שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים
16 בדצמבר 2019
פרוטוקול זה מספק שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע mesenchymal מ מתיחת בטן ודגימות ליפוף באמצעות שיטת החקור. העדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה מספק תאי גזע רלוונטיים קלינית שניתן להשתמש בהם למחקרים בתוך מבחנה או להעביר חזרה למרפאה.
פרוטוקול זה מספק דרך חסכונית פשוטה לבודד ASCs ללא שימוש באנזימים קשים או שלבי צנטריפוגה, אשר יכול לשנות את פנוטיפ התא והתנהגות. היעדר צעדים קשים מניב תאים פחות מניפולציות מאלה המבודדים באמצעות אנזימים וצנטריפוגות, ומצמצם את השאלות האם תצפיות ניסיוניות הן חפץ בשיטת הבידוד. שיטת explant זו יכולה ליצור ASCs רלוונטיים קליניים להיות הציג לתוך המטופל לטיפול במגוון רחב של מחלות או להרחיב בחיים להרשות לעצמם יישומי מחקר.
קשה להסביר את שיטת הטחון במילים. ההדגמה החזותית יכולה לשרת מדענים אחרים את הטרחה של למידה לפרק את הרקמה עצמם. ניתן להשתמש בשיטות הסבר דומות כדי לבודד אוכלוסיות אחרות של MSCs, כגון אלה מרקמות טבור.
כדי לטחון את דגימות רקמת abdominoplasty, ראשית להעביר את הרקמה למכסה של צלחת סטרילית 100 מילימטר. לאחר מכן השתמש במחט סטרילית כדי להחזיק חתיכת רקמה במקום ולהשתמש אזמל סטרילי לחתוך את הרקמה לחתיכות פחות ממילימטר אחד. מעבירים את הרקמה לצינור טרי ומנערים או מנערים את הדגימה חמש עד שש פעמים כדי להבטיח ערבוב של כל השכבות.
לאחר מכן, עם מרית סטרילית, להעביר 2.5 עד חמישה מיליליטר של רקמה ל 100 מילימטר גז ואקום פלזמה מטופלים צלחת רקמות. למדוד את נפח המדגם על ידי שפיכת לתוך צינור צנטריפוגה טרי. לאחר מכן, להוסיף נפח שווה ערך של מדיה תרבות רקמות לצלחת בעדינות מערבל את הצלחת כדי לערבב את התוכן.
הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזים פחמן דו חמצני עד מספר מספיק של תאים נראים על בסיס הצלחת. לאחר מספר מספיק של תאים הם ציינו על הצלחת או לאחר שבעה ימים, המוקדם מביניהם, להסיר את כל החלקים הנותרים של רקמה. לאחר מכן, תרבו את ה- ASCs במדיה של תרבות הרקמות עד שהם מגיעים ל- 70%confluency או עד שהאשכולות יהפכו צפופים ובנקודה זו יש לעבור בין התאים.
יש לשטוף בעדינות את הצלחת עם תמיסת מלח 1X פוספט. כדי לנסות את התאים חסידים, שאפו את מלוחים מאגר פוספט, להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין בתוספת 0.25% EDTA לכל צלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף כמות קטנה של מדיה לצלחת כדי לבטל את הפעלת טריפסין.
ואז בעדינות pipette טריפסין התקשורת מהחלק העליון של הצלחת כלפי מטה, אוותר על כל התאים המחוברים חלש מהצלחת. כדי לזרוע את התאים, הוסף תחילה מדיה לצלחת. לאחר מכן, מוסיפים את התאים בצורה dropwise ולאחר מכן מערבלים את הצלחת כדי להבטיח חלוקה שווה על פני הצלחת.
לאחר שלושה קטעים, המשיכו לזרום ציטומטריה ומסיונות התברואה. לאחר שלושה קטעים, ASCs מבודדים מדגימות lipoaspirate ו abdominoplasty נמצאו יש מורפולוגיה MSC פנוטיפ, בדומה ASCs מבודדים בעקבות עיכול אנזימטי. בדומה ל- MSCs אחרים, מחשבי ה- ASCs המבודדים של explant שליליים עבור CD45 וחיוביים עבור CD73, CD90 ו- CD105.
בעת טחון הרקמה, שטח הפנים של כל חתיכה חייב להיות גדול מספיק עבור ASCs לנדוד מתוך הרקמה. אלה הם תאי גזע בסיסיים שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של יישומים. ניתן להשתמש ב- ASCs המבודדים עבור כל יישום במורד הזרם, ב- vivo או במבחנה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע ממקור שומני (ASCs) מדגימות של כריתת עור בטן ושל שאיבת שומן באמצעות טכניקת שתיל (explant). גישה זו מזמינה למינימום את המניפולציה התאית, ובכך מבטיחה קבלת תאי גזע בעלי רלוונטיות קלינית המתאימים ליישומים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
- טכניקות לבידוד תאים
רקע
- שיטות מסורתיות לבידוד ASCs כוללות לעיתים קרובות אנזימים חזקים וסבוב ב centrifuge.
- שיטות אלו עלולות לשנות את הפנוטיפ וההתנהגות של התאים.
- שיטת האקספלאנט (explant method) מספקת חלופה עדינה יותר.
- הדגמות ויזואליות יכולות לסייע בהבנת תהליך הקיצוץ של הרקמה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה וחסכונית לבידוד ASCs.
- הפחתת הסיכון להיווצרות ארטיפקטים בתצפיות ניסיוניות הנגרמים משיטות בידוד אגרסיביות.
