מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

DRIT הוא משמעותי כי הוא מספק בדיקת אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות בתחום או באזורים ללא גישה שגרתית מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון העיקרי של DRIT הוא שהוא משתמש רק מיקרוסקופ אור פשוט ואת התוצאות ניתן להשיג בתוך כשעה. DRIT מספק כלי חסכוני רב עוצמה לאבחון כלבת שיכול לשמש מעבדות וביולוגים שדה כדי לשפר את תוכניות מעקב כלבת, מניעה ובקרה ברחבי העולם.

עבור בעלי חיים שנאספו זה טרי או הפשיר לטמפרטורת הסביבה, למקם את החיה supine על משטח שטוח עם עמוד השדרה הצווארי מעט מסובבים לכיוון הבוחן. Palpate כדי לזהות את המפרק אטנטו-העורף על ההיבט רוחבי של עמוד השדרה הצווארי. באמצעות להב אזמל, לעשות חתך ברמה של מפרק אטנטו עורפית בהיבט הגחוני חיתוך דרך כל השכבות של שריר ורקמות רכות כולל קנה הנשימה והוושט.

ממשיכים עד המשוער את ההיבט הקדמי של חוליות עמוד השדרה הצווארי. לאחר מכן הזז את ראש החיה להארכת טווח קצה עד שגזע המוח יהיה גלוי. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את כל גזע המוח הנראה ואת רקמת מערכת העצבים המרכזית לדגימה.

מניחים את דגימות גזע המוח במיכל בלתי שביר ומתייגים בהתאם. ראשית, להגדיר מנות מכתים כי הם עמוקים מספיק כדי לאפשר טבילה מלאה של שקופית מדגם. ממלאים את המנה עם 10% פוספט אוגר פורמלין.

מלאו כלים 2, 4 ו-5 ב-TPBS. ממלאים את המנה השלישית במי חמצן 3%. ואז למלא מנות שש, שמונה, תשע ו -10 עם מים מזוקקים או deionized.

מלאו את צלחת 7 בניסוח המטוקסילין מספר שתיים של גיל מדולל ביחס של 1:1 עם מים מזוקקים. כדי להכין את פתרון מלאי האמינו-אתיל-קרבזול, באמצעות פיפטה זכוכית, מניחים חמישה מיליליטר של N, N-dimethylformamide במיכל זכוכית. מוסיפים 120 מיליגרם טבליה של 3-אמינו-9-אתילקרבזול למיכל הזכוכית ומנערים עד להמסה מוחלטת.

כדי להכין את דילול העבודה AEC, להוסיף שבעה מיליליטר של חיץ אצטט לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. השתמש פיפטה זכוכית להוסיף 0.5 מיליליטר של פתרון מלאי AEC לצינור צנטריפוגה. הוסף 0.75 מיליליטר של 3%פתרון מי חמצן.

השתמש במזרק 10 מיליליטר עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 כדי לסנן את הפתרון. כדי להתחיל, השתמש בסמן דיו קבוע עמיד בפני מים כדי לסמן שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם מספר ייחודי עבור כל דגימה. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את גזע המוח מן המיכל ומניחים אותו על מגבת נייר.

השתמש במגבת נייר שנייה כדי למחוק בעדינות כל נוזל עודף, דם או פרווה כדי לחשוף רק את רקמת גזע המוח. במידת הצורך, חתך את רקמת גזע המוח כדי לחשוף חתך רוחב. מאוד בעדינות לגעת בשקופית מיקרוסקופ למספר נקודות של גזע המוח ללא תנועה משנית כדי לאפשר אזורים מרובים של גזע המוח להיות מועבר לשקופית לוודא כי רק שכבות אחד או שניים של תאים מועברים מרמת המוח לשקופית.

תן לשקופיות להתייבש באוויר במשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לטבול את השקופיות בפורמלין 10%buffered בצלחת אחת במשך 10 דקות. מוציאים את השקופיות מהפורמלין וטובלים אותן בתסכול TPBS במנה 2.

לטבול את השקופיות שטף בתסתר מי חמצן הכלול בצלחת שלוש במשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את השקופיות מן מי חמצן לטבול לשטוף אותם TPBS טרי הכלול בצלחת ארבע. לאחר הסרת מי חמצן עודף, מניחים את השקופיות ב- TPBS הטרי הכלול בצלחת חמש.

