוטוקול יבטיח פלורסצנטיות מוצלחת וספירות מדויק של mRNAs. ראשית, הפרוטוקול חייב להתבצע מיד לאחר איסוף של קיבוע oocytes. שימו לב כי PVP נוסף למאגר קיבוע paraformaldehyde 4% כדי למנוע oocytes נצמדים אחד לשני. מצאנו כי יש צורך לבצע את הניסוי מיד אחרי אוסף קיבוע oocytes. כל עיכוב תוצאות הרבה נמוך יותר קרינה פלואורסצנטית האות, כי כתוצאה undercounting של הפרוטוקולים. . זה בחלקו בשל RNA השפלה. Oocytes לא יותר מ 20 יש להעביר טוב בצלחת. ובכן 6 בבת אחת, כל טוב להשתמש בהם רק פעם אחת. הדגירה פעמים צריכה גם ...

רוורס טרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כבר תקן זהב עבור כימות mRNA. שני מבחני, PCR (dPCR) דיגיטלי1 ו זמן אמיתי כמותיים PCR (qPCR)2 משמשים כיום. של שתי טכניקות PCR, dPCR יש רגישות רבה יותר מאשר qPCR רומז כי זה יכול לשמש כדי למדוד את שפע mRNA בתאים בודדים. עם זאת, בידיים שלנו, הפיק dPCR ניתוח של שפע נמוך mRNAs בבריכות של 5-10 oocytes לכל כל מדגם ניסיוני נתונים עם הפארמצבטית נמוך ווריאציה גבוהה3. . זה ככל הנראה בגלל השגיאה ניסיוני המשויך החילוץ-RNA ויעילות שעתוק במהופך. רצפי RNA גם בוצעה באמצעות עכבר אחת oocytes האנושי4,5. טכניקה זו דורשת cDNA הגברה השלבים הנדרשים עבור הדור ספריה אשר סביר להניח מגביר את השתנות בתוך קבוצת הניסוי. יתר על כן, שפע נמוך תעתיקים לא ניתן לזיהוי. למרות רצף המחירים ירדו בשנים האחרונות, הוא עדיין יכול להיות ושדורשת עקב העלות הגבוהה של ביואינפורמטיקה ניתוחים. לבסוף, mRNA לוקליזציה היא תהליך דינמי עם שינויים מרחביים התורמים חלבון פונקציה6. לכן, יצאנו לאמץ טכניקה היה לייצר אמצעי כמותית מדויקת לשחזור ולוקליזציה של הפרט mRNAs ב oocytes יחיד.
DNA מסועף מצמידים זריחה בהכלאה באתרו מגביר את האות זריחה במקום RNA/cDNA הגברה המאפשרת זיהוי mRNAs יחיד תאים בודדים- 7,-8,-9. הבדיקה מבוצעת דרך סדרה של הכלאה הגברה (באמצעות DNA קנים), קרינה פלואורסצנטית תיוג צעדים כדי להגביר את האות של קרינה פלואורסצנטית7. הטכניקה מתחילה עם קשירה של זוגות בדיקה oligonucleotide 18 - 25-לבסיס כי הם משלימים על ספציפיות mRNA3,8,10. 15-20 זוגות בדיקה מיועדים ירידה לפרטים הבטחת כל תורגם על-ידי היעד. הכלאה mRNA ספציפי ואחריו הגששים קדם מגבר, מגבר כי הטופס תצורה מסועף. כ, fluorophores תווית 400 לאגד כל מגבר, וכתוצאה מכך עלייה 8000-fold ב פלורסצנטיות המאפשר זיהוי של הפרט mRNAs (איור 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של פרוטוקול SM-דג- הכלאה רציפים של התעתיק בדיקה ספציפיים, כפועל DNA מגבר ו fluorophore ליעד mRNA מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מחקרים קודמים באמצעות קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (SM-דג) לשפות אחרות β-אקטין mRNAs נוירונים בודדים12 , וירוס הפפילומה האנושי DNA של סרטן צוואר הרחם תא קווים7. תוכנת מחשב במקום למצוא תוכנית מעקב אחר מזהה אות ניאון punctate בודדים, שימש בהצלחה כדי לכמת את מספר mRNAs כל3,תא13.
בהתבסס על התוצאות של גילוי mRNA נוירונים12, אנחנו שיערו כי SM-דג יוכיח כלי שימושי כדי quantitate רמות תורגם מאתר oocytes, העוברים כולל שפע נמוך mRNAs. עם זאת, הטכניקה ממוטבת לשימוש עם תאים קבוע חסיד, פורמלדהיד קבוע פרפין משובצים קטעי רקמה (FFPE). Oocytes לא יכולה לדבוק שקופית, גם כאשר הם מצופים פולי-L-ליזין. יתר על כן, הן שבירות יותר תאים סומטיים ומקטעים רקמות וכתוצאה מכך פירוק התא כאשר נתון של המאגרים קניינית ערכות זמינים מסחרית3. כדי להתגבר על האתגרים הללו, oocytes היו קבוע, מועברים באופן ידני בין טיפות של המאגרים. יתר על כן, מאגרי permeabilization ושטוף ערכות הוחלפו כדי להפחית את פירוק התא. שתגבש רגשים נרכשים לצד ערכת דגים או תעתיקים ספציפי ניתן לבקש. כל ערכת בדיקה קניינית זמין באחד בשלושה ערוצי קרינה פלואורסצנטית (C1, C2, C3) כדי לאפשר ריבוב. בניסוי הנוכחי, oocytes מאתר היו שהוכתמו כפול, כימות באמצעות בדיקה C2 Nanog ובדיקה C3 Pou5f1 . רגשים אלו נבחרו מבוסס על הביטוי המדווחת של Nanog , Pou5f1 oocytes, העוברים. בסיום השלבים הכלאה, oocytes היו ממוקמים בתוך טיפות אנטי-לדעוך הרכבה מדיה עבור יישום בשקופיות היסטולוגית. תמונות קונאפוקלית שימשו כדי לכמת את מספר punctate אותות פלואורסצנט אשר מייצגים mRNAs בודדים. בנוסף לכימות של mRNAs, ההדמיה הראתה גם את התפוצה המרחבית של ה-mRNA ספציפי בתא, אילו שיטות כימות אחרים של RNA הם הצליחו. להגיע להישגים. טכניקה זו הוכיח יש השתנות נמוך בתוך קבוצת הניסוי המאפשר שימוש מספר קטן יחסית של oocytes בכל קבוצה ניסיונית כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי3.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-&אלפא חומצה ליפואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1395</td><td>חומצה אלפא ליפואית</td></tr><tr><td>אלבומין, סרום בקר, חומצת שומן נמוכה</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>199899</td><td>FAF BSA</td></tr><tr><td>BD 10 מ"ל מזרק שחפת</td><td>בקטון, דיקינסון וחברה</td><td>309659</td><td>10 מ"ל מזרק</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide מחט</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td>305109</td><td>27 1/2 מד מחט</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7902</td><td>CaCl2-2H2O</td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2404</td><td>ציטראט</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6152</td><td>גלוקוז</td></tr><tr><td>דיסודיום