- הפקת ASCs בעלי רלוונטיות קלינית ליישומים טיפוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רקמת אבדומינופלסטי קצוצה תגודל בצלחת תרבית רקמות.
- התאים יודגרו בטמפרטורה של 37°C בסביבת CO2.
- לאחר צמיחת תאים מספקת, שאריות חתיכות הרקמה יוסרו.
- התאים יעברו מעבר (passaged) ויאופיינו לסמני תאי גזע.
תוצאות עיקריות
- ASCs מבודדים מראים מורפולוגיה ופנוטיפ דומים לאלו המתקבלים באמצעות עיכול אנזימטי.
- ASCs מבודדים בשיטת Explant הם שליליים ל-CD45 וחיוביים ל-CD73, CD90 ו-CD105.
- השיטה מניבה תאים שעברו פחות מניפולציות, מה שמעלה את המהימנות הניסויית.
- ניתן להשתמש ב-ASCs למגוון יישומים המשכיים, הן in vivo והן in vitro.
מסקנות
- שיטת האקספלנט (explant) מהווה חלופה יעילה לבידוד ASCs.
- טכניקה זו משמרת את מאפייני התאים טוב יותר מאשר שיטות מסורתיות.
- ל-ASCs מבודדים קיים פוטנציאל רחב למחקר וליישומים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת בידוד זו, שאינה עושה שימוש באנזימים, נותנת מענה לאתגר מרכזי ברפואה רגנרטיבית: השגת תאי גזע מזנכימליים רלוונטיים מבחינה קלינית ללא יצירת ארטיפקטים כתוצאה מעיבוד אנזימטי או מכני אגרסיבי. על ידי שימור הפנוטיפ והתפקוד הטבעיים של התאים, גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החזויה ביישומים המשכיים, כגון מידול מחלות ובדיקה טיפולית. השיטה תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים, שבהם הפחתת סיכונים ביולוגיים ותיקוף מטרות תלויים במקורות תאים אמינים שעברו מינימום מניפולציות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תאי גזע המופקים מרקמת שומן, תוך שימור הרב-פוטנציאליות (multipotency) ופרופילי סמני השטח.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בתוצאות הניסיוניות על ידי ביטול שינויים פנוטיפיים המושרים על ידי אנזימים.
- ערך חיזויי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הפקת תאים שעברו פחות מניפולציות עבור בדיקות תיקוף של מטרות (target validation assays).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תאי גזע נגזרים מרקמת שומן המתאימים לבדיקות in vitro סטנדרטיות הדורשות פנוטיפים מזנכימליים עקביים.
- ערך תפעולי: מקל על מוכנות הבדיקה באמצעות הרחבה מבוססת explant השומרת על ביטוי חיובי של CD73, CD90 ו-CD105.
- יכולת הרחבה: תומך בייצור תאים הניתן לשחזור עבור סריקת תרכובות ומחקרי מנגנונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק מקור תאים רלוונטי מבחינה קלינית התואם ליישומים של רפואה רגנרטיבית.
- מודל פרה-קליני: מאפשר הפקה של תאי גזע מהרקמה השומנית עבור מערכות רלוונטיות למחלה ללא חשיפה לאנזימים קסנוגניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחית חששות לגבי ארטיפקטים של הבידוד המשפיעים על הערכות התמיינות או תפקוד אימונו-מודולטורי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבידוד מוקדם של תאי גזע ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומכת בתהליכי עבודה שבהם לשלמות מקור התאים יש השפעה על מהימנות הנתונים ועל החלטות המשך (go/no-go).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי אספקת תאי גזע המופקים מרקמת שומן עם מורפולוגיה ופנוטיפ דמויי-טבע.
- סריקה: מספק תאים סטנדרטיים המוכנים להתרחבות עבור פלטפורמות בדיקה הדורשות מאפיינים של תאי סטרומה מזנכימליים.
- אנליטיקה: מאפשר ביצוע ציטומטריית זרימה ובדיקות דיפרנציאציה לאחר שלושה מעברים כדי לאשש את זהות תאי הגזע.
- מחקר תרגומי: מקשר בין בידוד התאים לפוטנציאל טיפולי באמצעות שימור תכונות תאיות בעלות רלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית נטולת אנזימים לייצור תאי גזע המופקים מרקמת שומן עבור פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מבידוד בניסויי תאי גזע.
- ערך תפעולי: מציע פרוטוקול פשוט וחסכוני ללא תלות באנזימים יקרים או בסבב צנטריפוגה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go באמצעות הגברת הביטחון בתוצאות של בדיקות מבוססות תאים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אספקת תאי גזע מזנכימליים אמינים להערכה פרה-קלינית.
שיקולי יישום
- דורש טכניקה אספטית וציוד בסיסי לתרביות רקמה לצורך קיצוץ מכני ותרבית אקספלנטים.
- תלוי בשימוש במכשירים סטריליים, כולל סקלפלים, מחטים ושפכדלים להכנת הרקמה.
- מחייב תנאי אינקובציה סטנדרטיים ב-37°C עם 5% CO2 לצמיחה אופטימלית של תאים.
- כולל מעבר תאים (passaging) ידני בהתבסס על רמת התרבויות (confluency) או צפיפות הצברים לאחר הסרת הרקמה הראשונית.
- מתבסס על ציטומטריה של זרימה ובדיקות דיפרנציאציה לאישור הפנוטיפ לאחר הבידוד.