קח את המגלשות אחת בכל פעם מהמנה החמישית, לנער ולנפח כל חיץ עודף ומניחים את המגלשה על מגבת נייר לחה על ספסל המעבדה. כאשר כל השקופיות הועברו, להשתמש טפטף או פיפטה לרדת מספיק נוגדן וירוס אנטי כלבת העיקרי על כל שקופית כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. מכסים את השקופיות עם צלחות היטב או כיסוי פשוט אחר כדי ליצור תא לחות להידגר את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא במשך 10 דקות.

לאחר מכן, להסיר את השקופיות תא הלחות, לנער ולמחתוך את כל תריס עודף לטבול לשטוף את השקופיות ב- TPBS בצלחת חמש. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, להסיר שקופית מן TPBS ולהשתמש טפטף או פיפטה לרדת מספיק סטרפטבידין peroxidase מורכבים כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. לאחר שכל המגלשות כוסו, הדגירה אותם בתא הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן להסיר את השקופיות מן תא הלחות, לנער ולמחום את כל קומפלקס עודף לטבול לשטוף את השקופיות ב- TPBS הכלול בצלחת חמש. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, להסיר שקופית מן TPBS ולהשתמש פיפטה כדי להפיל מספיק פתרון עבודה AEC כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. הדגירה את המגלשות בתא הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, טובלים את המגלשות במים המזוקקים הכלולים בצלחת 6 ומ מניחים אותן במתנה נגדית של המטוקסילין של גיל בצלחת שבע במשך שתי דקות. מיד לטבול לשטוף את כל המגלשות במים מזוקקים בצלחת שמונה. חזור על זה פעמיים באמצעות מים מתוקים במנות תשע ו 10 עבור כל לשטוף.

עבודה מגלשה אחת בכל פעם, להסיר מגלשה מהמים לנער ול כתם את כל המים העודפים. השתמש במדיום הרכבה מסיס במים כדי להדביק כיסוי למגלשה. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרה של פי 20 כדי להציג את השקופיות.

תוצאות חיוביות של DRIT להראות תכלילים ויראליים intracytoplasmic אדום שיכולים להשתנות בצורה ובגודל בתוך הציטופלסמה של גופי התא כוויה. התכלילים נראים חלקים עם שוליים בהירים מאוד ואזור מרכזי מוכתם פחות אינטנסיבי. התפלגות האנטיגן מדורגת מתוך פלוס ארבע פלוס אחד עם פלוס ארבעה המייצגים התפלגות אנטיגן המורכבת משפע של תכלילים גדולים וקטנים המשתנים בגודל ובצורה ונרשמים בכל תחום תצוגה בתוך הרושם של מגע רקמת מערכת העצבים המרכזית.

חלוקה של פלוס שלוש מוקצית כאשר יש הכללות במגוון גדלים ברוב שדות התצוגה אך לא בכל שדות התצוגה. אם נמצאו הכללות ב- 10 עד 50% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן פלוס שתיים כאשר אחת מוקצית כאשר הכללות נמצאות בפחות מ- 10% מהשדות. רוב רקמות CNS עם וירוס כלבת להציג תכלילים ויראליים טיפוסי מדורגים פלוס שלוש או פלוס ארבע אינטנסיביות והפצה אנטיגן.

אם התוצאות מצביעות על פלוס אחד או שניים בעוצמה או בהפצת אנטיגן, המדגם מוכרז כבדיקה לא מוגדרת ויש אחריות לבדיקה חוזרת. מדגם בדיקה באמצעות DRIT נחשב שלילי עבור אנטיגנים וירוס כלבת לאחר השקופית המכילה את רקמת מערכת העצבים המרכזית נסרק בהגדלה של 200X או יותר ולא תכלילים וירוס טיפוסי מזוהים. דגימות שליליות מפגינות גופי תאים כוהנים עם מעט או ללא כתמים ספציפיים ידועים.

כל אדם המבצע בדיקות אבחון כלבת צריך לקבל חיסונים סטנדרטיים לפני החשיפה לכלבת ולעבור הערכת נוגדנים סרולוגית קבועה. אנשים לא מחוסנים לא צריכים להיכנס לאזורים שבהם מתבצעת עבודה כזו. בנוסף לאמצעי הזהירות שננקטו בעת עבודה עם וירוס כלבת חי, כמה מהריגטים המשמשים בבדיקה מסוכנים.

עיין גליונות נתוני הבטיחות עבור כל reagent.