פוספט</td><td></td><td></td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>אחיזה קלה צלחת פטרי</td><td>פלקון קורנינג</td><td>351008</td><td>35 מ"מ צלחת</td></tr><tr><td>אדטט דיסודיום</td><td>אוונטור</td><td>8994-01</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>מספריים בון משובחים במיוחד</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14084-08</td><td>ישר, חד / חד, לא משונן, 13 מ"מ מספריים חיתוך</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S10250</td><td>FBS</td></tr><tr><td>תמיסת ריאגנט ג'נטמיצין</td><td>gibco</td><td>15710-064</td><td>Gentamicin</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td> <td>gibco</td><td>35050-061</td><td>Glutamax</td></tr><tr><td>חותם זהב מיקרו כפכפים</td><td>חותם זהב</td><td>3039</td><td>25 x 75 מ"מ שקופיות</td></tr><tr><td>גונדוטרופין, מסרום סוסות בהריון</td><td>סיגמא</td><td>G4877</td><td>eCG</td></tr><tr><td>hCG רקומביננטי</td><td>NHPP</td><td>AFP8456A</td><td>hCG</td></tr><tr><td>היאלורונידאז, סוג IV-S: מאשכי בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3884</td><td>תכשיטני היאלורונידאז</td></tr><tr><td>בסגנון מלקחיים</td><td>אינטגרה</td><td>17-305X</td><td>מלקחיים 4-3/8 אינץ', סגנון 5F, ישר, מיקרו לסת עדינה</td></tr><tr><td>L-(+)-חומצה לקטית, חומצה חופשית&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>190228</td><td>L-לקטט</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטאהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2773</td><td>MgSO4-7H2O</td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>25-025-Cl</td><td>כיסוי מיקרוסקופ NEAA</td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>פישר מדעי</td><td>12-542-C</td><td>25 x 25x 0.15 מ"מ תלושי כיסוי</td></tr><tr><td>Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501891-C2</td><td>Nanog Probe</td></tr><tr><td>Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501611-C3</td><td>Pou5f1 Probe</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Paraformaldehyde</td></tr><tr><td>PES 0.22 um ממברנה סטרילית</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RS</td><td>0.22 um מסננים</td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0930</td><td>PVP</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60128</td><td>KCl</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60218</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>מגיב אנטי-דהייה זהב</td><td>Prolong invitrogen</td><td>P36934</td><td>מגיב אנטי-דהייה ללא DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope DAPI</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>320858</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 1</td><td>מגבר</td><td>320852 אבחון תאים מתקדם</td><td></td> 1</tr><tr><td>RNAscope FL AMP 2</td><td>מגבר</td><td>320853 אבחון תאים מתקדם</td><td></td> 2</tr><tr><td>RNAscope FL AMP 3</td><td>מתקדם מגבר 320854 אבחון תאים</td><td></td><td>3</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT מגבר</td><td>320855</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>4 ALT A</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT B</td> מגבר <td>320856</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>4 ALT B</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT C</td> מגבר <td>320857 אבחון תאים מתקדם</td><td></td><td>4 ALT C</td></tr><tr><td>RNAscope ערכת ריאגנטים לזיהוי פלואורסצנטי</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>320851</td><td>ערכת ריאגנט FISH</td></tr><tr><td>בדיקת RNAscope בדיקה 3-plex בקרה שלילית</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>320871</td> בדיקה RNAscope <td>בקרה שלילית</td></tr><tr><td>3-plex בקרה חיובית</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>320881</td><td>בקרה חיובית</td></tr><tr><td>RNAscope בדיקה מדלל</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>300041</td><td>בדיקה מדלל</td></tr><tr><td>RNAscope פרוטאז III</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>322337</td><td>פרוטאז III</td></tr><tr><td>RNAscope פרוטאז III & ערכת ריאגנטים IV</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>322340</td><td>ערכת פרוטאז</td></tr><tr><td>FISH RNAscope פרוטאז IV</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>322336</td><td>מחט פרוטאז IV</td></tr><tr><td>S/S עם Luer Hub 30G</td><td>Component Supply Co.</td><td>NE-301PL-50</td><td>מחט קהה 30 מד</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6297</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6191</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>306576</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>נתרן פירובט, > = 99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5280</td><td>תמיסת פירובט</td></tr><tr><td>6 באר צלחת</td><td>Agtechinc</td><td>D18</td><td>צלחת 6 באר</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td> טאורין <td>פלקון קורנינג</td><td>353002</td><td>צלחת 60 מ"מ</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100</td><td>טריטון X-100</td></tr></tbody></table>

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (sm-דג) כדי mrnas quantify ו localize ב oocytes מאתר

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

שיטות בשימוש שגרתי לכמת mRNA oocytes, העוברים כוללים תגובת שרשרת של פולימראז הפוכה-תמלול דיגיטלי (dPCR), כמותיים, בזמן אמת RT-PCR (RT-qPCR), רצפי RNA. כאשר שיטות אלה נעשות באמצעות oocyte יחיד או העובר, נמוך-עותק mRNAs לא אמינה מזוהים. כדי להתגבר על בעיה זו, oocytes או עוברי יכול להיות איחדו יחד לניתוח; עם זאת, זה מוביל לעתים קרובות השתנות גבוהה בין הדגימות. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש זריחה בהכלאה באתרו (דגים) באמצעות הכימיה DNA מסועף. טכניקה זו מזהה התבנית המרחבי של mRNAs בתאים בודדים. כאשר הטכניקה זה משולב עם מציאת מקום ותוכנות מחשב מעקב, השפע של mRNAs בתא גם ניתן לכמת. בעזרת טכניקה זו, יש השתנות מופחתת בתוך קבוצת הניסוי, פחות oocytes, העוברים נדרשים לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי. SM-DNA זמינים מסחרית-דגים ערכות מוטבו לזהות mRNAs רקמות משרטוטי או תאים חסיד בשקופיות. עם זאת, oocytes אינן מתיישבות ביעילות על שקופיות, כמה ריאגנטים בערכה היו קשים מדי וכתוצאה מכך oocyte פירוק. כדי למנוע את פירוק, נעשו מספר שינויים לערכה דגים. באופן ספציפי, oocyte permeabilization ושטוף מאגרים המיועדים את immunofluorescence של oocytes, העוברים החליף את המאגרים קניינית. Permeabilization, שוטף, וכן incubations עם המחקרים וכל מגבר בוצעו ב- 6-ובכן צלחות, oocytes הונחו על שקופיות בסוף הפרוטוקול באמצעות מדיה הרכבה. שינויים אלה הצליחו להתגבר על המגבלות של ערכת זמינים מסחרית, בפרט, פירוק oocyte. כדי במדויק, reproducibly לספור את מספר mRNAs ב oocytes בודדים, שימש תוכנות מחשב. יחד, פרוטוקול זה מייצג חלופה PCR ורצף כדי להשוות את הביטוי של הפרוטוקולים ספציפי בתאים בודדים.

עם הסיום של הפרוטוקול, התוצאה תהיה תמונות בודדות מתוך קונאפוקלית z-סדרות (איור 4A ואיור 5), תפור תמונות (איור 4C), וסופרת mRNA (איור 4B). בעת ביצוע ריבוב, יהיו גם התמונות הממוזגות מציג את התווית עבור שני mRNAs שונים (איור 5). הסעיפים mRNA נוצרים באמצעות תמונות התפר שנוצר על ...

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

טכניקה זו מאפשרת לא רק לוקליזציה, אלא גם כימות של mRNAs מועמד ב oocytes בודדים ועוברים. בהשוואה למסיונות אחרים, כולל PCR, השלמת הטכניקה גורמת לשחזור נתונים עם וריאציה נמוכה. הפגנת ההליך תהיה קלסי טים, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.התחל הליך זה עם הכנת החומר הנדרש ועכברים נקבה בגיל חמישה עד שמונה שבועות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. נקה את העכבר באמצעות 70%אתנול. לחשוף את חלל הבטן לדמיין את מערכת הרבייה הנשית.החזק את השחלה עם מעצורים ולהסיר את רצועות הרחם ואת רקמת שומן עודף מסביב השחלה. חותכים את האוביאדוקט מהרחם. לאחר מכן, מניחים את זוג oviduct השחלה במדיום החזקה חם בצלחת 35 מילימטר.הסר את השחלה ואת כל רקמת השומן שמסביב. לקרוע את האמפולה הנפוחה של oviduct באמצעות מחט מד חצי אינץ '27. לדחוף את oviduct באתר של דמעה קומולוס תא oocyte מתחמים יסולקו.שימוש בפיפלטת פה להעברת הביציות הביוץ לירידה של 100 מיקרוליטר המכילה אחזקה בינונית עם היאלואורונידס. כדי לנטרל תאים קומולוס, פיפטה metaphase שני קומפלקסים תא cumulus oocyte למעלה ולמטה ב hyaluronidase המכיל מחזיק בינוני עם פיפטה הפה. ברגע שהם נטולי תאי קומולוס, השתמש פיפטה הפה להעביר כל oocyte טיפת לשטוף המכיל רק מחזיק בינוני.חזור על זה עבור כל טיפת לשטוף. אין להעביר בוציטים מפוצלים או שקופים. לביצוע כתמי SM-FISH, תחילה תקן בוציטים באר בודדת של צלחת בארות המכילה 500 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון.טביעה 20 oocytes או פחות באר. הדגירה את oocytes במאגר קיבוע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, דגירה oocytes במאגר permeablization במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפה נוספת, מעבירים את הוציטים ל-80 מיקרוליטר של חיץ פרוטאז 3 מדולל מראש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לדלל את סטים מחומם בדיקה עבור ננוג, Pou5f1, ו DapB אחד עד 50 ב diluent בדיקה. הדגירה oocytes ב 80 microliters של החללית הספציפית תעתיק במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.כאשר oocytes נמצאים בבדיקה ואת מאגרי AMP, הם נוטים לצוף. זה חיוני כי אתה להטביע את oocytes על ידי בעדינות דוחף אותם לתוך המאגר. מעבירים את הוציטים ל-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.עכשיו, הדגירה oocytes ברצף במאגרי הגברה. ראשית, הדגירה oocytes ב 80 microliters של AMP1 במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מעבירים את הוציטים ל-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הדגירה oocytes ב 80 microliters של AMP2 במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת oocytes כמו קודם, לה הדגיר את oocytes ב 80 microliters של AMP3 במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס ואחריו לשטוף הסופי. לבסוף, להוסיף oocytes ל 80 microliters של AMP4FL במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.פיפטה 12 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום למרכז שקופית מבלי להוסיף בועות לריג'נט. מעבירים את הוציטים עם מאגר שטיפה קטן ככל האפשר לתוך מדיום ההרכבה. לבסוף, החל שובר כיסוי.תדמיין את הוציטים התלת מימדיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל Z-step ושמור את התמונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. גרור קבצי ND2 לתוך פיג'י ובחר Hyperstack. לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'צבע' ולחצו על 'פיצול ערוצים' כדי להפריד בין ערוצי הפלואורסצנטיים של קובץ ND2.צור קובצי TIFF בודדים עבור כל פרוסת Z של הוציטים בכל ערוץ פלואורסצנטי. לשם כך, לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'ערימות' ולחצו על 'מחסנית לתמונות'. לאחר מכן, לחצו על הכרטיסייה 'תמונה', בחרו 'כתב' ולחצו על 'צבע RGB' להמרת כל פרוסת Z לתמונה צבעונית בודדת של RGB.שמור כל תמונה שהומרה כקובץ TIFF. מקם תמונות מ- oocyte יחיד עבור כל ערוץ פלואורסצנטי בתיקיה חדשה כדי למנוע בלבול במהלך התפירה. לאחר נרמול הקבצים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לחץ על הכרטיסיה תוספים, בחר תפירה ולחץ על אוסף רשת.בחרו 'תמונות רציפות' מהתפריט הנפתח ולחצו על הלחצן 'אשר'. עיינו בספריה ובחרו את התיקייה הכוללת את כל תמונות פרוסת Z לקבלת בוציט בודד באורך גל אחד. לחץ על אישור.הזז את המחוון בתחתית התמונה התפורה לערוץ הצבע המתאים לאורך הגל בו נעשה שימוש. צור את התמונה התפורה הסופית של RGB על-ידי לחיצה על תמונה, בחירה באפשרות אות ולחיצה על צבע RGB. המר את התמונה התפורה לתמונה מוקרנת מרבית של 32 סיביות.לשם כך, לחץ על תמונה, בחר סוג ולחץ על 32 סיביות. שמור תמונה זו כקובץ TIFF חדש. פתח את התמונה התפורה של 32 סיביות בתוכנית איתור ומעקב אחר נקודות.בחרו ברשימה הנפתחת 'התאמה לאוקליזציה' ולחצו על 'התאמה לאוקליזציה', שתחשב את מספר הנקודות שנמצאו בתמונה. מוצג כאן הוא כימות של mRNAs באמצעות מאתר נקודה ומעקב. החץ הכחול מצביע על אות חיובי מעל הסף.החץ הלבן מראה נקודה פלואורסצנטי מתחת לסף ולכן לא נספר. ספירות mRNA נותחו לאחר מכן באמצעות כלי ניתוח נתונים סטנדרטי. תמונות מייצגות של תמונת סדרת Z האמצעית מוצגות עבור Pouf51 ו- Nanog.כתמי DAPI של כרומוזומים המיושרים במטה-פאזה שני צירים מוצגים בלבן. הנתונים שנאספו בפרוטוקול זה הראו 775 תעתיקים Pouf51 ו 113 תעתיקים ננוג ב metaphase שני oocytes. חשוב לציין, לא היו כתמים שזוהו ב oocytes המסווים עם בדיקה DapB, אשר שימש שליטה שלילית.בעת שימוש בתאים שאינם חסידים, חשוב לזהות באופן אמפירי את הדילול הטוב ביותר של מאגר פרוטאז מערכת SM-FISH. זיהוי mRNA נבדק באמצעות עקומת טיטריות של ריכוזי מאגר פרוטאז לא מדוללים ב- 1xPBS. דילול פרוטאז בשימוש בפרוטוקול זה היה אחד עד שמונה כפי שהוא הראה את הווריאציה הנמוכה ביותר בביטוי פלואורסצנטי הממוצע של Pouf51 mRNA במטהפאזה שני oocytes.במקביל ניתן לבצע אימונו-פלואורסצנטיות של חלבון יעד על מנת להפוך את ה-mRNA ללאוקליזציה עם חלבון מחייב RNA. לוקליזציה של mRNAs עם חלבונים מחייבים RNA מאפשר לחוקרים לקבוע מנגנונים המסדירים אחסון mRNA, תרגום, השפלה בתוך oocyte או עובר.

use-single-molecule-fluorescent-situ-hybridization-sm-fish-to

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

למד טכניקת RNA-FISH למולקולה בודדת לכימות ולוקליזציה של mRNA בביציות עכברים בודדות. השיטה מספקת נתונים עם שונות נמוכה לחקר ביולוגיה התפתחותית.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

גלה סרטונים נוספים